Name: Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj model kohodowli komórek sercowych do badania niedokrwienia/reperfuzji in vitro. Ta metoda pozwala ocenić ochronną rolę komórek śródbłonka względem kardiomiocytów przy kontrolowanej odległości między warstwami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Laboratorium Biomedyczne Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych (I01 BX003482) oraz przez fundusze instytucjonalne dla M.L.R.

1. Przygotowanie eksperymentalne/posiewanie
<ol>
	<li>Utrzymuj CM i EC zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Rozmrozić obie linie komórkowe, gdy dotrą od dostawców. Płytka w kolbach T25 po umyciu świeżą pożywką. Zaleca się zakup każdej pożywki do hodowli komórkowych od tych samych dostawców, od których zakupiono komórki. Następnego dnia odśwież komórki pożywką i użyj, gdy się zlewa.</li>
		<li>Inkubator do hodowli komórkowych należy utrzymywać w temperaturze 37 °C przy zawartości 21%O2, 5% CO2, 74% N2 i nawilżać go. 
		UWAGA: Pierwotne komórki śródbłonka tętnic wieńcowych myszy użyte w tym protokole są izolowane z tętnic wieńcowych myszy C57BL / 6, a kardiomiocyty dorosłych myszy są izolowane z serc dorosłych myszy C57BL / 6J i uzyskiwane komercyjnie (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytki CM w sterylnych warunkach na dnie płytek 24-dołkowych (dolna warstwa). 24 godziny później umieścić EC w wkładce (lub górnej części) dołka kokulturowego. 24 godziny po posiewie EC umieścić wkładki EC na podstawach płytek CM, rozpoczynając okres kohodowli. Pozwól komórkom na wspólną hodowlę przez co najmniej 12-24 godziny przed użyciem. Te kroki zostały szczegółowo opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Oszacuj konfluencję linii komórkowej CM pod mikroskopem świetlnym. Gdy komórki wydają się być w 90%-100% zlewające się w kolbach hodowlanych, przystąp do eksperymentalnego posiewu.</li>
		<li>Usunąć pożywkę z kolb zawierających zbiegające się hodowle komórkowe i trypsynizować 3-5 ml trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) dla kolb T25. Delikatnie wymieszać kolbę, inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut, a następnie ocenić postęp enzymatyczny pod mikroskopem świetlnym. Gdy komórki zaczną się zaokrąglać, użyj skrobaka do komórek, aby oderwać komórki od powierzchni.</li>
		<li>Po odłączeniu dezaktywować roztwór trypsyny, dodając roztwór trypsyna/komórka do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki dla kolb T25. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 120 x g przez 2 minuty, aby uzyskać osad o miękkich komórkach. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki.</li>
		<li>Aby przeprowadzić liczenie komórek i potwierdzić ich żywotność, należy zmieszać podwielokrotność 10 μl zawieszonych komórek i 10 μl barwnika błękitu trypanowego. Policz żywe komórki za pomocą licznika komórek. Rozcieńczyć komórki świeżymi, regularnymi pożywkami, aby osiągnąć pożądaną gęstość wysiewu. Objętości są obliczane w zależności od pożądanej gęstości nasion i koncentracji komórek w roztworach podstawowych. Wszystkie posiewy powinny być wykonywane w sterylnych warunkach.</li>
		<li>Płytki CM o gęstości wysiewu 300 000 na studzienkę na dnie 24-dołkowej płytki wstępnie pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 21%O2 i 5% CO2 przez noc.</li>
		<li>Po 24 godzinach płytkuje EC we wkładkach z optymalną gęstością posiewu 100 000 na wkładkę (obszar hodowli wynosi 33,6 mm2), (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po 24 godzinach powlekania EC umieścić wkładki EC w studzienkach CM, inicjując kokulturę. Pozwól komórkom na wspólną hodowlę przez 12-24 godziny przed wykonaniem eksperymentów.</li>
		<li>Upewnij się, że do czasu przeprowadzenia eksperymentów zarówno CM, jak i EC osiągnęły zbieżność 80%-90%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Niedotlenienie/reoksygenacja symulująca niedokrwienie/uszkodzenie reperfuzyjne In vitro
UWAGA: Następujące kroki należy wykonać zgodnie z opisem, nie rób przerwy pomiędzy nimi.
