Name: Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów mysich w melanocyty przy użyciu trzech czynników transkrypcyjnych: Mitf, Sox10 i PAX3. Technika ta oferuje wysoką wydajność i stabilność kultury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było częściowo wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82070638 i 81770621) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20180281).

Ta praca została zatwierdzona przez Komitet ds. Zarządzania i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności ze standardami ustanowionymi przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Nie przeprowadzono żadnych eksperymentów z udziałem ludzi, więc praca ta nie wymagała zatwierdzenia przez komisję etyczną ds. badań na ludziach. Szczegółowe informacje na temat odczynników można znaleźć w Tabeli materiałów.
1. Budowa skoncentrowanego systemu pakowania lentiwirusów dla czynników transkrypcyjnych
<ol>
	<li>Produkcja skoncentrowanego wirusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, B)
	<ol>
		<li>Płytka 1.5 × 106 komórek HEK-293T do naczynia o średnicy 60 mm i hodowla tych komórek z normalną pożywką (patrz Tabela 1) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2, 
		UWAGA: Jeśli wirus musi być pakowany partiami, można użyć naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2).</li>
		<li>Po 24 godzinach upewnij się, że komórki HEK-293T osiągnęły 80-90% zbiegu w dniu transdukcji i zastąp pożywkę 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM na 1 cm2). Pozostawić komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 przez 2 godziny 
		UWAGA: Pożywka zastępcza musi być wolna od surowicy, aby komórki mogły być "głodzone" w celu lepszej transfekcji plazmidu.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę plazmidów (mieszanina A) zawierającą 3 μg docelowych plazmidów Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 lub Snai2; 1 μg plazmidu pakującego PMD2. G i 2 μg plazmidu wypełniającego PSPAX2. Uzupełnić objętość mieszanki A do 150 μl za pomocą DMEM bez surowicy. Przygotować mieszaninę odczynnika do transfekcji (mieszaninę B), dodając 12 μl odczynnika do transfekcji (objętość jest dwukrotnie większa od całkowitej masy wszystkich plazmidów) i uzupełnić objętość mieszaniny B do 150 μl roztworem DMEM. bez surowicy.
		UWAGA: Podczas przygotowywania mieszanek ważne jest, aby dodawać płyn powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Połącz mieszankę A i wymieszaj B po odstawieniu ich na 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut, aby utworzyć kompleks transfekcyjny.</li>
		<li>Wyjmij komórki HEK-293T z inkubatora, zastąp pożywkę DMEM + 2% FBS, dodaj mieszaninę z kroku 1.1.4 kroplami i delikatnie wymieszaj płyn.</li>
		<li>Po 8 godzinach zmienić pożywkę na 3,5 ml normalnej pożywki. Po zmianie pożywki należy zbierać supernatant wirusa co 24 godziny i 48 godzin.</li>
		<li>Wymieszaj supernatanty wirusa zebrane w dwóch różnych punktach czasowych. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przepuścić supernatant przez filtry 0,45 μm i zebrać go do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Wirus pobrany w ciągu 24 godzin może być przechowywany w temperaturze 4 °C i zmieszany z wirusem zebranym w temperaturze 48 godzin.</li>
		<li>Zagęścić supernatant wirusa przez odwirowanie w temperaturze 6000 × g w temperaturze 4 °C przez noc (~16 godzin). Upewnij się, że osad wirusa jest widoczny na dnie stożkowej probówki po odwirowaniu.</li>
		<li>Powoli wylać supernatant. Rozpuścić osad wirusa w objętości normalnego podłoża, która stanowi 1/100 objętości supernatantu wirusa. Za pomocą mikropipety P1000 delikatnie pipetować w górę i w dół, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. W razie potrzeby podzielić skoncentrowany wirus do probówek do mikrowirówek. Przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Wirus jest skoncentrowany 100x tą metodą. Skoncentrowany wirus (100x) może być przechowywany przez >1 rok w temperaturze -80 °C. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie skoncentrowanego miana wirusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)
	<ol>
		<li>Płytka 1 × 105 komórek HEK-293T do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Pamiętaj, aby dodać jeden dobrze jako kontrolę negatywną. Hodować te komórki na normalnej pożywce w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Dodać 0,1 μl lub 0,2 μl fluorescencyjnie skoncentrowanego wirusa (100x) do każdego dołka po 24 godzinach i dodać 4 ng/μl kationowego odczynnika do transfekcji polimerowej do każdej studzienki. Około 8-12 godzin po zakażeniu wymień pożywkę na normalną. 
