Name: Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Poznaj metodę HPLC z detekcją refraktometryczną i spektrometrią mas do profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie. Ta technika umożliwia ilościową analizę reakcji metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było sponsorowane przez Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, jako część Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725. Niniejszy manuskrypt został napisany przez UT-Battelle, LLC na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom do celów Rządu Stanów Zjednoczonych. Departament Energii zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

<ol><li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering%3A+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li>
<li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biochemistry%3A+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li>
<li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li>
<li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003(2019).</li>
<li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li>
<li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2%2C3-butanediol%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li>
<li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li>
<li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162(2021).</li>
<li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+cell-free+extract+reaction+%28CFER%29+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Energy+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72(2020).</li>
<li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoskun%2C+O+%22Separation+Tecniques%3A+Chromatography%22">Separation Tecniques: Chromatography</a>. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).</li>
<li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC%2FRID+in+sugarcane+vinasse%3A+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li>
<li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li>
<li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li>
<li>Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+cell-free+systems%3A+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li>
<li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS%2FMS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+-+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li>
<li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAsensio-Ramos%2C+M+%22Liquid+Chromatography%3A+Fundamentals+and+Instrumentation%3A+Second+Edition%22">Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition</a>. 1, 637-695 (2017).</li>
<li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li>
<li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li>
<li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unimod%3A+Protein+modifications+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li>
<li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li>
<li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000(2017).</li>
<li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li>
<li>Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3%5B2H%5D-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li>
<li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsoSearch%3A+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS%2FMS+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani inne konflikty interesów.

Przedstawione podejście HPLC-RID może być wykorzystane do pomyślnego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych i późniejszej konwersji do głównych kwasów organicznych i produktów alkoholowych centralnego metabolizmu lizatu w czasie. Co więcej, protokół ten wykorzystuje prostą metodę izokratyczną wykorzystującą pojedynczą fazę ruchomą, wymaga minimalnego przygotowania próbki i umożliwia prostą, ukierunkowaną analizę na dalszym etapie. Anality mierzone metodą HPLC-RID wyróżniają się wyłącznie czasem retencji, a co za tym idzie oddziaływaniami z wybraną żywicą kolumnową. Zastosowana tutaj kolumna HPLC została specjalnie zaprojektowana do oddzielania węglowodanów, kwasów organicznych i alkoholi poprzez połączenie wykluczenia wielkości i wymiany ligandów (tj. chromatografii partycji moderowanej jonami). Opisana metoda jest zatem przydatna do bardziej ukierunkowanej analizy substratów węglowodanowych i wybranych produktów końcowych szlaków fermentacji glukozy, które mają przede wszystkim ułatwić i zenergetyzować biotransformacje oparte na lizacie 8,15,21. Jednak protokół ten nie uwzględnia aktywacji innych szlaków metabolicznych w ekstraktach komórkowych. Rurociągi wykorzystujące inne techniki rozdzielania chromatograficznego (tj. chromatografię oddziaływań hydrofilowych), metody elucji gradientowej, bardziej skomplikowane przygotowanie próbki (tj. derywatyzacja) i różne detektory optyczne (np. detektory rozpraszania światła ultrafioletowego lub światła wyparnego) mogą być stosowane do wykrywania innych metabolitów, takich jak aminokwasy i fosforany cukru23,24. Alternatywnie, globalne podejście do badania metabolizmu lizatu można przyjąć przy użyciu LC-MS/MS.
Opisana metoda LC-MS/MS to pojedynczy proces pomiaru i identyfikacji szerszego zakresu metabolitów. LC-MS/MS jest najnowocześniejszym narzędziem analitycznym do profilowania metabolomu ze względu na swoją czułość i zdolność do rozróżniania metabolitów na podstawie czasu retencji i współczynników m/z z wysoką rozdzielczością16. Koncentrując się na centralnych szlakach metabolicznych węgla i anabolizmie aminokwasów, wdrożono tryb ujemny MS/MS w celu specyficznego wykrywania polarnych kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. W połączeniu z techniką chromatografii nanocieczowej, metoda ta zapewnia wysoką czułość wykrywania małych cząsteczek w złożonym tle lizatu17. Jeśli jednak chodzi o profilowanie metabolizmu CFME opartego na lizatach, ograniczeniem opisanego protokołu LC-MS/MS jest jego dolna granica wykrywalności wynosząca 50 m/z, co wyklucza pomiar etanolu, głównego produktu metabolizmu glukozy w lizacie, a także mrówczanu, które w przeciwnym razie można łatwo określić ilościowo za pomocą szczegółowej metody HPLC-RID. W porównaniu z LC-MS/MS, HPLC-RID ma dodatkową zaletę w postaci względnej dostępności pod względem kosztów i trudności. Do tego ostatniego punktu, rozwiązywanie problemów z opisaną tutaj metodą LC-MS/MS może wymagać pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej w zakresie spektrometrii mas. Niemniej jednak, wykrywanie stwardnienia rozsianego ma wyjątkowo atrakcyjne zastosowania w porównaniu z RID, ponieważ może dodatkowo rozróżniać znakowane izotopy w metabolomach, co jest doskonałą techniką zrozumienia ruchu węgla z uzupełnionych substratów przez złożoną sieć metaboliczną lizatu18. Takie podejście zastosowano w tym przypadku poprzez uzupełnienie reakcji 13C6-glukozą i analizę względnych wartości obfitości dalszych metabolitów zawierających 13C. Analiza pozwoliła na zdefiniowanie aktywnych i nieaktywnych szlaków, wspierając wcześniej zgłoszone założenia i dostarczając nowych informacji na temat przepływu metabolicznego w lizatach. W ramach metody można również wprowadzać modyfikacje dla konkretnych analiz. Na przykład roztwory wzorcowe 13związków docelowych znakowanych znakiem C można analizować wraz z próbkami, aby uzyskać bezwzględne pomiary ilościowe cząsteczek pochodzących z glukozy w czasie i wyciągnąć wnioski na temat rozkładu strumienia. Lepsze wykrywanie dodatnio naładowanych związków można również włączyć w ramach bieżącego przepływu pracy, uruchamiając sekwencje z plikami .meth dostosowanymi do wykrywania w trybie dodatnim.