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże hipoksyjne, wlewając ~25 ml pożywki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Uszczelnij górną część membraną silikonową i użyj wysterylizowanej pipety, aby wybić otwór. Wykonaj kolejny otwór, tym razem pozostawiając pipetę zanurzoną w około 2/3 w mediach.</li>
	<li>Przepłukiwać media hipoksyjnym gazem (0,0125%O2, 5% CO2, 94,99% N2) przez 5 minut przy natężeniu przepływu 30 l/min. Minimalizuje to ilość O2 rozpuszczonego w pożywce, gdy zaczyna się hipoksja (krok 2.5).</li>
	<li>Odrzucić pożywkę z 24-dołkowych płytek lub wkładek hodowlanych zawierających przyłączone komórki i bardzo delikatnie przemyć 100 μl/basenik 10% roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie dodać 500 μl świeżo przygotowanej pożywki hipoksycznej do każdego dołka płytek lub wkładek. 
	UWAGA: Niedotlenienie pożywki jest przerywane tak krótko, jak to możliwe na tym etapie, zanim rozpocznie się prawdziwe niedotlenienie komórek i pożywek w kroku 2.5.
	<ol>
		<li>W normoksyjnej grupie kontrolnej zastąp oryginalną pożywkę świeżą normalną pożywką zawierającą glukozę i surowicę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawilż komorę hipoksji, umieszczając w niej szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą. Następnie umieść płytki zawierające grupy hipoksyjne w komorze.</li>
	<li>Przepłukać komorę hipoksji gazem hipoksycznym (0,0125%O2, 5% CO2, 94,99% N2) przez 5 minut przy przepływie 30 l/min. Umieścić komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Po niedotlenieniu uprawiaj CM i EC w normalnych warunkach. W tym celu należy wyrzucić stare podłoża z płytek/wkładek, zastąpić je normalną pożywką (zawierającą glukozę i surowicę; 500 μl każdej studzienki/wkładki) i przechowywać w inkubatorze w normalnych warunkach hodowli (21%O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) przez 2 godziny, aby naśladować reperfuzję.</li>
	<li>Aby kontrolować wszelkie skutki wymiany pożywki, należy zmienić pożywkę komórek normoksycznych w tym samym czasie, w którym zmieniane jest podłoże niedotlenione. 
	UWAGA: Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd tego protokołu.</li>
</ol>
3. Ocena punktu końcowego
<ol>
	<li>Przenieś pożywkę do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej do płytki 96-dołkowej. Użyj 200 μl pożywki z każdego dołka płytki 24-dołkowej i równomiernie rozprowadź odpowiednio do czterech dołków płytki 96-dołkowej. Użyj po jednej płytce do normoksji w porównaniu z hipoksją w porównaniu z HR.</li>
	<li>Określić stopień uszkodzenia komórek, np. poprzez pomiar absorbancji LDH przy użyciu zestawu do oznaczania cytotoksyczności zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj test na 96-dołkowej płytce zgodnie z instrukcjami w protokole testu.</li>
</ol>
4. Statystyki
<ol>
	<li>Dane parametryczne można wyświetlać jako średnią/odchylenie standardowe, a dane nieparametryczne jako wykresy skrzynkowe z medianą/zakresem międzykwartylowym. Należy przeprowadzić odpowiednie testy wielokrotnych porównań parametrycznych i nieparametrycznych z akceptowalnymi testami post hoc w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia błędu typu 1. Istotność jest zwykle ustawiana na wartość alfa 0,05 (dwustronna).</li>
	<li>Dla wszystkich eksperymentów przeprowadzonych w bieżącym badaniu należy wykonać co najmniej trzy powtórzenia studni w ramach jednego eksperymentu. Do analizy statystycznej wykorzystano od trzech do sześciu powtórzeń każdego eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Krytyczne kroki w protokole Modele kokultur komórkowych wykorzystano do badania komórkowych mechanizmów kardioprotekcji. Sposób stworzenia dwóch oddzielnych warstw z sensownym odstępem między nimi jest zatem kluczowy dla opracowania odpowiedniego modelu kokultury. Wyzwaniem w badaniu symulowanego uszkodzenia w podczerwieni, tj. HR, jest to, że nie tylko samo niedokrwienie (niedotlenienie), ale także reperfuzja (reoksygenacja) pogarsza dysfunkcję komórkową. W związku z tym realistyczny model musi odz...

