Name: Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach myszy. Protokół zachowuje integralność organelli i minimalizuje zmiany ekspresji genów, zapewniając dokładne wyniki metaboliczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health R35GM119528 dla Roberty Leonardi.

<ol><li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li>
<li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li>
<li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+ABC+transporters%3A+functions+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107(2010).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li>
<li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin%2C+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation%2C+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li>
<li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).</li>
<li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).</li>
<li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615(2013).</li>
<li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li>
<li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver%2C+kidney+and+heart+of+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li>
<li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Neonate%22%5BJournal%5D)">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li>
<li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state%2C+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li>
<li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li>
<li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528(2008).</li>
<li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).</li>
<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li>
<li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podczas perfuzji wątroby bardzo ważne jest, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ blokują one mikronaczynia włosowate w wątrobie, uniemożliwiając lub ograniczając krążenie buforowe i ogólnie zmniejszając wydajność i żywotność hepatocytów20,21. Środki ostrożności, takie jak dokładne sprawdzenie przewodu wlotowego wypełnionego buforem przed kaniulacją IVC i unikanie podnoszenia przewodu wlotowego z rurki zawierającej bufor 1 w celu przełączenia na...

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym procesem w metabolizmie lipidów, zapewniając kataboliczny szlak równoważący syntezę kwasów tłuszczowych i ich przyjmowanie z diety. Proces ten generuje energię dla wielu narządów, w tym mięśnia sercowego, kory nerkowej i wątroby na czczo, i wykorzystuje kwasy tłuszczowe uzyskane z diety, lipolizy tkanki tłuszczowej i wewnętrznych zapasów trójglicerydów1,2.
Utlenianie kwasów tłuszczowych poprzez szlak β-oksydacji powoduje sekwencyjne skrócenie tłuszczowego łańcucha acylowego o dwa atomy węgla na raz, uwalniane jako acetylo-CoA, a proces ten zachodzi zarówno w mitochondriach, jak i w peroksysomach. Podczas gdy większość kwasów tłuszczowych ulega tylko β-oksydacji, niektóre są utleniane przy różnych atomach węgla przed wejściem na ten szlak. Na przykład kwasy tłuszczowe podstawione 3-metylem, takie jak kwas fitanowy, ulegają usunięciu jednego węgla przez α-utlenianie w peroksysomach przed wejściem na szlak β-utleniania. Podobnie, niektóre kwasy tłuszczowe są najpierw przekształcane w dikarboksylowe kwasy tłuszczowe przez utlenianie końcowej grupy metylowej (ω-oksydacja) w retikulum endoplazmatycznym, zanim zostaną preferencyjne utlenione w peroksysomach przez β-oksydację3.
Niezależnie od konkretnych organelli, kwas tłuszczowy musi najpierw zostać przekształcony w tioester koenzymu A (CoA) lub acylo-CoA, który ma zostać utleniony przez szlak β-oksydacji. β-Utlenianie długołańcuchowych acylo-CoA w macierzy mitochondrialnej wymaga transportu karnitynowego do ich translokacji, gdzie palmitoilotransferaza karnityny 1 (CPT1) katalizuje przemianę acylo-CoA do acylokarnityny i jest enzymem ograniczającym szybkość w tym procesie4. Po translokacji do macierzy mitochondrialnej, acylo-CoA są ponownie formowane i służą jako substraty dla maszynerii utleniania β mitochondriów. W stanie na czczo acetylo-CoA wytwarzany w wyniku β-oksydacji w mitochondriach wątrobowych jest przede wszystkim kierowany do ketogenezy. Peroksysomy służą jako główne miejsce β-utleniania bardzo długołańcuchowych, rozgałęzionych i dikarboksylowych kwasów tłuszczowych. Peroksysomy nie wymagają transportu karnityny do importu substratów kwasów tłuszczowych, zamiast tego importują odpowiedni acylo-CoAs poprzez aktywność transporterów kasety wiążącej ATP (ABC) ABCD1-35. W peroksysomach acylo-CoA są następnie utleniane przez dedykowany zestaw enzymów, różniący się od maszynerii utleniania mitochondrialnych kwasów tłuszczowych β. Zarówno mitochondria, jak i peroksysomy wymagają również dostarczania NAD + i wolnego CoA do utleniania tłuszczowych łańcuchów acylowych. Wykazano, że poziom CoA w wątrobie wzrasta w odpowiedzi na post, co wspiera zwiększone tempo utleniania kwasów tłuszczowych, które występuje w tym stanie6. Ponadto zwiększona degradacja CoA w peroksysomach powoduje selektywny spadek utleniania peroksysomalnych kwasów tłuszczowych7. Dlatego proces utleniania kwasów tłuszczowych w komórce jest regulowany przez poziomy ekspresji i aktywność enzymów biorących udział w aktywacji, transporcie i utlenianiu kwasów tłuszczowych, a także stężenia kofaktorów i innych metabolitów w wielu przedziałach subkomórkowych.
Procedury wykorzystujące homogenaty tkankowe do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych niszczą architekturę komórkową regulującą i wspierającą ten proces, prowadząc do zbierania danych, które nie odzwierciedlają dokładnie metabolizmu in vivo. Podczas gdy techniki wykorzystujące posiane hepatocyty pierwotne zachowują ten system, hodowla izolowanych komórek przez dłuższy czas powoduje utratę profilu ekspresji genów in vivo, który był obecny w komórkach, gdy nadal żyły w obrębie zwierzęcia8,9. Poniższy protokół opisuje metodę izolowania pierwotnych hepatocytów i oznaczania ich zdolności do utleniania β kwasów tłuszczowych bezpośrednio po izolacji i w zawiesinie, przy użyciu kwasu [1-14C]palmitynowego. Test opiera się na pomiarze promieniotwórczości związanej z metabolitami rozpuszczalnymi w kwasie (ASM) lub produktami, takimi jak acetylo-CoA, wytwarzanymi w wyniku β-utleniania kwasu palmitynowego [1-14C]kwasu palmitynowego10,11.