Pobieranie próbek analitycznych w obu opisanych metodach jest wygodnie zautomatyzowane, co zapewnia wysoką odtwarzalność. Co więcej, można oczekiwać płynnych przebiegów analitycznych, o ile przestrzegane są właściwe praktyki obsługi i konserwacji instrumentów. Korzystając z tych narzędzi do analizy reakcji CFME, należy wziąć pod uwagę bardziej krytyczne kwestie przed i po pobraniu próbki. Podczas przygotowywania próbki ważne jest, aby kontrole przebiegu w czasie były reprezentatywne dla czasu zerowego. W tym przypadku białka zostały wytrącone w lizatach przez zakwaszenie w celu zatrzymania reakcji metabolicznych. W przypadku próbek o czasie zerowym rozpuszczalnik kwasowy połączono z lizatem przed dodaniem mieszaniny reakcyjnej zawierającej glukozę. Zakwaszenie kwasem trójchlorooctowym skutecznie zapewniło, że glukoza nie jest metabolizowana w czasie zero, jak pokazano w danych HPLC-RID (ryc. 2). Podczas gdy podobną procedurę wygaszania metabolizmu glukozy przeprowadzono w zgłoszonej analizie LC-MS/MS, wykryto 13metabolitów znakowanych C w próbkach z czasem zerowy, aczkolwiek przy znacznie niskich wartościach liczebności w stosunku do próbek wyekstrahowanych w późniejszych punktach czasowych. Co więcej, obserwacje te ograniczały się do produktów pośrednich glikolizy. Dane sugerują, że reakcje zachowują pewien stopień aktywności glikolitycznej po zakwaszeniu rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, który jest wykrywany za pomocą tej bardzo czułej metody. Zakres tej działalności powinien jednak zostać określony ilościowo. Poprzednie badanie wykazało, że kwaśne rozpuszczalniki ekstrakcyjne mogą nie wygaszać w wystarczającym stopniu pośrednich reakcji glikolitowych, ale mogą zatrzymać znaczne zużycie glukozy10. Chociaż pozostaje to do dalszego zbadania w zastosowanym tutaj systemie, drastyczne zmiany w względnych wartościach obfitości między próbkami o czasie zerowym a późniejszymi punktami czasowymi mogą być interpretowane jako trendy w metabolizmie glukozy. W podobnych zastosowaniach zaleca się jednak zbadanie alternatywnych metod hartowania, w szczególności w celu uzyskania bezwzględnych ilości pośrednich produktów metabolicznych10. Ponadto należy również przestrzegać dobrych praktyk podczas dalszych analiz oprogramowania. Spójność jest niezbędna podczas ręcznej integracji obszarów szczytowych z sygnałów RID w celu zmniejszenia błędu ludzkiego. Ręczna integracja powinna być również stosowana do obszarów pików wzorców w każdym przypadku, gdy ręcznie zintegrowane obszary pików są wykorzystywane do ilościowego określania stężeń metabolitów w próbkach. W trakcie ukierunkowanej analizy LC-MS/MS wstępne adnotacje z analizy MZmine powinny być walidowane poprzez ręczne sprawdzanie pików za pomocą przeglądarki jakości MS, a cechy m/z powinny być opisywane tylko wtedy, gdy obliczone błędy masy są dopuszczalne. W tym przypadku analizy te zostały przeprowadzone ręcznie dla ograniczonego zestawu celów, ponieważ kompleksowe i solidne oprogramowanie do wyszukiwania izotopów nie jest jeszcze stworzone. Jednak obecnie pojawiają się takie zautomatyzowane metody wyszukiwania metabolitów znakowanych izotopem węgla 13C, które usprawniłyby również bardziej skomplikowane analizy, takie jak profilowanie lizatów poza centralnym metabolizmem węgla25.
Zaawansowana chromatografia cieczowa jest solidną i szeroko stosowaną metodą rozdzielania małych cząsteczek w złożonych mieszaninach metabolicznych11. Opisane metody łączą tę technikę separacji z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas, aby skutecznie analizować konwersje metabolitów w reakcjach CFME opartych na lizatach. HPLC-RID i LC-MS/MS są indywidualnie potężnymi narzędziami do profilowania aktywnego metabolizmu lizatów, a ich komplementarność może być dodatkowo wykorzystana do rozwiązania nieodłącznych ograniczeń każdej techniki. Przedstawione metody umożliwiają zastosowanie i rozwój CFME, ponieważ można je wykorzystać do zrozumienia metabolizmu lizatu, monitorowania ulepszeń w docelowych konwersjach metabolitów oraz wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu.

Ograniczenia w inżynierii mikrobów do produkcji chemicznej można rozwiązać poprzez rekapitulację reakcji biochemicznych in vitro, w których nie występują konkurencyjne funkcje przetrwania komórek1. Co więcej, otwarte środowisko reakcji (tj. brak błony komórkowej) jest bardziej podatne na manipulacje i łatwiejsze do monitorowania w porównaniu z żywymi komórkami. Ta fundamentalna koncepcja bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) została elegancko zademonstrowana przez odtworzenie szlaków metabolicznych w celu syntezy cennych substancji chemicznych, takich jak wodór i monoterpeny, o wskaźnikach produkcji, które są o rzędy wielkości wyższe niż prezentowane do tej pory w fabrykach komórek mikrobiologicznych1,2,3. Metody oczyszczania całych ścieżek są jednak obecnie ograniczone czasem i kosztami. Alternatywnie, bezkomórkowe systemy metaboliczne mogą być uzyskane z surowych ekstraktów komórkowych za pomocą szybkich i niedrogich metod związanych z rekonstytucją całego szlaku4. Centralny metabolizm, który jest zatrzymywany w ekstraktach komórkowych, może być uzupełniony substratami energetycznymi (np. glukozą i kofaktorami enzymatycznymi) oraz solami w roztworach buforowych w celu wytworzenia centralnych prekursorów metabolicznych przez ponad 24 h5,6. Dodanie egzogennych enzymów do reakcji CFME opartej na lizacie pozwala na bardziej złożone biotransformacje glukozy w bardziej wartościowe substancje chemiczne przy wysokich mianach4,6,7. Chociaż wydajność w tych systemach jest zwykle zagrożona ze względu na ich komórkową złożoność metaboliczną, opracowywane są i są opracowywane unikalne metody selekcji proteomów lizatu w celu uzyskania wyższej wydajności7,8.
Łatwość przeprowadzania przemian metabolicznych w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie sprawia, że te platformy są doskonałe zarówno do całkowitego przeniesienia produkcji chemicznej poza komórkę, jak i do prototypowania nowych ścieżek o wysokiej przepustowości przed zbudowaniem i przetestowaniem tych projektów in vivo2,9. W obu przypadkach narzędzia do monitorowania przemian metabolicznych lub obserwacji ogólnych zmian w strumieniu metabolicznym w lizatach są integralną częścią rozwoju CFME. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może być stosowana do rozdzielania składników chemicznych reakcji CFME z wysoką rozdzielczością i może być sprzężona z detektorami optycznymi lub spektrometrycznymi mas w celu ilościowej identyfikacji metabolitów5,10. Podstawową zasadą HPLC jest to, że anality rozpuszczone w rozpuszczalniku (tj. Faza ruchoma) i przepompowane przez kolumnę będą oddziaływać z określonym materiałem wypełniającym kolumnę (tj. Faza stacjonarna)11. W zależności od ich właściwości chemicznych, anality te wykazują różne czasy retencji, zanim ostatecznie zostaną wymyte z fazy stacjonarnej i przeniesione przez fazę ruchomą do detektora. Niniejszy raport zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania i analizy reakcji CFME opartych na lizacie E. coli za pomocą metod opartych na HPLC wykorzystujących wykrywanie RID i MS/MS.
HPLC sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji (HPLC-RID) jest ogólnie dostępną metodą szybkiej identyfikacji centralnych prekursorów metabolicznych i produktów końcowych. Krótko mówiąc, RID mierzy, w jaki sposób anality zmieniają ugięcie światła przez fazę ruchomą12. Sygnały RID odpowiadające docelowym analitom w próbkach można następnie określić ilościowo poprzez porównanie z sygnałami RID roztworów wzorcowych. W zastosowaniach CFME ten tryb wykrywania był najczęściej stosowany z kolumnami HPLC, które rozdzielają związki w oparciu o kombinację mechanizmów wykluczania wielkości i wymiany ligandów lub chromatografii partycji moderowanej jonami5,6,8,13. Ta konkretna technika jest używana do szybkiego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych, takich jak glukoza, a także tworzenia produktów fermentacji, takich jak bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol w reakcjach CFME na bazie lizatu8. Rejestrowanie zmian stężeń tych związków za pomocą HPLC było przydatne zarówno do wyjaśnienia potencjału surowych ekstraktów komórkowych w celu łączenia centralnych prekursorów metabolicznych, jak i zrozumienia, w jaki sposób strumień szlaku jest przekierowywany przez szlaki fermentacyjne podczas złożonych przemian metabolicznych z glukozy w lizatach6,8,14. Przełomowe badania CFME nad ekstraktami z komórek E. coli potwierdzają, że związki fermentacyjne kumulują się jako produkty końcowe katabolizmu glukozy, a także występują jako niepożądane produkty uboczne w lizatach, które nadmiernie eksprymują enzymy egzogenne6,15. Sugeruje się, że metabolizm fermentacyjny odgrywa niezbędną rolę w regeneracji ekwiwalentów redoks kofaktorów (tj. NAD(P)H i ATP) w celu podtrzymania reakcji glikolitycznych8. W związku z tym metoda detekcji optycznej oparta na HPLC, przeznaczona do oddzielania produktów fermentacji, jest użytecznym i powszechnie stosowanym narzędziem podczas wykonywania różnych zadań CFME opartych na lizacie.
CFME może być zaimplementowane do gromadzenia końcowych produktów przemiany materii, które nie są węglowodanami, kwasami organicznymi ani alkoholami4. Pożądany może być również pomiar produktów pośrednich, które są spożywane tak szybko, jak są syntetyzowane10. Chociaż metoda HPLC-RID jest dostępna pod względem kosztów i trudności, metoda ta jest ograniczona ze względu na jej zdolność do rozróżniania metabolitów wyłącznie na podstawie czasu retencji. Szerszy zakres metabolitów może być analizowany, gdy chromatografia cieczowa jest sprzężona z detekcją MS/MS (LC-MS/MS)16. Dzięki tej metodzie anality w fazie ruchomej są jonizowane i wykrywane w różny sposób w oparciu o właściwości masy i ładunku każdej cząsteczki. Wiedza zarówno na temat stosunku masy metabolitu do ładunku (m/z), jak i czasu retencji na kolumnie, ułatwia zatem oddzielenie większości produktów przemiany materii i produktów końcowych o wysokiej rozdzielczości16. Ta technika wykrywania może być również sprzężona z chromatografią nanocieczową, która zapewnia znacznie niższe prędkości przepływu i objętości wtryskiwanej próbki, umożliwiając bardziej czułe wykrywanie małych cząsteczek w złożonym tle17. LC-MS/MS może być dodatkowo stosowany z etykietowaniem izotopowym, ponieważ wbudowane etykiety wprowadzają zmiany w wartościach m/z analitów<klasa sup="xref">18. Pomiary punktów czasowych wyekstrahowane z reakcji CFME uzupełnionej substratem 13C6-glukozy mogą zatem określić produkty końcowe lub uboczne pochodzące specjalnie z uzupełnionej glukozy. Chociaż ta metoda śledzenia izotopów nie jest jeszcze powszechnie stosowana w badaniach CFME, jest potężnym narzędziem do zrozumienia przemian metabolicznych w systemach CFME opartych na lizatach, szczególnie dlatego, że przeciwjony soli (tj. octan i glutaminian) w tych reakcjach są również katabolizowane jako substraty wtórne19. Wykorzystanie tej techniki może zatem nakreślić kompleksowy obraz metabolizmu glukozy w lizatach, który do dziś nie jest w pełni zrozumiały. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje metodę chromatografii nanocieczowej sprzężonej z jonizacją nanoelektronoprysku (nano ESI) MS/MS, która może być wykorzystana do zbadania możliwego modelu metabolizmu glukozy, w szczególności w lizatach E. coli (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). Model opiera się na doniesieniach o szlakach fermentacyjnych i szlaku pentozofosforanowym aktywnym w lizatach E. coli pochodzących ze szczepów hodowanych w bogatych mediach5,6,8,14. Technika ta jest dodatkowo wykorzystywana do badania produkcji aminokwasów, ponieważ obecna wiedza na temat anabolizmu aminokwasów z glukozy w lizatach ogranicza się do kilku przykładów, takich jak synteza aminokwasów aromatycznych7. Biorąc pod uwagę głównie polarny charakter produktów końcowych i produktów pośrednich w tych szlakach (tj. kwasów organicznych, fosforanów cukrowych i aminokwasów), zastosowano tutaj chromatografię cieczową z odwróconymi fazami. Technika ta oddziela związki polarne przez elucję od niepolarnej fazy stacjonarnej. Związki te zostały następnie zjonizowane przez nano ESI w trybie jonów ujemnych, co pozwala na wykrycie analitów z co najmniej jednym ujemnym ładunkiem elementarnym, a tym samym jest przydatne do wykrywania związków kwaśnych. Technika ta jest tutaj stosowana do analizy metabolitów zawierających 13C pochodzących z glukozy i demonstruje użyteczność LC-MS / MS do zrozumienia metabolizmu glukozy w lizatach.