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie1,2. Jednak proces leczenia reperfuzji sam w sobie może powodować śmierć kardiomiocytów, znaną jako uszkodzenie niedokrwienia mięśnia sercowego/reperfuzji (IR), na które nadal nie ma skutecznego lekarstwa3. Sugeruje się, że komórki śródbłonka (EC) chronią kardiomiocyty (CM) poprzez wydzielanie sygnałów parakrynnych, a także interakcje międzykomórkowe4.
Modele kohodowli komórek były szeroko wykorzystywane do badania roli autokrynnych i/lub parakrynnych interakcji komórka-komórka na funkcję i różnicowanie komórek. Wśród modeli współhodowli najprostsza jest kokultura mieszana, w której dwa różne typy komórek są w bezpośrednim kontakcie w jednym przedziale hodowli w pożądanym stosunku komórek5. Jednak oddzielne leczenie między typami komórek i dalsza analiza pojedynczego typu komórek nie są łatwo wykonalne, biorąc pod uwagę populację mieszaną.
Poprzednie badania wykazały, że niedotlenienie i niedokrwienie powoduje znaczne uszkodzenia integralności błony komórkowej, mierzone przez uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Uraz ten pogarsza się po ponownym natlenieniu, naśladując uraz reperfuzyjny6,7,8. Celem obecnego protokołu było przetestowanie hipotez, że obecność EC może w zależności od dawki osłabiać nieszczelność błony komórkowej CM spowodowaną niedotlenieniem i reoksygenacją (HR) oraz że ochronne działanie EC można zoptymalizować poprzez zmianę odległości kontaktu między dwiema liniami komórkowymi. W związku z tym zastosowaliśmy trzy rodzaje wkładek do hodowli komórkowych oraz pierwotne komórki śródbłonka tętnic wieńcowych myszy i kardiomiocyty dorosłych myszy. Wkładki, oznaczone markami Corning, Merck Millipore i Greiner Bio-One, pozwoliły nam stworzyć trzy różne warunki przesłuchów w hodowlach komórkowych z odległościami między liniami komórkowymi wynoszącymi odpowiednio 0,5, 1,0 i 2,0 mm. W każdym przypadku pokryto 100 000 EC na wkładkę.
Ponadto, aby ustalić, czy gęstość EC w kokulturze przyczynia się do tłumienia urazów HR w tym modelu, zbadaliśmy zależność dawka-odpowiedź między stężeniem EC a uwalnianiem LDH przez CMs. EC zostały posiane odpowiednio po 25 000, 50 000 i 100 000 na wkładkę w płytce 2,0 mm.
Ten raport krok po kroku przedstawia podejście dla badaczy, jak wykorzystać ten ważny model na swoją korzyść.

<table><tbody><tr><td>Kardiomiocyty dorosłych myszy (CM)</td><td>Celprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>Izolowany z dorosłej tkanki serca myszy C57BL / 6J</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Liczenie komórek do obliczania liczby komórek</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>Sterylny kaptur do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowych Zamrażanie kultur komórkowych Medium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6916</td><td>Służy do zamrażania komórek w celu długotrwałego przechowywania linii komórkowych</td></tr><tr><td>Inkubator kultur komórkowych</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>Aby zapewnić normalne warunki życia komórek (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37&deg; C, nawilżany)</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu do inkubatora kultur komórkowych</td> AL <td>Sprężone gazy</td><td>UN1013</td><td>Gaz potrzebny do inkubatora do hodowli komórkowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych A (0,5 mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>Używane do kohodowli EC-CM</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych B (1,0 mm)</td><td>Millicell Millipore</td><td>PIHP01250</td><td>Używane do kohodowli EC-CM</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych C (2,0 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td> Używane do wirówki do <td>współhodowli EC-CM</td></tr><tr><td></td><td>Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>Do powlekania i pasażowania kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych CMs T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>Używane do regularnej hodowli CMs, powlekane przez producenta</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Medium Complete</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>CMs culture complete medium</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Medium Complete bez fenolu</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>Pożywka hodowlana CMs bez czerwieni fenolowej używana podczas pomiaru LDH</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Plates 96 dobrze</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96well</td><td>Używany do eksperymentów pomiaru LDH, pokryty przez producenta</td></tr><tr><td>CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>CMs hodowla komórek w stanie niedotlenienia (bez glukozy i surowicy)</td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Szkiełka zliczające używane do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C20301</td><td>Zestaw do pomiaru LDH</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych EC T25</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB012935</td><td>Używany do regularnych hodowli</td></tr><tr><td>EC ECs Pożywka do hodowli komórkowych Complete</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168</td><td>ECs Culture Complete</td></tr><tr><td>ECs Pożywka do hodowli komórkowych Kompletna pożywka bez fenolu</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168PF</td><td>ECs pożywka hodowlana bez czerwieni fenolowej używana podczas pomiaru LDH</td></tr><tr><td>ECs Cell Culture Plates 96-dołkowa</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>Używana do eksperymentów z LDH pomiar</td></tr><tr><td>ECs Culture Roztwór do powlekania na bazie żelatyny</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td><td>Stosowany do powlekania kolb i płytek do ECs</td></tr><tr><td>ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>GPF1168</td><td>Hodowla komórek EC w warunkach niedotlenienia (bez glukozy i surowicy)</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>FBS-HI zatwierdzony przez USDA do hodowli i utrzymania komórek</td></tr><tr><td>Komora hipoksyjna</td><td>StemCell Technologies</td><td>27310</td><td>Aby stworzyć stan niedotlenienia w środowisku 0,01% O2</td></tr><tr><td>Przepływomierz w komorze hipoksji</td><td>StemCell Technologies</td><td>27311</td><td>Do połączenia ze zbiornikiem gazu hipoksyjnego w celu uzyskania stałej prędkości przepływu gazu</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu hipoksycznego (butla 0,01% O2)</td><td>A-L Sprężone gazy</td><td>UN1956</td><td>Służy do płukania podłoża hipoksyjnego i komory (0,01%O2/5% CO2/94,99N2)</td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Do obserwacji stanu komórek</td></tr><tr><td>Mysz Pierwotne komórki śródbłonka tętnicy wieńcowej (EC)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>Izolowany z tętnicy wieńcowej myszy C57BL / 6</td></tr><tr><td>NUNC 15ML CONICL Probówki Fisher</td><td>Scientific</td><td>12565269</td><td>Do procesu hodowli komórek, eksperymentów, przygotowania roztworu itp.</td></tr><tr><td>Probówki CONICL NUNC 50ML</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>Do procesu hodowli komórkowych, eksperymentów, przygotowania roztworów itp.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Służy do mycia komórek podczas hodowli lub eksperymentów</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek Instrument 11120533</td><td></td><td>Kolorymetryczny lub fluorometryczny odczyt płytek</td></tr><tr><td>Reakcja 96 Well Palte (przezroczysty bez pokrywy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>Używany do odczytu płytki pomiarowej LDH</td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA dla CMs</td><td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td><td>1 x sterylny filtr i testowany na kulturach tkankowych</td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA dla ECs</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td><td>0,25%, testowany na nacięciu komórek</td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Reperfuzja powoduje dodatkowe obrażenia poza niedokrwieniem. Komórki śródbłonka (EC) mogą chronić kardiomiocyty (CM) przed uszkodzeniem reperfuzyjnym w wyniku interakcji komórka-komórka. Kohodowle mogą pomóc w zbadaniu roli interakcji między komórkami. Mieszana kohodowla jest najprostszym podejściem, ale jest ograniczona, ponieważ izolowane zabiegi i dalsze analizy pojedynczych typów komórek nie są wykonalne. Aby zbadać, czy EC mogą w zależności od dawki osłabiać uszkodzenia komórek CM i czy tę ochronę można dodatkowo zoptymalizować poprzez zmianę odległości kontaktu między dwiema liniami komórkowymi, użyliśmy mysich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic wieńcowych i kardiomiocytów dorosłych myszy do przetestowania trzech typów wkładek do hodowli komórkowych, które różniły się odległością warstwy międzykomórkowej na poziomie 0,5, odpowiednio 1,0 i 2,0 mm. Tylko w CM uszkodzenie komórek oceniane na podstawie uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) znacznie wzrosło podczas niedotlenienia i dalej po ponownym dotlenieniu, gdy odległość wynosiła 2,0 mm w porównaniu z 0,5 i 1,0 mm. Gdy EC i CM były w prawie bezpośrednim kontakcie (0,5 mm), nastąpiło tylko łagodne osłabienie uszkodzenia reoksygenacyjnego CM po niedotlenieniu. Tłumienie to było znacznie zwiększone, gdy odległość przestrzenna wynosiła 1,0 mm. Przy odległości 2,0 mm EC tłumiły uszkodzenia CM zarówno podczas niedotlenienia, jak i niedotlenienia/reoksygenacji, co wskazuje, że konieczne jest wystarczające zachowanie dystansu hodowli, aby EC mogły komunikować się z CM, tak aby wydzielane cząsteczki sygnałowe mogły krążyć i w pełni stymulować szlaki ochronne. Nasze odkrycia sugerują po raz pierwszy, że optymalizacja środowiska przestrzennego kokultury EC/CM jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli EC w ochronie przed CM przed symulowanym uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym. Celem tego raportu jest przedstawienie badaczom podejścia krok po kroku, aby mogli wykorzystać ten ważny model na swoją korzyść.

Wszystkie trzy rodzaje wkładów (A, B, C) wykorzystanych w tym doświadczeniu mają taką samą wielkość porów wynoszącą 0.4 µm. Jedyną różnicą między nimi jest wysokość od wkładu do podstawy, co pozwala na uzyskanie odległości między dwiema współhodowanymi warstwami komórek wynoszących odpowiednio 0.5, 1.0 i 2.0 mm (Rysunek 3), a ponadto pochodzą one od różnych dostawców (szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów).
Aby stworzyć model kokultury in...

Dystans przestrzenny jest kluczowym parametrem w ocenie uszkodzenia spowodowanego niedotlenieniem/reoksygenacją w modelu kokulturowym oddzielnych warstw komórek śródbłonka i kardiomiocytów, sugerując po raz pierwszy, że optymalizacja środowiska przestrzennego wspólnej hodowli jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli komórek śródbłonka w ochronie kardiomiocytów.

Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Nasze odkrycie sugeruje, że optymalizacja środowiska przestrzennego wspólnej hodowli kardiomiocytów komórek śródbłonka jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli komórek śródbłonka w ochronie kardiomiocytów przed symulowanym uszkodzeniem reprofuzyjnym niedokrwiennym. Modele kohodowli komórkowych są szeroko wykorzystywane do badania roli interakcji komórka-komórka na funkcję i różnicowanie komórek. Jednak oddzielne traktowanie różnych typów komórek i dalsza analiza pojedynczego typu komórek nie są łatwo wykonalne w mieszanej kokulturze.Obecne badanie miało na celu stworzenie dwóch oddzielnych warstw komórkowych ze znaczącą odległością między nimi, w których można wywołać uszkodzenie reprofuzyjne spowodowane niedotlenieniem oraz zbadanie wyniku i wpływu na pojedynczy typ komórek. Przygotowanie należy rozpocząć od rozmrożenia obu linii komórkowych. Umieścić komórki w kolbach T25 po umyciu ich świeżą pożywką.Następnego dnia odśwież komórki pożywką i użyj, gdy się zlewają. Utrzymuj inkubator kultur komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 21% tlenu, 5% dwutlenku węgla i 74% azotu. Utrzymuj go w stanie nawilżenia.Oszacuj zbieg linii komórkowych kardiomiocytów pod mikroskopem świetlnym. Usunąć pożywkę z kolb zawierających zbiegające się kultury komórkowe i trypsynizować trzema do pięciu mililitrami trypsyny-EDTA na kolbę. Delikatnie wymieszać kolbę i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut.Następnie oceń postęp enzymatyczny pod mikroskopem świetlnym. Po odłączeniu dezaktywować roztwór trypsyny, dodając trysynę lub roztwór komórkowy do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki na kolbę T25. Odwirować zawiesinę komórek o sile 120 x g przez dwie minuty, aby uzyskać osad o miękkich komórkach.Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki. Następnie wykonaj zliczanie komórek i potwierdź ich żywotność. Wymieszaj i podwielokrotn 10 mikrolitrów zawieszonych komórek i 10 mikrolitrów niebieskiego barwnika trypanowego, a następnie policz żywe komórki za pomocą licznika komórek.Rozcieńczyć komórki świeżymi, regularnymi pożywkami, aby osiągnąć pożądaną gęstość wysiewu. Weź 24-dołkową płytkę, wstępnie pokryj ją macierzą zewnątrzkomórkową i płytkuj kardiomiocyty o gęstości wysiewu 300 000 na dołek na dnie płytki. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.Po 24 godzinach umieść komórki śródbłonka we wkładkach z optymalną gęstością posiewu wynoszącą 100 000 na wkładkę. Po 24 godzinach powlekania komórek śródbłonka umieść wkładki komórek śródbłonka w studzienkach kardiomiocytów i rozpocznij kohodowlę. Pozwól komórkom na wspólną hodowlę przez 12 do 24 godzin przed wykonaniem eksperymentów.Przygotuj podłoże hipoksyjne, wlewając około 25 mililitrów pożywki do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Uszczelnij górną część membraną silikonową i użyj wysterylizowanej pipety, aby wybić otwór. Następnie utwórz kolejny otwór i pozostaw około 2/3 pipet zanurzonych w pożywce.Przepłukiwać pożywkę hipoksycznym gazem przez pięć minut z natężeniem przepływu 30 litrów na minutę, a następnie wyrzucić