		UWAGA: Aby zapewnić dokładność i skuteczność wykrywania fluorescencji, wskaźnik infekcji musi wynosić 10-30%. Dodanie 0,1 μl lub 0,2 μl fluorescencyjnego skoncentrowanego wirusa może utrzymać skuteczność infekcji w tym zakresie. Skoncentrowane miano wirusa może osiągnąć co najmniej 1 × 108 jednostek transdukcyjnych (TU)/ml.</li>
		<li>Około 48 godzin po zakażeniu umyj naczynie 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia martwych komórek.</li>
		<li>Trypsynizuj te komórki za pomocą 250 μl 0,05% trypsyny-EDTA na studzienkę na 6-dołkową płytkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS, dodać zawiesinę do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej i wykryć skuteczność infekcji fluorescencji wirusa (białko zielonej fluorescencji, GFP+) za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Obliczyć miano stężonego wirusa, korzystając z następującego wzoru: 105 (objętość komórki) × wskaźnik infekcji (GFP+%)/objętość dodanego wirusa (0,1 μl lub 0,2 μl).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bezpośrednie przeprogramowanie fibroblastów na melanocyty (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Pokryj jedną studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej 1 ml 0,1% roztworu żelatyny w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. Upewnij się, że studzienka jest całkowicie pokryta 0,1% roztworem żelatyny. Odessać 0,1% roztwór żelatyny po pokryciu. 
	UWAGA: Przygotować 0,1% roztwór żelatyny (100 ml) w następujący sposób: 0,1 g żelatyny w proszku rozpuszcza się w 100 ml ultraczystej wody w autoklawowanej szklanej butelce, a następnie przechowuje w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 miesiące.</li>
	<li>Płytkę 5 × 104 MEF umieścić w jednym dołku na 6-dołkowej płytce pokrytej 0,1% żelatyną (jak w kroku 2.1) i hodować te komórki na normalnej pożywce w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Po 24 godzinach upewnij się, że MEF-y osiągnęły 40-50% zbieżności. Wymień pożywkę na normalną pożywkę.</li>
	<li>W dniu 0 wyjmij skoncentrowany wirus z zamrażarki i rozpuść go na lodzie. Obliczyć objętość wirusa, który ma zostać dodany, korzystając z równania (1). Dodać skoncentrowany wirus dla sześciu czynników transkrypcyjnych, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 i Snai2 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki zgodnie z obliczoną objętością, a następnie dodać 4 μg/ml kationowego polimerowego środka transfekcyjnego. 
	Numer komórki (5 × 104) × 30 (mnogość zakażenia, MOI)/miano wirusa (1)</li>
	<li>W dniu 1, 8-12 godzin po zakażeniu, należy usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją świeżą, normalną pożywką, dodając 0,5 μg/ml puromycyny w celu zbadania stabilnych zakażonych linii komórkowych.</li>
	<li>W 2. dniu, 48 godzin po zakażeniu, należy stopniowo zastępować pożywkę supernatantową pożywką przeprogramowującą. Najpierw zmień 1/4 całkowitej objętości podłoża i dodaj 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Od dnia 3 do dnia 7, w zależności od stanu komórek, stopniowo zmieniaj pożywkę, zastępując ją większą ilością pożywki do przeprogramowania (patrz Tabela 1) i przejdź na pełną pożywkę do przeprogramowania w ciągu 5 dni. 
	UWAGA: W tym okresie puromycyna i CHIR99021 muszą być stosowane codziennie. Wiele martwych komórek pojawi się w pierwszym i drugim dniu wymiany pożywki przeprogramowującej. Jest to normalne, ponieważ komórki stopniowo przystosowują się do transformacji. Dlatego pożywkę należy zmieniać stopniowo, aby zapewnić zdrową proliferację komórek.</li>
	<li>Aby przejść przez komórki, dodaj 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA, aby trawić komórki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Kiedy ~ 60% komórek uniesie się w górę, przerwij trawienie, dodając normalną pożywkę 2x objętość enzymu trawiennego. Zawiesinę komórek zebrać do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki do przeprogramowania i umieścić komórki w sterylnym naczyniu o średnicy 60 mm o gęstości 3 × 104/cm2. Hodować te komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% skupemCO2. 