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m Filtry probówkowe wirówkowe (kolumny wirowe)</td><td>Corning Costar</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki mikrowirówkowe</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Binary LC</td><td>System Agilent</td><td>G1312B</td><td>HPLC-RID</td></tr><tr><td>1260 Wysokowydajny odgazowywacz Infinity</td><td>System Agilent</td><td>G4225A</td><td>System HPLC-RID</td></tr><tr><td>1260 Detektor nieskończoności indeksu refrakcji</td><td>Agilent</td><td>G7162A</td><td>System HPLC-RID</td></tr><tr><td>1260 Infinity Standardowy automatyczny podajnik próbek</td><td>Agilent</td><td>G1329B</td><td>System HPLC-RID</td></tr><tr><td>13C6-glukoza</td><td></td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej Sigma-Aldrich 389374 CPM (LC-MS/MS)</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 0,20 &mu; m filtr porowy (membrana PES)</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (klasa LC/MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td>Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME</td></tr><tr><td>Kolumna Aminex HPX 87-H</td><td>Bio-rad</td><td>1250140</td><td>Kolumna chromatograficzna do HPLC-RID</td></tr><tr><td>Octan amonu (klasa LC/MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td>Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Glutaminian amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1376</td><td>CFME Składnik mieszanki reakcyjnej</td></tr><tr><td>Nasadki na fiolki automatycznego podajnika próbek (żółte, zatrzask)</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-50Y</td><td>Przechowywanie/dostarczanie próbek do</td></tr><tr><td>fiolek z automatycznym samplerem LC-MS/MS (0,30 ml, polipropylen)</td><td>Wheaton</td><td>W225181</td><td>Przechowywanie/dostarczanie próbek do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Mikrowirówka laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME</td></tr><tr><td>Koenzym A (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME</td></tr><tr><td>D-dekstroza (glukoza)</td><td>VWR</td><td>BDH9230</td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME</td></tr><tr><td>Fosforan dipotasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu krzywej wzorcowej (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa LC/MS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85178</td><td>Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Topiona krzemionka (średnica wewnętrzna 100 &mu; m, średnica zewnętrzna 375 &mu; m)</td> <td>Polymicro Technologies</td><td>WM22005-ND</td><td>Kolumna chromatograficzna do LC-MS / MS</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>S30 składnik buforowy</td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa LC / MS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td>Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS</td></tr><tr><td>Kinetex 5 i mu; m C18 faza stacjonarna (100 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td>N/A; na specjalne zamówienie</td><td>Kolumna chromatograficzna do spektrometru mas LC-MS/MS</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A; na specjalne zamówienie</td><td>Spektrometr masowy do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Octan magnezu Składnik buforowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>S30</td></tr><tr><td>Glutaminian magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>CFME</td></tr><tr><td>Metanol (klasa LC / MS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td>Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0632</td><td>Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME</td></tr><tr><td>Źródło jonizacji Nanospray Źródło ThermoFisher</td><td>Scientific/Proxeon</td><td>ES071 (najnowszy model)</td><td>Spektrometr masowy do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>OpenLab CDS (online) Oprogramowanie</td><td>Agilent</td><td>Wersja 2.15.26</td><td>System danych chromatograficznych do pozyskiwania i analizy danych HPLC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus</td><td>Thermo</td><td>Version 2.7</td><td>Oprogramowanie do strojenia systemu LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Octan potasu</td> Składnik buforowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>S30</td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>CFME Składnik mieszaniny reakcyjnej</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5415 C</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętki (z przegrodą, 9 mm)</td><td>Supelco</td><td>29315-U</td><td>Przechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID</td></tr><tr><td>Fiolki ze szkła gwintowanego (2 ml)</td><td>Supelco</td><td>29376-U</td><td>Przechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245</td><td>Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Mrówczan</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>247596</td><td>Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Mleczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71716</td><td>Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td>Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>Preparat rozpuszczalnikowy do HPLC-RID</td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris-octan</td><td>GoldBio</td><td>T-090-100</td><td>S30 składnik buforowy</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 LC z autosamplerem</td> Stojak na rozpuszczalnik <td>Ionex</td><td>: SRD-3600</td><td>System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 LC z automatycznym podajnikiem próbek</td><td>Dionex</td><td>Rapid Separation Pompa binarna: HPG-3400RS</td><td>System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 LC z autosamplerem</td><td>Automatyczny podajnik próbek płytek Dionex do szybkiej separacji: WPS-3000TRS</td><td>System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS / MS</td><td></td></tr><tr><td>(klasa LC / MS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>W6500</td><td>Przygotowanie rozpuszczalnika do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td></td><td>Thermo Wersja 3.0.63</td><td>Oprogramowanie do akwizycji i interpretacji danych dla LC-MS/MS</td></tr></tbody></table>

chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Inżynieria metabolizmu komórkowego dla ukierunkowanej biosyntezy może wymagać rozległych cykli projektowania, budowania, testowania i uczenia się (DBTL), ponieważ inżynier pracuje nad wymaganiami dotyczącymi przetrwania komórki. Alternatywnie, przeprowadzanie cykli DBTL w środowiskach bezkomórkowych może przyspieszyć ten proces i złagodzić obawy związane z kompatybilnością hosta. Obiecujące podejście do bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) wykorzystuje metabolicznie aktywne surowe ekstrakty komórkowe jako platformy do bioprodukcji oraz szybkiego odkrywania i prototypowania zmodyfikowanych białek i szlaków. Wykorzystanie tych możliwości i optymalizacja wydajności CFME wymaga metod charakteryzujących metabolom platform bezkomórkowych opartych na lizacie. Oznacza to, że narzędzia analityczne są niezbędne do monitorowania poprawy w zakresie ukierunkowanych konwersji metabolitów oraz do wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu. W tym przypadku zastosowano analizy metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w połączeniu z detekcją optyczną lub spektrometryczną mas w celu scharakteryzowania produkcji i przepływu metabolitów w lizatach E. coli S30. W szczególności raport ten opisuje przygotowanie próbek z lizatów CFME do analiz HPLC z wykorzystaniem wykrywania indeksu refrakcji (RID) w celu ilościowego określenia wytwarzania centralnych produktów pośrednich przemiany materii i produktów ubocznych w procesie konwersji tanich substratów (tj. glukozy) do różnych produktów o wysokiej wartości. Przedstawiono również analizę konwersji metabolitów w reakcjach CFME podawanych glukozą znakowaną 13C za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (MS/MS), która jest potężnym narzędziem do charakteryzowania określonych wydajności metabolitów i strumienia metabolicznego lizatu z materiałów wyjściowych. Zastosowanie tych metod analitycznych do metabolizmu lizatu CFME umożliwia rozwój tych systemów jako alternatywnych platform do wykonywania szybszych lub nowatorskich zadań inżynierii metabolicznej.