pożywkę z 24-dołkowych płytek lub wkładek hodowlanych zawierających przyłączone komórki. Umyj je bardzo delikatnie 100 mikrolitrami 10% PBS na studzienkę, dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej pożywki hipoksyjnej do każdej studzienki płytek lub wkładek. Zastąp oryginalną pożywkę świeżą, normalną pożywką zawierającą glukozę i surowicę w normoksyjnej grupie kontrolnej.Umieść szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą w komorze hipoksji, aby nawilżyć komorę. Następnie umieść płytki zawierające grupy hipoksyjne w komorze. Przepłukać komorę hipoksji gazem hipoksyjnym przez pięć minut przy przepływie 30 litrów na minutę.Następnie umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Po niedotlenieniu wyrzuć stare podłoża z płytek lub wkładek i dodaj 500 mikrolitrów normalnej pożywki zawierającej glukozę i surowicę do każdej ścianki płytki, a następnie przechowuj płytki w inkubatorze w normalnych warunkach hodowli przez dwie godziny, aby naśladować reperfuzję. Przenieś pożywkę do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej do płytki 96-dołkowej, a następnie weź 200 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki płytki 24-dołkowej i równomiernie rozprowadź do czterech dołków płytki 96-dołkowej.Zmierz absorbancję LDH za pomocą zestawu do oznaczania cytotoksyczności na 96-dołkowej płytce i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić stopień uszkodzenia komórek. W tym badaniu oceniano trzy rodzaje wkładek. Wszystkie trzy wkładki miały ten sam rozmiar porów wynoszący 0,4 mikrometra.Jedyną różnicą między nimi była wysokość wkładki do podstawy, dzięki czemu odległości między dwiema współhodowanymi warstwami komórek wynosiły 0,5, 1,0 i 2,0 milimetra. Korzystając z tego protokołu, komórki hodowano w normalnych warunkach tlenowych, a następnie podzielono na dwie grupy: normoksyjną grupę kontrolną i grupę niedotlenioną. Po 24 godzinach obie grupy odświeżyno pożywką i hodowano w normalnych warunkach tlenowych przez kolejne dwie godziny przed przeprowadzeniem testów końcowych.Porównanie trzech typów wkładów hodowlanych w ocenie uwalniania dehydrogenazy mleczanowej dla samych kardiomiocytów, samych komórek śródbłonka i kohodowli kardiomiocytów z komórkami śródbłonka przedstawiono tutaj w warunkach normoksyjnych, tylko hipoksji i niedotlenienia. Przy odległości 0,5 milimetra między warstwami komórek, niedotlenienie doprowadziło do znacznie zwiększonego uwalniania LDH w porównaniu z normoksją, gdy kardiomiocyty były hodowane samodzielnie. Jednak LDH był tylko nieznacznie zwiększony w grupie reoksygenacji w porównaniu z grupą tylko niedotlenioną.Gdy komórki śródbłonka i kardiomiocyty były hodowane razem, wzrost uwalniania LDH w warunkach tylko niedotlenienia nie był osłabiony. Wskazuje to, że komórki śródbłonka nie miały żadnego działania ochronnego w porównaniu z grupą samych kardiomiocytów w warunkach tylko niedotlenienia. Jednak komórki śródbłonka wywierały łagodną, ale znaczącą ochronę na kardiomiocyty podczas HR. Gdy odległość między warstwami komórek wynosiła jeden milimetr, uwalnianie LDH było również znacznie zwiększone w kardiomiocytach tylko w warunkach niedotlenienia.Jednak w przeciwieństwie do wkładki 0,5 milimetra, wzrost LDH w kardiomiocytach był nasilany przez HR w warunkach tylko niedotlenienia. Wzrost ten był jeszcze bardziej wyraźny w przypadku wkładki o długości dwóch milimetrów. Stężenie komórek śródbłonka posianych w dwumilimetrowych wkładkach miareczkowano odpowiednio do 25 000, 50 000 i 100 000 komórek na wkładkę.stwierdzono, że zwiększenie intensywności komórek śródbłonka w kohodowli prowadziło do zależnego od dawki osłabienia uwalniania LDH spowodowanego HR. Jednak takiego efektu nie zaobserwowano w warunkach normoksyjnych. Ta metodologia kohodowli nie ogranicza się do komórek śródbłonka i kardiomiocytów. Metody te powinny pomóc w badaniu specyficznych interakcji komórka-komórka między różnymi liniami komórkowymi w wielu narządach będących przedmiotem zainteresowania.