<table><tbody><tr><td>(R)-(+)-Sól sodowa Etomoxir</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4539/10</td><td></td></tr><tr><td>[1-14C]-Kwas palmitynowy, 50&ndash; 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/ml</td><td>Amerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie</td><td>ARC 0172A</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, sterylne</td><td>Corning</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L jednorazowe kapilary/tłoki do pipety wyporowej</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008604</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L, 200 i mikro; L oraz 10 i mikro; Pipety i końcówki</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne 5 mL, 10 ml i 25 ml</tr><tr><td>50 ml sterylne probówki wirówkowe</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>70% Kwas nadchlorowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A2296-1LB</td><td></td></tr><tr><td>BSA, bez kwasów tłuszczowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dwuwodny</td><td>MilliporeSigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>MiliporeSigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>E-217</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>11000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>System filtrów, 0,22 &mu; m Filtr PES, 500 mL, Sterile</td><td>CellTreat</td><td>229707</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-400-25</td><td></td></tr><tr><td>HDPE, 6,5 ml fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-342-3</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły podskórne 22 G, 1,5 cala</td><td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VetOne</td><td></td><td></td>502017</tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>MilliporeSigma</td><td>5401119001</td><td>Zdefiniowana mieszanka oczyszczonej kolagenazy I i II ze średnim stężeniem termolizyny</td></tr><tr><td>M199 podłoże</td><td>MiliporeSigma</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 siedmiowodny</td><td>MilliporeSigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>accuSpin Micro 17</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>424270010</tr><tr><td>Kwas palmitynowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wyporowa MR-10, 10 i mikro; L</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008575</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem z wkładkami do probówek stożkowych 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>Probówki do hodowli polipropylenu z okrągłym dnem, 14 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-9A</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>TriCarb 4810 TR</td></tr><tr><td>Koktajl ScintiVerse BD</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem, pojemność 30 L,</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>&nbsp; Model G76</td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe, 100 i mikro; </td><td>m Fisher Scientific 22363549</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe do kciuka</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>138762</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiele wodne, 2&ndash; Pojemność</td><td></td><td></td><td></td> 2,5 l</tr></tbody></table>

pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest kluczowym szlakiem metabolicznym, który zaspokaja zapotrzebowanie wątroby na energię i dostarcza substratów i kofaktorów dla dodatkowych procesów, takich jak ketogeneza i glukoneogeneza, które są niezbędne do utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie i wspierania funkcji narządów pozawątrobowych na czczo. Utlenianie β kwasów tłuszczowych zachodzi w mitochondriach i peroksysomach i jest regulowane przez wiele mechanizmów, w tym wychwyt i aktywację kwasów tłuszczowych, poziomy ekspresji enzymów oraz dostępność kofaktorów, takich jak koenzym A i NAD+. W testach, które mierzą β-oksydację kwasów tłuszczowych w homogenatach wątroby, liza komórek i powszechne dodawanie suprafizjologicznych poziomów kofaktorów maskują skutki tych mechanizmów regulacyjnych. Ponadto integralność organelli w homogenatach jest trudna do kontrolowania i może się znacznie różnić w zależności od preparatu. Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w nienaruszonych hepatocytach pierwotnych pokonuje powyższe pułapki. Protokół ten opisuje metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych pierwotnych hepatocytów myszy inkubowanych z 14znakowanymi C kwasem palmitynowym. Unikając godzin lub dni hodowli, metoda ta ma tę zaletę, że lepiej zachowuje poziomy ekspresji białek i aktywność szlaku metabolicznego pierwotnej wątroby, w tym aktywację β-oksydacji kwasów tłuszczowych obserwowaną w hepatocytach wyizolowanych od myszy na czczo w porównaniu z myszami karmionymi.