Aby ilościowo określić bezkomórkową syntezę powszechnych produktów fermentacji z glukozy w układzie opartym na lizatach, lizaty otrzymane ze szczepów hodowanych w pożywce 2xYPTG zasilano 100 µM glukozy jako głównym źródłem węgla8. Reakcje zatrzymywano w ciągu 24 h poprzez zakwaszenie białek. Przefiltrowane naddatki zawierające pirogronian, bursztynian, mleczan, mronian, octan i etanol powstałe w wyniku katabolizmu glukozy naniesiono na moduł autoprobownika systemu HPLC wyposażonego w detektor RID. Jako standardy do urządzenia wprowadzono fiolki z przefiltrowanymi mieszaninami produktów końcowych fermentacji oraz glukozą w stężeniach 1,17 µM, 2,34 µM, 4,69 µM, 9,38 µM, 18,75 µM, 37,50 µM, 75 µM i 150 µM w buforze S30. Anality eluowano izokratycznie z kolumny HPLC do detektora RID. Detektorem RID udało się rozdzielić piki glukozy, bursztynianu, mleczanu, mronianu, octanu i etanolu w zakresie od 1 do 150 µM. Powierzchnie pików dla glukozy wyznaczono poprzez manualną integrację danych z RID dla próbek z przebiegu czasowego oraz próbek krzywej wzorcowej. Powierzchnie pików dla bursztynianu, mleczanu, mronianu, octanu i etanolu pobrano z sygnałów zintegrowanych automatycznie. Wszystkie krzywe wzorcowe (powierzchnia piku względem znanego stężenia) miały wartości R2 &gt;0,99 i były liniowe w całym zastosowanym zakresie stężeń.
Stężenia molowe wszystkich analizowanych substancji obliczono na podstawie odpowiednich krzywych wzorcowych. Glukoza została zużyta w ciągu pierwszych 3 h reakcji i uległa głównie fermentacji do mleczanu (Rysunek 2A,B). Akumulacja etanolu również wystąpiła w znacznym stopniu w ciągu pierwszych 3 h reakcji, a następnie ustała (Rysunek 2C). Obserwacja znacznej produkcji mleczanu i etanolu przy jednoczesnym znacznym zużyciu glukozy po 3 h nie była bezprecedensowa, ponieważ szlaki produkcji mleczanu i etanolu umożliwiają regenerację 1 mola netto NAD+ z glikolitycznego NADH, który jest niezbędny do dalszego zużycia glukozy w procesie glikolizy (Rysunek 1). Mleczan i etanol można zatem uznać za główne produkty końcowe fermentacji w bezkomórkowym metabolizmie glukozy opartym na lizatach. Octan był obecny w reakcjach początkowo jako składnik buforu S30 i niespodziewanie zaczął kumulować się w wyniku metabolizmu dopiero po 6 h, gdy zużycie glukozy spowolniło (Rysunek 2D). Wynik ten sugeruje, że fermentacja octanowa niekoniecznie umożliwia szybki strumień glikolityczny we wcześniejszych punktach czasowych. Jednocześnie mrówczan i bursztynian były syntetyzowane jako drugorzędne produkty fermentacji (Rysunek 2E,F). Podsumowując, opisana metoda umożliwiła bezwzględną kwantyfikację wyczerpania substratu cukrowego oraz tworzenia produktów fermentacyjnych w lizatach S30 E. coli.
Zastosowano detekcję metodą MS w celu specyficznego profilowania metabolizmu glukozy w lizacie. Lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych w podłożu 2xYPTG zasilano glukozą 13C6 jako źródłem węgla. Reakcje CFME przeprowadzano w trzech powtórzeniach dla punktów czasowych 0 h, 1 h, 2 h i 3 h. Próbki z każdego punktu czasowego wprowadzono do systemu LC wyposażonego w kolumnę w odwróconej fazie, połączonego z masowym spektrometrem transformaty Fouriera i pułapką jonową. Uzyskano widma w trybie jonów negatywnych, które następnie poddano obróbce w celu analizy kwasów organicznych, fosforanów cukrów oraz aminokwasów. Wyszukiwano obliczone teoretyczne masy gatunków znakowanych 13C należących do centralnego metabolizmu węgla, aby zidentyfikować związki pochodzące specyficznie z glukozy. Na podstawie wykorzystanych warunków hodowli szczepu wyjściowego oraz wcześniejszych doniesień o aktywnych szlakach w CFME E. coli , przyjęto, że proteom lizatu obejmuje sieć metaboliczną, która kieruje glukozę do fermentacji glikolitycznej, szlaku pentoz fosforanowych, a być może również do anabolizmu aminokwasów5,6,7,8,14 (Rysunek 1). W związku z tym zakres wyszukiwania ograniczono do składników tych szlaków, z których jednoznacznie zidentyfikowano 16 metabolitów zawierających znaki 13C pochodzące z glukozy (Tabela uzupełniająca 1).
13C6zaobserwowano zużycie glukozy w procesie glikolizy, o czym świadczyły wahania zawartości produktów pośrednich glikolizy (Rysunek 3A-E). Zgodnie z danymi z HPLC-RID, poziom glukozy wzrósł do 13C3-mleczanu, a także uległ fermentacji do 13C3-bursztynian w ciągu pierwszych 3 h reakcji (Rysunek 4A,B). Powstawanie 13C3izotopolog bursztynianu potwierdza proponowany model metabolizmu glukozy w lizacie (Rysunek 1), gdzie bursztynian jest prawdopodobnie generowany w wyniku karboksylacji 3-węglowej cząsteczki fosfoenolopirogronianu (PEP), a nie w wyniku włączenia 2-węglowej cząsteczki acetylo-CoA do cyklu TCA. W poprzednich badaniach nad CFME zakładano aktywację cyklu TCA, jednak inne 13Nie wykryto tutaj znakowanych C produktów pośrednich cyklu TCA.8,19,21. 13C3– synteza aspartanu nastąpiła jednak w ciągu pierwszej godziny, po czym został on zużyty, co potwierdza tezę, że PEP jest bezpośrednio przekształcany w szczawiooctan (Rysunek 1, Rycina 6C). Dane odzwierciedlają proteom lizatu z szczepów źródłowych pozyskanych podczas wzrostu fermentacyjnego na mediach bogatych w glukozę (2xYPTG). Sugerowałoby to ponadto, że pozostałe enzymy cyklu TCA, nieuczestniczące w produkcji bursztynianu, tworzą utleniającą gałąź cyklu TCA (Rysunek 1). Żadnego z metabolitów w tej ścieżce nie wykryto, co może wynikać z faktu, że wysokie stężenia glutaminianu dodanego do reakcji CFME jako przeciwjon soli hamują przebieg tej gałęzi. 
Dane HPLC-RID są dodatkowo uzupełnione o brak detekcji 13C2-octanu w 3-godzinnym przedziale czasowym reakcji, co sugeruje brak gromadzenia się octanu z glukozy do 3 h (Rysunek 2B). Jednakże bezpośredni prekursor octanu, acetylofosforan (acetyl-P), uległ akumulacji, co sugeruje, że ramię Pta szlaku Pta-AckA odpowiedzialne za syntezę octanu z acetylo-CoA jest aktywne (Rysunek 4C,D). Dephosphorylation 13C2-acetyl-P do 13C2-octanu katalizowana przez AckA prawdopodobnie nie zachodzi w tym przedziale czasowym, ponieważ octan jest głównym składnikiem buforu S30 stosowanego w reakcjach (Rysunek 1, Rysunek 2B).
Zaobserwowano również wbudowywanie węgli pochodzących z 13C6-glukozy do fosforanów cukrów: 6-fosfoglukonolaktonu (6PGL), 6-fosfoglukonianu (6PG), rybulozofosforanu-5 (Ru5P) oraz sedoheptulozofosforanu-7 (S7P) (Rysunek 5). Wyniki te potwierdzają udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie glukozy w lizacie i prawdopodobnie zasila on syntezę 13C9-tyrozyny, co sugerowało wcześniej badanie proteomiczne, zapewniając jednocześnie prekursor do produkcji 13C5-histydyny (Rysunek 6A,B)7. Nie zaobserwowano tutaj znakowanej fenyloalaniny ani tryptofanu, ani większości aminokwasów egzogennych. Nie jest to jednak całkowicie zaskakujące, ponieważ anabolizm aminokwasów jest prawdopodobnie wzmocniony w lizatach pochodzących z komórek hodowanych w warunkach głodowych lub w fazie stacjonarnej7,22. Co więcej, dotychczasowe dane sugerują, że produkty pośrednie glikolizy i fermentacji są kierowane do końcowych reakcji regeneracji kofaktorów, co musi wykluczać syntezę wielu aminokwasów pochodnych gliceraldehydu-3-fosforanu, pirogronianu i acetylo-CoA (tj. glicyny, cysteiny, seryny, alaniny, waliny, leucyny i lizyny) (Rysunek 1). Jak wspomniano, 13C3-asparaginian został wytworzony w ciągu pierwszej godziny, natomiast nie zaobserwowano aminokwasów pochodnych asparaginianu z wbudowanym 13C (tj. treoniny, izoleucyny, metioniny i asparaginy), co prawdopodobnie wynika z faktu, że asparaginian pochodzący z glukozy uczestniczy w fermentacji (Rysunek 1, Rysunek 6C). Na koniec, strumień w kierunku znakowanego glutaminianu i aminokwasów pochodnych glutaminianu mógł zostać zahamowany przez wysokie poziomy glutaminianu w środowisku reakcyjnym (Rysunek 1).
<img alt="Schemat szlaku metabolicznego pokazujący powiązania między glikolizą, PPP, fermentacją i cyklem TCA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przypuszczalny model metaboliczny lizatów pochodzących z E. coli BL21DE3-Star rosnących wykładniczo w wysokich stężeniach glukozy. W oparciu o CFME w lizatach zgłoszono obecność produktów pośrednich i końcowych glikolizy (zielony), szlaku pentozofosforanowego (ciemnopomarańczowy) oraz szlaków fermentacyjnych (niebieski) z acetylo-CoA. Obecność fermentacji bursztynianowej wskazuje na aktywację oksydacyjnej gałęzi cyklu TCA (szary). Anabolizm aminokwasów (złoty) w lizatach nie jest dobrze zdefiniowany i zostaje tutaj zbadany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zmiany stężenia metabolitów w czasie; metabolizm glukozy; sześć wykresów słupkowych; analiza biochemiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Dane HPLC-RID dla zużycia glukozy i syntezy końcowych produktów fermentacji w reakcjach CFME przygotowanych z ekstraktów surowych E. coli . (A) Zużycie glukozy oraz produkcja (B) mleczanu, (C) etanolu, (D) octanu, (E) mronianu i (F) bursztynianu w reakcjach CFME była monitorowana przez 24 h. Przedstawiono średnie stężenia w mM oraz słupki błędów (SE) wyznaczone na podstawie krzywych wzorcowych (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres przedstawiający pole powierzchni piku metabolitów znakowanych izotopowo (^13C) w czasie; dane z analizy metabolicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Trendy zmian w czasie dla 13C6-glukozy i znakowanych 13C produktów pośrednich glikolizy w lizacie E. coli CFME. Względna zawartość (A) 13C6-glukozy, (B) 13C6-glukozo-6-fosforanu/fruktozo-6-fosforanu, (C) 13C6-fruktozo-1,6-bisfosforanu, (D) 13C3-glicealdehydo-3-fosforanu/dihydroksyacetonofosforanu oraz (E) 13C6-pirogronianu w reakcjach CFME w ciągu 3 h. Surowe wartości pól powierzchni piku wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały użyte do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla adnotacji pozytywnych (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres konwersji metabolitów; znakowany ¹³C mleczan, bursztynian, acetylo-P, acetylo-CoA; powierzchnia piku w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Trendy w czasie dla produktów pośrednich i końcowych w fermentacji 13C6-glukozy w lizacie CFME E. coli . Względne zawartości (A) 13C3-mleczanu, (B) 13C3-bursztynianu, (C) 13C2-fosforanu acetyloilo oraz (D) 13C2-acetylo-CoA w reakcjach CFME w ciągu 3 h. Surowe powierzchnie pików wyodrębnione za pomocą oprogramowania mzMINE zostały wykorzystane do obliczenia średnich i słupków błędu (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy pól powierzchni pików metabolitów dla związków znakowanych ¹³C: fosfoglukonian, rybulozo-5-fosforan." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Trendy w czasie dla produktów pośrednich szlaku pentozofosforanowego pochodzących z 13C6-glukozy w CFME lizatu E. coli .Względne ilości (A) 13C6-6-fosfoglukonolaktonu, (B) 13C6-6-fosfoglukonianu, (C) 13C5-rybulozo-5-fosforanu oraz (D) 13C7-sedoheptulozo-7-fosforanu w ciągu 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE posłużyły do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres aminokwasów znakowanych izotopowo; pola powierzchni piku dla 13C3-tyrozyny, 13C5-histydyny i 13C3-asparaginianu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6Trendy czasowe wykrytych 13C6aminokwasy pochodzące z glukozy w *E. coli* lizat CFME. Względne zawartości (A) 13C9-tyrozyna, (B) 13C5-histydyna oraz (C) 13C3-asparaginianu przez 3 h. Surowe pola pików wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE posłużyły do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla adnotacji pozytywnych (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Reprezentatywny chromatogram HPLC-RID wykazujący piki głównych produktów fermentacyjnych w reakcji CFME inkubowanej w 37 °C przez 24 h. Piki glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu są wystarczająco rozróżnialne na podstawie ich czasów retencji na kolumnie HPLC podczas elucji izokratycznej rozpuszczalnikiem w postaci 5 mM kwasu siarkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa 2: Reprezentatywne widma mas dla metabolitów znakowanych 13C, konkretnie (A) mleczanu, (B) glukozy oraz (C) 6-fosfoglukonianu (6PG) w reakcji CFME inkubowanej w 37 °C przez 1 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Lista wykrytych metabolitów znakowanych 13C, czasy retencji (wyrównane pomiędzy próbkami przy użyciu MZmine), teoretyczne wartości m/z dla pełnego znakowania 13C w trybie negatywnym, wartości m/z wykrytych cech oraz obliczone błędy masy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Protokół ten wykorzystuje wykrywanie współczynnika załamania światła do pomiaru produktów ubocznych metabolizmu węgla, które są powszechnie gromadzone w systemach bezkomórkowych opartych na lizatach. Wykorzystuje również spektrometrię mas do wykrywania jeszcze szerszego panelu centralnych metabolitów, które są generowane w metabolicznie aktywnych lizatach. Dwie techniki zastosowane w tym protokole zapewniają możliwość ilościowego opisu reakcji chemicznych zachodzących w systemie bezkomórkowym opartym na lizacie, co umożliwia wykrycie szerszego zakresu metabolitów, w tym metabolitów obecnych w niskich stężeniach w złożonym tle.Procedury zademonstrują Jaime Lorenzo Dinglasan i David Reeves, absolwenci Wydziału Nauk Biologicznych. Zacznij od połączenia różnych składników w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek, aby przygotować końcowe reakcje z 4,5 miligrama na mililitr całkowitego białka lizatu. Przygotuj bezkomórkowe reakcje inżynierii metabolicznej (CFME) z końcową objętością 50 mikrolitrów w trzech egzemplarzach na punkt czasowy.Natychmiast zakończyć potrójne reakcje w odpowiednich punktach czasowych, dodając równą objętość 5% kwasu trichlorooctowego do końcowej objętości reakcji każdej próbki. Następnie rozcieńczyć każdą próbkę, dodając dwukrotność objętości sterylnej wody do każdej mieszaniny reakcyjnej. Aby podsumować czas zerowy, należy zmieszać tę samą objętość 5% kwasu trichlorooctowego, co całkowita końcowa objętość reakcji z lizatem, przed dodaniem pozostałych składników reakcji.Ten etap zakwaszania wytrąca enzymy lizatu, zanim w znacznym stopniu zmetabolizują glukozę. Wirować próbki i odwirować na mikrowirówce stołowej pod ciśnieniem 11 600 razy g przez pięć minut, a następnie przenieść supernatanty zawierające anality organiczne do czystych probówek. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeżeli analizy HPLC mają być przeprowadzone później.Upewnij się, że przechowywane próbki zostały rozmrożone na lodzie przed przejściem do następnego kroku. Przefiltrować każdy supernatant za pomocą filtra porowego o średnicy 0,22 mikrometra. Po odwirowaniu przenieść każdy filtrat do czystej szklanej fiolki HPLC.Załadować fiolki na tacę automatycznego podajnika próbek systemu HPLC, który został już skonfigurowany do analizy. Na pasku menu wybierz pozycję Sekwencja, Nowy szablon sekwencji. Wybierz opcję Sekwencja.Zapisz szablon sekwencji jako nazwę szablonu sekwencji S.Wybierz sekwencję, tabelę sekwencji. Dołączyć N wierszy odpowiadających N fiolkom. Następnie wprowadź pozycje fiolek i nazwy próbek odpowiednio w polach Nazwa fiolki i próbki, zgodnie z ich rozmieszczeniem na tacy automatycznego podajnika próbek.Wybierz metodę wygenerowaną zgodnie z opisem w manuskrypcie z menu rozwijanego Nazwa metody i wprowadź 50 mikrolitrów jako wstrzyknięcie na fiolkę dla każdego wiersza. Kliknij przycisk Zastosuj i zapisz szablon sekwencji, wybierając opcję Sekwencja, a następnie Zapisz szablon sekwencji. Upewnij się, że szablon sekwencji został załadowany, wybierając Sekwencja, Załaduj szablon sekwencji, nazwę szablonu sekwencji S. Po osiągnięciu stabilnej linii bazowej na wykresie online kliknij prawym przyciskiem myszy panel Moduł RID, Kontrola, Wyłącz zawór recyklingu, aby skierować przepływ rozpuszczalnika przez detektor RID do odpadów.Aby rozpocząć pobieranie danych, wybierz pozycję Sekwencja na pasku menu, a następnie wybierz pozycję Tabela sekwencji, Uruchom. Wybierz pozycję Widok Analiza danych z menu Widok. Znajdź nazwę pliku sekwencji na liście plików po lewej stronie ekranu.Na środkowym panelu ekranu przejdź do Signal View Selection (Wybór widoku sygnału), RID Signal (Sygnał RID), aby wyświetlić chromatogramy próbki. Wybierz wiersz odpowiadający dowolnej próbce z górnego panelu ekranu. Piki odpowiadające docelowym analitom zostaną ułożone wzdłuż osi czasu retencji jako glukoza, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol w próbkach, w których obecne są wszystkie te metabolity.Sprawdź, czy szczyty zainteresowania są dobrze zintegrowane z oprogramowaniem. Czerwona linia powinna zostać automatycznie narysowana jako podstawa każdego szczytu. Jeśli czerwona linia jest przekrzywiona, oznacza to, że automatyczna integracja nie powiodła się.Następnie wybierz przycisk Integracja ręczna z zestawu narzędzi do integracji i ręcznie narysuj podstawę piku, aby zintegrować obszar piku. Wybierz narzędzie Kursor ze wspólnego zestawu narzędzi, aby kliknąć prawidłowo zintegrowane szczyty. Obszar piku i odpowiadający mu czas reakcji wybranego piku zostaną podświetlone jako wiersz tabeli w dolnym panelu poza ekranem.Aby wyeksportować obszary szczytów, wybierz Plik, Eksport, Wyniki integracji. Wykreśl wartości powierzchni pików w porównaniu ze znanymi stężeniami próbek w arkuszu kalkulacyjnym. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykreślone dane, a następnie wybierz Dodaj linię trendu, Formatuj linię trendu, Wyświetl równanie na wykresie.W osobnym arkuszu kalkulacyjnym użyj równań linii trendu krzywej standardowej, aby przekonwertować wartości powierzchni piku na stężenia dla każdego analitu z każdej próbki. Obliczanie średnich obszarów pików i wartości błędów standardowych w trzech powtórzeniach w celu wizualizacji danych. Ustaw trzy reakcje na punkt czasowy, z wyjątkiem czasu zero, na lodzie, zgodnie z opisem w manuskrypcie.Zamiast glukozy należy użyć końcowego stężenia 100-milimolowej glukozy-13C6 w reakcjach. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, dwie i trzy godziny. Aby rozpocząć analizę, należy odpipetować odpowiednią objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do każdej próbki.Jeśli próbki zostały zamrożone, dodaj rozpuszczalnik ekstrakcyjny przed całkowitym rozmrożeniem próbek, aby zapobiec ponownej aktywacji metabolizmu glukozy. Wszystkie etapy przetwarzania próbki należy wykonać na lodzie. Aby podsumować czas zerowy, należy odpipetować końcową objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do odpowiedniej objętości lizatu dla pożądanego stężenia końcowego 4,5 miligrama na mililitr w 50 mikrolitrach objętości reakcyjnej.Dodać pozostałe składniki reakcji zgodnie z wcześniejszym opisem. Ten etap zakwaszania wytrąca enzymy lizatu, zanim w znacznym stopniu zmetabolizują glukozę. Próbki inkubować w rozpuszczalniku ekstrakcyjnym na lodzie przez 30 minut, delikatnie wstrząsając.Następnie odwirować próbki w temperaturze 21 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić supernatant od wytrąconego białka. Przenieś 50 mikrolitrów supernatantu do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek i załaduj fiolki na tacę w odległości czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu urządzenia do analizy należy skonfigurować sekwencję pracy za pomocą oprogramowania do akwizycji i interpretacji danych systemu LC-MS/MS.W obszarze Roadmap, Sequence Setup (Konfiguracja sekwencji) kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, aby wstawić tyle wierszy, ile jest próbek. Dla każdego rzędu ustaw objętość iniekcji na pięć mikrolitrów, a pozycję na odpowiednim miejscu fiolki na tacy automatycznego podajnika próbników. Wprowadź nazwy plików jako nazwy przykładowe i ustaw żądaną ścieżkę pliku dla wyników uruchamiania.Aby rozpocząć uruchamianie, wyróżnij wszystkie nazwy plików w sekwencji. Na pasku menu wybierz Akcje, Uruchom sekwencję. Otwórz MZmine i zaimportuj uzyskane wcześniej nieprzetworzone pliki wyjściowe.Na pasku menu wybierz Metody nieprzetworzonych danych, Import nieprzetworzonych danych i wybierz pliki odpowiadające przykładom. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w manuskrypcie, aby zakończyć analizę MZmine. Wyeksportuj nieprzetworzone obszary pików na końcu analizy MZmine jako plik CSV.Otwórz arkusz kalkulacyjny, aby obliczyć masy metabolitów znakowanych 13C z metabolizmu glukozy w celu ukierunkowanego wyszukiwania. Użyj obliczonych mas metabolitów znakowanych 13C, aby wyszukać i opisać cechy masy do ładunku na podstawie wyników MZmine. Ręcznie sprawdź widma przypuszczalnych adnotacji w przeglądarce jakości, aby potwierdzić adnotacje.Otwórz Roadmap, przeglądarkę Qual. Na pasku narzędzi otwórz plik raw, aby zaimportować nieprzetworzone dane MS każdej próbki. Narysuj linię poniżej żądanego zakresu czasów retencji odpowiadającego przypuszczalnej adnotacji na chromatogramie jonów całkowitych, aby wyświetlić widmo masowe.W eksperymentach HPLC-RID glukoza była spożywana w ciągu pierwszych trzech godzin reakcji i głównie fermentowana do mleczanu. Akumulacja etanolu nastąpiła również znacząco w ciągu pierwszych trzech godzin od reakcji, a następnie ustała. Octan był początkowo obecny w reakcjach jako składnik buforu S30 i kumulował się w wyniku metabolizmu dopiero po sześciu godzinach, kiedy zużycie glukozy uległo spowolnieniu.Mleczan i etanol można zatem uznać za główne produkty końcowe fermentacji w opartym na lizatach, bezkomórkowym metabolizmie glukozy. Zaobserwowano, że zarówno mrówczan, jak i bursztynian były syntetyzowane jako drobne produkty fermentacji. Glukoza-13C6 była obserwowanie spożywana w procesie glikolizy, co widać po wahaniach w glikolitycznych produktach pośrednich.Zgodnie z danymi dotyczącymi wykrywania indeksu refrakcji HPLC, glukoza gromadziła się do mleczanu-13C3, a także była fermentowana do bursztynianu-13C3 w ciągu pierwszych trzech godzin reakcji. Zaobserwowano również włączenie węgli pochodzących z glukozy-13C6 do fosforanów cukru 6-fosfoglukonolaktonu, 6-fosfoglukonianu, rybulozo-5-fosforanu i 7-fosforanu sedoheptulozy-7, co potwierdza udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie glukozy w lizacie. Stwierdzono, że metabolizm glukozy w lizacie wspomaga syntezę tyrozyny-13C9, zapewniając jednocześnie prekursor do produkcji histydyny-13C5.Ważne jest, aby próbki kontrolne dokładnie odzwierciedlały czas zerowy. Dlatego należy upewnić się, że białka w lizacie są inaktywowane przed zmieszaniem z roztworem zawierającym źródła energii. Upewnij się również, że automatyczna integracja pików z próbek testowych, próbek kontrolnych i wzorców jest również spójna, tak aby wyodrębnione obszary pików były porównywalne.

liquid-chromatography-coupled-to-refractive-index-or-mass

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Poznaj metodę HPLC z detekcją refraktometryczną i spektrometrią mas do profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie. Ta technika umożliwia ilościową analizę reakcji metabolicznych.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie (Wideo) | JoVE Journal

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Przeglądaj więcej filmów