development-cell-co-culture-model-to-mimic-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy sposób przygotowania modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro oraz metodę oceny wpływu terapii komórkami macierzystymi na komórki serca po niedokrwieniu.

Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Prezentujemy model choroby niedokrwiennej serca za pomocą kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, wraz z metodą ilościowej oceny uszkodzeń tkanek spowodowanych niedokrwieniem. Model ten może stanowić użyteczną platformę do badań przesiewowych leków i dalszych badań nad chorobą niedokrwienną serca.

Model choroby niedokrwiennej serca i porównanie wideo skurczu kardiomiocytów przy użyciu kardiomiocytów pochodzących z hiPSC

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Różne efekty różnych stopni hipotermii na ochronę mięśnia sercowego nie zostały dokładnie ocenione. Celem niniejszego badania było ilościowe określenie poziomów śmierci komórek po różnych metodach leczenia hipotermii w modelu opartym na ludzkich kardiomiocytach, kładąc podwaliny pod przyszłe dogłębne badania molekularne.

Ocena in vitro ochrony mięśnia sercowego po wstępnym kondycjonowaniu hipotermicznym w modelu ludzkich miocytów serca

Ten protokół ma na celu wytworzenie sferoid 3D serca (CS) poprzez kokulturację komórek w wiszących kroplach. CS z kolagenem są leczone doksorubicyną (DOX, środek kardiotoksyczny) w stężeniach fizjologicznych w celu modelowania niewydolności serca. Badania in vitro z wykorzystaniem CS poddanych działaniu DOX mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych terapii dla pacjentów z niewydolnością serca.

Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ten artykuł opisuje modelowanie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R) w 3-dniowym zarodku pisklęcia za pomocą dostosowanego haka do igły rdzeniowej, aby lepiej zrozumieć rozwój i leczenie I/R. Ten model jest prosty, szybki i niedrogi.

Generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Obecne badanie demonstruje wysoce powtarzalny model zwierzęcy ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u królików przy użyciu mini-torakotomii lewej dla przypadków przeżycia lub sternotomii linii środkowej dla przypadków nieprzeżytych.

Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików

Samoorganizujące się ludzkie organoidy sercowe (hCO) to nowy system modelowania rozwoju i chorób serca u człowieka. Tutaj przedstawiono metodologię generowania i urazu hCOs przy użyciu hipoksji i reoxygenacji oraz szczegóły oczekiwanych wyników histologicznych i funkcjonalnych po urazie.

Model urazu hipoksji i reoxygenacji u samoorganizujących się ludzkich kardioidów

Poznaj model kohodowli komórek sercowych do badania niedokrwienia/reperfuzji in vitro. Ta metoda pozwala ocenić ochronną rolę komórek śródbłonka względem kardiomiocytów przy kontrolowanej odległości między warstwami.

Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

Przeglądaj więcej filmów