	UWAGA: Od 8 do 21 dnia komórki te są subhodowane co 3-5 dni i hodowane w sterylnych naczyniach o średnicy 60 mm w celu rozprężenia. Można je hodować, aby osiągnąć co najmniej przejście 5.</li>
</ol>
3. Optymalizacja dla bezpośredniego przeprogramowania i identyfikacji
<ol>
	<li>Badania przesiewowe pod kątem zoptymalizowanych czynników transkrypcyjnych
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 2.1-2.7, za każdym razem redukując jeden z sześciu czynników transkrypcyjnych. Zainfekuj MEF-y wirusem za pomocą kombinacji pięciu czynników transkrypcyjnych.</li>
		<li>Siedem dni po zakażeniu wyekstrahuj RNA tych komórek16 i przeanalizuj poziomy ekspresji ich genów melanocytowych za pomocą PCR Z ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR)17, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem czynników transkrypcyjnych o największym wpływie na konwersję do melanocytów, usuwając je jeden po drugim (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Użyj trzech najważniejszych czynników transkrypcyjnych wpływających na konwersję do melanocytów, aby zainfekować MEF. Powtórz kroki 2.1-2.7. 
		UWAGA: Siedem dni po zakażeniu geny melanocytów powinny być wykrywalne w tych przekształconych komórkach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Informacje podstawowe dotyczące charakterystyki iMels znajdują się w Tabeli 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja indukowanych melanocytów (iMels)
	<ol>
		<li>Użyj barwienia immunofluorescencyjnego18, aby sprawdzić, czy iMels wyrażają białka melanocytowe, w tym TYRP-1 i DCT (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
		<li>Barwienie specyficzne dla melaniny 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B)
		<ol>
			<li>Przygotować 4% paraformaldehydu (10 ml) w następujący sposób: rozpuścić 0,4 g proszku paraformaldehydu w 10 ml PBS. Umieścić roztwór w piekarniku w temperaturze 56 °C na 2 godziny, aby ułatwić rozpuszczenie. 
			UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden miesiąc.</li>
			<li>Hoduj iMels w naczyniu o średnicy 30 mm i umyj naczynie dwukrotnie podgrzanym PBS. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki przez 20 minut, a następnie umyj naczynie 3 razy PBS.</li>
			<li>Przygotuj 0,1% roztwór barwnika DOPA (10 ml) tuż przed użyciem, rozpuszczając 0,01 g proszku L-DOPA w 10 ml PBS. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut; Potrząśnij nim kilka razy, aby przyspieszyć rozpuszczenie.</li>
			<li>Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego 0,1% roztworu barwiącego DOPA. Inkubować w piecu w temperaturze 37 °C przez 2-5 godzin. Jeżeli nie ma brązowo-czarnych cząstek, należy kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez kolejne 2 godziny, ale nie przez >5 godziny. Próbki należy sprawdzać co 30 minut.</li>
			<li>Umyj naczynie 3 razy PBS przez 1 minutę za każdym razem. Zabarwić jądro 1 ml roztworu barwiącego hematoksylinę przez 2 minuty.</li>
			<li>W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy odwodnić przy użyciu 95% etanolu przez 3 minuty, a następnie 100% etanolu przez 5 minut. Uszczelnij naczynie ksylenem i neutralnym balsamem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie Massona-Fontany specyficzne dla melaniny (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B)
		<ol>
			<li>Umieść iMels w naczyniu o średnicy 30 mm i utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 20 minut; umyj naczynie 3 razy za pomocą PBS.</li>
			<li>Dodać 1 ml roztworu A (roztwór amoniaku srebra) z zestawu do barwienia Masson-Fontana (patrz tabela materiałów), umieścić naczynie w ciemnym pudełku i umieścić ciemne pudełko w piekarniku w temperaturze 56 °C na 15-40 minut 
			UWAGA: Jeżeli brązowo-czarne cząstki nie są widoczne po 15 minutach w piecu, należy umieścić próbki z powrotem w piecu o temperaturze 56 °C, aby kontynuować inkubację, ale nie przez >40 minut. Do ciemnego pudełka można dodać trochę wody, aby zapobiec wysychaniu.</li>
			<li>Zassać roztwór A i umyć naczynie 5-6 razy wodą destylowaną, za każdym razem 1-2 minuty.</li>
			<li>Dodaj 1 ml roztworu B (roztwór hipo ) z zestawu do barwienia Masson-Fontana i pozostaw naczynie w temperaturze pokojowej na 3-5 minut.</li>
			<li>Zassać roztwór B i umyć naczynie wodą z kranu 3 razy, za każdym razem po 1 minutzie.</li>
			<li>Dodać 1 ml roztworu C (neutralny czerwony barwnik) z zestawu do barwienia Masson-Fontana i pozostawić naczynie w temperaturze pokojowej na 3-5 minut.</li>
			<li>Zassać roztwór C i umyć naczynie 3 razy wodą destylowaną, za każdym razem 1 minutę.</li>
			<li>Dodaj 1 ml 100% etanolu w celu szybkiego odwodnienia i odessaj etanol po 3 minutach 
			UWAGA: Poplamione próbki mogą być przechowywane przez długi czas po uszczelnieniu ksylenem i neutralnym balsamem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li>
<li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011(2015).</li>
<li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%3A+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li>
<li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo+management%3A+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li>
<li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+therapies+for+vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li>
<li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509(2018).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+achievements%2C+hurdles%2C+and+new+roads+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li>
<li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807(2014).</li>
<li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891(2016).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jakość wirusa ma kluczowe znaczenie dla powodzenia bezpośredniego przeprogramowania melanocytów w tym protokole. Metoda pakowania i koncentracji wirusów w tym protokole jest prosta i łatwa do powtórzenia i nie opiera się na żadnym innym pomocniczym skoncentrowanym odczynniku. Protokół ten może być z powodzeniem stosowany w większości laboratoriów. Aby zapewnić jakość skoncentrowanego wirusa, należy zwrócić szczególną uwagę na następujące punkty. Jednym z nich jest stan ogniwa HEK-293T. Chociaż komórki HEK-293T są komórka...

Bielactwo to choroba skóry, która poważnie wpływa na zdrowie fizyczne i psychiczne osób dotkniętych tą chorobą. Z różnych powodów, w tym nieprawidłowości metabolicznych, stresu oksydacyjnego, wytwarzania mediatorów stanu zapalnego, odwarstwienia komórek i odpowiedzi autoimmunologicznej, funkcjonalne melanocyty są tracone, a wydzielanie melaniny zostaje zatrzymane, co prowadzi do rozwoju bielactwa nabytego1,2. Schorzenie to występuje szeroko i jest szczególnie problematyczne na twarzy. Głównym leczeniem jest ogólnoustrojowe stosowanie kortykosteroidów i immunomodulatorów. Fototerapia może być stosowana w chorobach ogólnoustrojowych lub miejscowych, a także istnieją zabiegi chirurgiczne, takie jak przeszczep perforowanej skóry i autologiczny przeszczep melanocytów3,4,5. Jednak pacjenci korzystający z terapii farmakologicznej i fototerapii są podatni na nawroty choroby, a te metody leczenia mają słabe długoterminowe efekty terapeutyczne. Leczenie chirurgiczne jest traumatyczne i tylko umiarkowanie skuteczne2,6. Dlatego potrzebna jest nowa i skuteczna strategia terapeutyczna w przypadku bielactwa.
Przeprogramowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) odwraca te komórki ze stanu końcowego do stanu pluripotencjalnego, w czym pośredniczą czynniki transkrypcyjne, Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc7. Jednak ze względu na możliwość rakotwórczości i długi czas produkcji, technologia ta spotkała się ze sceptycyzmem w zastosowaniu w warunkach klinicznych8. Bezpośrednie przeprogramowanie to technologia, która sprawia, że jeden typ komórki końcowej przekształca się w inny typ komórki końcowej9. Proces ten osiąga się dzięki odpowiednim czynnikom transkrypcyjnym. Różne komórki zostały już bezpośrednio przeprogramowane z powodzeniem, w tym kardiomiocyty10, neurons11 i komórki rzęsate ślimaka12. Niektórzy badacze przeprogramowali nawet tkankę skórną bezpośrednio in situ, która może być wykorzystana do naprawy ran13. Korzyści płynące z bezpośredniego przeprogramowania obejmują skrócenie czasu oczekiwania i kosztów, mniejsze ryzyko zachorowania na raka, mniej problemów etycznych oraz lepsze zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw determinacji losu komórki9.