Opisana tutaj perfuzja wątroby zazwyczaj pozwala na uzyskanie 30-40 milionów komórek/wątrobę przy średniej żywotności na poziomie 80%, oszacowanej metodą wykluczania błękitu trypanu (Rysunek 2). Typowe stężenie glukozy w buforze Krebsa-Henseleit (KHB), stosowanym do przygotowania buforów perfuzyjnych 1 i 2, wynosi 11 mM. Podczas pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w hepatocytach izolowanych z myszy na czczo, stężenie glukozy w KHB można obniżyć, aby lepiej odwzorować stan głodzenia. Jak ...

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia solidnej metody pomiaru całkowitej beta-oksydacji mitochondriów i peroksysomalnych kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy. Wykorzystanie nienaruszonych komórek utrzymuje integralność organelli i mechanizmy regulacyjne. Dodatkowo, oznaczanie świeżo wyizolowanych hepatocytów minimalizuje zmiany w ekspresji genów w odniesieniu do wątroby pochodzenia.Operacja może być wyzwaniem. Musisz być pewny siebie, pracowity i skoncentrowany. Gdy kaniulacja się powiedzie, spróbuj się zrelaksować, ale zwracaj uwagę i monitoruj jakość perfuzji.Aby rozpocząć zabieg, obficie spryskaj brzuch i klatkę piersiową znieczulonej myszy 70% etanolem. Następnie użyj kleszczy, aby podciągnąć skórę i ścianę brzucha w pobliżu podstawy brzucha i przeciąć bocznie po obu stronach linii środkowej i aż do przepony, aby odsłonić narządy. Odsłoń żyłę główną dolną lub IVC, przesuwając jelita na prawą stronę i delikatnie odchylając płaty wątroby do góry.Włóż mały cylindryczny przedmiot, taki jak nasadka na igłę, pod tylną część myszy, aby lekko przechylić IVC i ułatwić kaniulację. Po uruchomieniu pompy z buforem pierwszym na najniższych obrotach, należy wprowa

measurement-fatty-acid-oxidation-suspension-freshly-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy barwienie in vitro neutralnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby lub nadmiernego gromadzenia tłuszczu w wątrobie. Nadmiar tłuszczu gromadzi się w komórkach w postaci kropelek lipidów. Olej Red O jest rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem, który wiąże się z wewnątrzkomórkowymi obojętnymi lipidami w tych kropelkach lipidów. Obserwowane pod mikroskopem świetlnym te wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów wydają się intensywnie czerwone.

Barwienie czerwienią olejową O: technika barwienia obojętnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby in vitro

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Ten protokół opisuje łatwą w użyciu metodę badania utleniania substratu poprzez śledzenie produkcji 14CO2 in vitro.

Ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem 14CO2

Tutaj prezentujemy tanią metodę ilościową wykorzystującą spektrometrię mas z tlenkiem deuteru i chromatografią gazową (GCMS) do analizy całkowitej lipogenezy de novo kwasów tłuszczowych w brunatnej tkance tłuszczowej in vivo.

Ilościowe oznaczanie syntezy kwasów tłuszczowych de novo w brunatnej tkance tłuszczowej przy użyciu tlenku deuteru

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Proponujemy protokół do identyfikacji kwasów tłuszczowych bez potrzeby ich oczyszczania. Łączy informacje o czasach retencji z widmami masowymi trzech rodzajów pochodnych kwasów tłuszczowych: estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), pochodnych 4,4-dimetyloksazoliny (DMOX) i estrów 3-pirydylokarbinylu (pikolinylu).

Identyfikacja kwasów tłuszczowych w Bacillus cereus

Tutaj prezentujemy efektywną hydrolizę i późniejszą ochronę Fmoc aminokwasu wyizolowanego z kompleksu zasad Ni-Schiffa. Przedstawione tutaj warunki hydrolizy są odpowiednie do stosowania, gdy wymagane jest zachowanie kwasowo-labilnych grup ochronnych łańcucha bocznego. Technika ta może być dostosowana do różnych nienaturalnych substratów aminokwasowych.

Hydroliza kompleksu zasad Ni-Schiffa w warunkach odpowiednich do zachowania kwasowo-labilnych grup ochronnych

Poznaj metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach myszy. Protokół zachowuje integralność organelli i minimalizuje zmiany ekspresji genów, zapewniając dokładne wyniki metaboliczne.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów