Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Protokół ten wykorzystuje wykrywanie współczynnika załamania światła do pomiaru produktów ubocznych metabolizmu węgla, które są powszechnie gromadzone w systemach bezkomórkowych opartych na lizatach. Wykorzystuje również spektrometrię mas do wykrywania jeszcze szerszego panelu centralnych metabolitów, które są generowane w metabolicznie aktywnych lizatach. Dwie techniki zastosowane w tym protokole zapewniają możliwość ilościowego opisu reakcji chemicznych zachodzących w systemie bezkomórkowym opartym na lizacie, co umożliwia wykrycie szerszego zakresu metabolitów, w tym metabolitów obecnych w niskich stężeniach w złożonym tle.

Procedury zademonstrują Jaime Lorenzo Dinglasan i David Reeves, absolwenci Wydziału Nauk Biologicznych. Zacznij od połączenia różnych składników w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek, aby przygotować końcowe reakcje z 4,5 miligrama na mililitr całkowitego białka lizatu. Przygotuj bezkomórkowe reakcje inżynierii metabolicznej (CFME) z końcową objętością 50 mikrolitrów w trzech egzemplarzach na punkt czasowy.

Natychmiast zakończyć potrójne reakcje w odpowiednich punktach czasowych, dodając równą objętość 5% kwasu trichlorooctowego do końcowej objętości reakcji każdej próbki. Następnie rozcieńczyć każdą próbkę, dodając dwukrotność objętości sterylnej wody do każdej mieszaniny reakcyjnej. Aby podsumować czas zerowy, należy zmieszać tę samą objętość 5% kwasu trichlorooctowego, co całkowita końcowa objętość reakcji z lizatem, przed dodaniem pozostałych składników reakcji.

Ten etap zakwaszania wytrąca enzymy lizatu, zanim w znacznym stopniu zmetabolizują glukozę. Wirować próbki i odwirować na mikrowirówce stołowej pod ciśnieniem 11 600 razy g przez pięć minut, a następnie przenieść supernatanty zawierające anality organiczne do czystych probówek. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeżeli analizy HPLC mają być przeprowadzone później.

Upewnij się, że przechowywane próbki zostały rozmrożone na lodzie przed przejściem do następnego kroku. Przefiltrować każdy supernatant za pomocą filtra porowego o średnicy 0,22 mikrometra. Po odwirowaniu przenieść każdy filtrat do czystej szklanej fiolki HPLC.

Załadować fiolki na tacę automatycznego podajnika próbek systemu HPLC, który został już skonfigurowany do analizy. Na pasku menu wybierz pozycję Sekwencja, Nowy szablon sekwencji. Wybierz opcję Sekwencja.

Zapisz szablon sekwencji jako nazwę szablonu sekwencji S.Wybierz sekwencję, tabelę sekwencji. Dołączyć N wierszy odpowiadających N fiolkom. Następnie wprowadź pozycje fiolek i nazwy próbek odpowiednio w polach Nazwa fiolki i próbki, zgodnie z ich rozmieszczeniem na tacy automatycznego podajnika próbek.

Wybierz metodę wygenerowaną zgodnie z opisem w manuskrypcie z menu rozwijanego Nazwa metody i wprowadź 50 mikrolitrów jako wstrzyknięcie na fiolkę dla każdego wiersza. Kliknij przycisk Zastosuj i zapisz szablon sekwencji, wybierając opcję Sekwencja, a następnie Zapisz szablon sekwencji. Upewnij się, że szablon sekwencji został załadowany, wybierając Sekwencja, Załaduj szablon sekwencji, nazwę szablonu sekwencji S. Po osiągnięciu stabilnej linii bazowej na wykresie online kliknij prawym przyciskiem myszy panel Moduł RID, Kontrola, Wyłącz zawór recyklingu, aby skierować przepływ rozpuszczalnika przez detektor RID do odpadów.

Aby rozpocząć pobieranie danych, wybierz pozycję Sekwencja na pasku menu, a następnie wybierz pozycję Tabela sekwencji, Uruchom. Wybierz pozycję Widok Analiza danych z menu Widok. Znajdź nazwę pliku sekwencji na liście plików po lewej stronie ekranu.

Na środkowym panelu ekranu przejdź do Signal View Selection (Wybór widoku sygnału), RID Signal (Sygnał RID), aby wyświetlić chromatogramy próbki. Wybierz wiersz odpowiadający dowolnej próbce z górnego panelu ekranu. Piki odpowiadające docelowym analitom zostaną ułożone wzdłuż osi czasu retencji jako glukoza, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol w próbkach, w których obecne są wszystkie te metabolity.

Sprawdź, czy szczyty zainteresowania są dobrze zintegrowane z oprogramowaniem. Czerwona linia powinna zostać automatycznie narysowana jako podstawa każdego szczytu. Jeśli czerwona linia jest przekrzywiona, oznacza to, że automatyczna integracja nie powiodła się.

Następnie wybierz przycisk Integracja ręczna z zestawu narzędzi do integracji i ręcznie narysuj podstawę piku, aby zintegrować obszar piku. Wybierz narzędzie Kursor ze wspólnego zestawu narzędzi, aby kliknąć prawidłowo zintegrowane szczyty. Obszar piku i odpowiadający mu czas reakcji wybranego piku zostaną podświetlone jako wiersz tabeli w dolnym panelu poza ekranem.

Aby wyeksportować obszary szczytów, wybierz Plik, Eksport, Wyniki integracji. Wykreśl wartości powierzchni pików w porównaniu ze znanymi stężeniami próbek w arkuszu kalkulacyjnym. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykreślone dane, a następnie wybierz Dodaj linię trendu, Formatuj linię trendu, Wyświetl równanie na wykresie.