Chociaż metoda bezpośredniego przeprogramowania jest powszechnie stosowana, obecnie nie ma określonej metody bezpośredniego przeprogramowania komórek skóry na melanocyty, zwłaszcza ze względu na liczne czynniki transkrypcyjne, które należy wziąć pod uwagę14,15. Czynniki transkrypcyjne, Mitf, Sox10 i Pax3, zostały wykorzystane do bezpośredniego przeprogramowania komórek skóry w melanocyty14. W przeciwieństwie do tego, kombinacja MITF, PAX3, SOX2 i SOX9 została również wykorzystana do bezpośredniego przeprogramowania komórek skóry na ludzkie melanocyty w innym badaniu15. W tym protokole, pomimo zastosowania innej metody przesiewowej, ten sam wynik uzyskano z kombinacją Mitf, Sox10 i Pax3 w celu bezpośredniego przeprogramowania komórek skóry w melanocyty, jak opisano wcześniej14. Opracowanie systemu do generowania melanocytów z innych komórek skóry może zapewnić schemat przekształcania innych komórek skóry pacjentów z bielactwem w melanocyty. Dlatego tak ważne jest, aby skonstruować prostą i skuteczną metodę tego bezpośredniego przeprogramowania, aby skutecznie wygenerować melanocyty.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtr M</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistyren rurka z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95%/100% etanolu</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Stężenie 40 mg/mL Stężenie końcowe 24 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat anty-mysi IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>Rozcieńczenie 1:500 do stosowania</td></tr><tr><td>antybiotyków (Pen / Strep)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Przechowywane w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRP1 / TYRP1</td><td>Millipore</td><td>MABC592</td><td>Gospodarz / Izotyp: Mysz IgG2a Reaktywność gatunkowa: Mysz / Człowiek Rozcieńczenie 1:200 w celu użycia</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-TRP2 / DCT</td><td>Abcam</td><td>ab74073</td><td>Gospodarz / Izotyp: IgG królika Reaktywność gatunkowa: Mysz / człowiek Rozcieńczenie 1:200 do użycia</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Stężenie zapasu 10 mM Final stężenie 3 &mu; M</td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>Stężenie zapasowe 0,3 mg / ml Stężenie końcowe 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 Kozia anty-królicza IgG (H + L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td><td>Rozcieńczenie 1:500 w celu użycia</td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose)</td> <td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Przechowywane w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Przechowywany w -20 & deg; C Inaktywowany termicznie przed użyciem</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Przechowywana w</td></tr><tr><td>plazmidach RT GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 i Snai2)</td><td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Human EDN3</td><td>American-Peptide</td><td>88-5-10A</td><td>Stężenie zapasowe 100 &mu; M Stężenie końcowe 0,1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Stężenie zapasów 100 &mikro; g / ml Stężenie końcowe 0,5 i mikro; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Odczynnik do transfekcji, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia Masson-Fontana</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Neutralny balsam</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td> <td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Phorbol 12-mirystynian 13-octan (TPA) Sigma</td><td></td> <td>P8139</td><td>Stężenie magazynowe 1 mM Stężenie końcowe 200 nM</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>kationowy odczynnik do transfekcji polimerowej; Stężenie w magazynie 8 &mu; g/&mikro; L Stężenie końcowe 4 ng/&mikro; L</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Stężenie zapasowe 4 &mu; g/mL Stężenie końcowe 10 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowana insulina ludzka</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I3536</td><td>Stężenie podstawowe 10 mg/mL Stężenie końcowe 5 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki SCF</td><td>R& D</td><td>255-SC-010</td><td>Stężenie zapasów 200 &mu; g/ml Stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>przechowywany w RT</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Utrata funkcji melanocytów prowadzi do bielactwa, które poważnie wpływa na zdrowie fizyczne i psychiczne osób dotkniętych chorobą. Obecnie nie ma skutecznego długoterminowego leczenia bielactwa. Dlatego konieczne jest opracowanie wygodnego i skutecznego leczenia bielactwa. Technologia medycyny regeneracyjnej do bezpośredniego przeprogramowania komórek skóry w melanocyty wydaje się być obiecującą nową metodą leczenia bielactwa. Polega to na bezpośrednim przeprogramowaniu komórek skóry pacjenta w funkcjonalne melanocyty, aby pomóc złagodzić utratę melanocytów u pacjentów z bielactwem. Jednak tę metodę należy najpierw przetestować na myszach. Chociaż bezpośrednie przeprogramowanie jest szeroko stosowane, nie ma jasnego protokołu bezpośredniego przeprogramowania do melanocytów. Co więcej, liczba dostępnych czynników transkrypcyjnych jest przytłaczająca. 
Tutaj prezentowany jest protokół systemu pakowania skoncentrowanych lentiwirusów do produkcji czynników transkrypcyjnych wybranych do przeprogramowania komórek skóry na melanocyty, w tym Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 i Snai2. Mysie fibroblasty embrionalne (MEF) zostały zakażone skoncentrowanym lentiwirusem dla wszystkich tych czynników transkrypcyjnych w celu bezpośredniego przeprogramowania MEF w indukowane melanocyty (iMels) in vitro. Co więcej, te czynniki transkrypcyjne zostały przebadane, a system zoptymalizowano pod kątem bezpośredniego przeprogramowania na melanocyty. Ekspresja charakterystycznych markerów melaniny w iMels na poziomie genu lub białka była znacznie zwiększona. Wyniki te sugerują, że bezpośrednie przeprogramowanie fibroblastów do melanocytów może być skuteczną nową strategią terapeutyczną dla bielactwa i potwierdzić mechanizm rozwoju melanocytów, co będzie stanowić podstawę do dalszego bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w melanocyty in vivo.

Niniejszy artykuł zawiera protokoły skoncentrowanego systemu pakowania lentiwirusów w celu produkcji lentiwirusów niosących czynniki transkrypcyjne do bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w melanocyty oraz protokoły przesiewania czynników transkrypcyjnych i bezpośredniego przeprogramowania MEF w melanocyty.
Sukces produkcji skoncentrowanego lentiwirusa oceniono poprzez obserwację intensywności fluorescencji GFP (Rysunek 1A) lub za pomocą cytometrii przepł...

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Opisano bezpośrednie przeprogramowanie w celu generowania melanocytów. Jednak w różnych badaniach stosuje się różne czynniki transkrypcyjne. W niniejszym protokole zweryfikowaliśmy i zmniejszyliśmy liczbę czynników transkrypcyjnych, zachowując przy tym wysoką wydajność przeprogramowania.Opracowaliśmy system bezpośredniego przeprogramowania w celu generowania melanocytów z wykorzystaniem zaledwie trzech czynników transkrypcyjnych: Mitf, Sox10 oraz PAX3, a także zmodyfikowaliśmy system hodowli, aby uczynić go bardziej stabilnym i odpornym. Sposób regeneracji funkcjonalnych melanocytów jest istotną kwestią, która może pomóc w przełamaniu ograniczeń terapeutycznych w chorobach depigmentacyjnych, takich jak vitiligo. Odpowiednie przeprogramowanie stanowi potencjalny przełom. Nasza technika charakteryzuje się wygodą, wysoką operacyjnością oraz stabilnością, co ułatwia jej wdrażanie i powtarzalność.Aby rozpocząć produkcję skoncentrowanego lentiwirusa, wysieje się 1,5 × 10⁶ komórek HEK-293T do szalki 60 mm i hoduje komórki w standardowej pożywce w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2. Po 24 godzinach inkubacji, gdy komórki HEK-293T osiągną 80–90% konfluencji, należy wymi

direct-reprogramming-of-mouse-fibroblasts-into-melanocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Bezpośrednie przeprogramowanie fibroblastów mysich na melanocyty

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Ten film opisuje szybką metodę jednoczesnego izolowania i hodowli melanocytów i fibroblastów ze skóry pourodzeniowego szczeniaka myszy. Komórki te mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania biologii komórek skóry, gojenia się ran i czerniaka.

Szybka hodowla pierwotnych mysich melanocytów i fibroblastów: Izolowanie melanocytów i fibroblastów z próbki całej mysiej skóry

Źródło: Zhang, Y., et al., Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (2021)W niniejszym materiale wideo zaprezentowano produkcję i zagęszczanie rekombinowanego lentiwirusa w komórkach ssaków, co umożliwia wydajną dostawę genów czynników transkrypcyjnych lub innych elementów genetycznych w zastosowaniach takich jak przeprogramowanie komórkowe, badania funkcjonalne oraz potencjalne badania terapeutyczne.

Generowanie rekombinowanego lentiwirusa w komórkach ssaków

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Tutaj prezentujemy nasz protokół wytwarzania indukowanych erytroidalnych progenitorów (iEPs) z dorosłych fibroblastów myszy za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii (DLR) sterowanego czynnikiem transkrypcyjnym.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów mysich w melanocyty przy użyciu trzech czynników transkrypcyjnych: Mitf, Sox10 i PAX3. Technika ta oferuje wysoką wydajność i stabilność kultury.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Przeglądaj więcej filmów