W osobnym arkuszu kalkulacyjnym użyj równań linii trendu krzywej standardowej, aby przekonwertować wartości powierzchni piku na stężenia dla każdego analitu z każdej próbki. Obliczanie średnich obszarów pików i wartości błędów standardowych w trzech powtórzeniach w celu wizualizacji danych. Ustaw trzy reakcje na punkt czasowy, z wyjątkiem czasu zero, na lodzie, zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Zamiast glukozy należy użyć końcowego stężenia 100-milimolowej glukozy-13C6 w reakcjach. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, dwie i trzy godziny. Aby rozpocząć analizę, należy odpipetować odpowiednią objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do każdej próbki.

Jeśli próbki zostały zamrożone, dodaj rozpuszczalnik ekstrakcyjny przed całkowitym rozmrożeniem próbek, aby zapobiec ponownej aktywacji metabolizmu glukozy. Wszystkie etapy przetwarzania próbki należy wykonać na lodzie. Aby podsumować czas zerowy, należy odpipetować końcową objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do odpowiedniej objętości lizatu dla pożądanego stężenia końcowego 4,5 miligrama na mililitr w 50 mikrolitrach objętości reakcyjnej.

Dodać pozostałe składniki reakcji zgodnie z wcześniejszym opisem. Ten etap zakwaszania wytrąca enzymy lizatu, zanim w znacznym stopniu zmetabolizują glukozę. Próbki inkubować w rozpuszczalniku ekstrakcyjnym na lodzie przez 30 minut, delikatnie wstrząsając.

Następnie odwirować próbki w temperaturze 21 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić supernatant od wytrąconego białka. Przenieś 50 mikrolitrów supernatantu do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek i załaduj fiolki na tacę w odległości czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu urządzenia do analizy należy skonfigurować sekwencję pracy za pomocą oprogramowania do akwizycji i interpretacji danych systemu LC-MS/MS.

W obszarze Roadmap, Sequence Setup (Konfiguracja sekwencji) kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, aby wstawić tyle wierszy, ile jest próbek. Dla każdego rzędu ustaw objętość iniekcji na pięć mikrolitrów, a pozycję na odpowiednim miejscu fiolki na tacy automatycznego podajnika próbników. Wprowadź nazwy plików jako nazwy przykładowe i ustaw żądaną ścieżkę pliku dla wyników uruchamiania.

Aby rozpocząć uruchamianie, wyróżnij wszystkie nazwy plików w sekwencji. Na pasku menu wybierz Akcje, Uruchom sekwencję. Otwórz MZmine i zaimportuj uzyskane wcześniej nieprzetworzone pliki wyjściowe.

Na pasku menu wybierz Metody nieprzetworzonych danych, Import nieprzetworzonych danych i wybierz pliki odpowiadające przykładom. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w manuskrypcie, aby zakończyć analizę MZmine. Wyeksportuj nieprzetworzone obszary pików na końcu analizy MZmine jako plik CSV.

Otwórz arkusz kalkulacyjny, aby obliczyć masy metabolitów znakowanych 13C z metabolizmu glukozy w celu ukierunkowanego wyszukiwania. Użyj obliczonych mas metabolitów znakowanych 13C, aby wyszukać i opisać cechy masy do ładunku na podstawie wyników MZmine. Ręcznie sprawdź widma przypuszczalnych adnotacji w przeglądarce jakości, aby potwierdzić adnotacje.

Otwórz Roadmap, przeglądarkę Qual. Na pasku narzędzi otwórz plik raw, aby zaimportować nieprzetworzone dane MS każdej próbki. Narysuj linię poniżej żądanego zakresu czasów retencji odpowiadającego przypuszczalnej adnotacji na chromatogramie jonów całkowitych, aby wyświetlić widmo masowe.

W eksperymentach HPLC-RID glukoza była spożywana w ciągu pierwszych trzech godzin reakcji i głównie fermentowana do mleczanu. Akumulacja etanolu nastąpiła również znacząco w ciągu pierwszych trzech godzin od reakcji, a następnie ustała. Octan był początkowo obecny w reakcjach jako składnik buforu S30 i kumulował się w wyniku metabolizmu dopiero po sześciu godzinach, kiedy zużycie glukozy uległo spowolnieniu.

Mleczan i etanol można zatem uznać za główne produkty końcowe fermentacji w opartym na lizatach, bezkomórkowym metabolizmie glukozy. Zaobserwowano, że zarówno mrówczan, jak i bursztynian były syntetyzowane jako drobne produkty fermentacji. Glukoza-13C6 była obserwowanie spożywana w procesie glikolizy, co widać po wahaniach w glikolitycznych produktach pośrednich.

Zgodnie z danymi dotyczącymi wykrywania indeksu refrakcji HPLC, glukoza gromadziła się do mleczanu-13C3, a także była fermentowana do bursztynianu-13C3 w ciągu pierwszych trzech godzin reakcji. Zaobserwowano również włączenie węgli pochodzących z glukozy-13C6 do fosforanów cukru 6-fosfoglukonolaktonu, 6-fosfoglukonianu, rybulozo-5-fosforanu i 7-fosforanu sedoheptulozy-7, co potwierdza udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie glukozy w lizacie. Stwierdzono, że metabolizm glukozy w lizacie wspomaga syntezę tyrozyny-13C9, zapewniając jednocześnie prekursor do produkcji histydyny-13C5.

Ważne jest, aby próbki kontrolne dokładnie odzwierciedlały czas zerowy. Dlatego należy upewnić się, że białka w lizacie są inaktywowane przed zmieszaniem z roztworem zawierającym źródła energii. Upewnij się również, że automatyczna integracja pików z próbek testowych, próbek kontrolnych i wzorców jest również spójna, tak aby wyodrębnione obszary pików były porównywalne.