Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

Nasze odkrycie sugeruje, że optymalizacja środowiska przestrzennego wspólnej hodowli kardiomiocytów komórek śródbłonka jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli komórek śródbłonka w ochronie kardiomiocytów przed symulowanym uszkodzeniem reprofuzyjnym niedokrwiennym. Modele kohodowli komórkowych są szeroko wykorzystywane do badania roli interakcji komórka-komórka na funkcję i różnicowanie komórek. Jednak oddzielne traktowanie różnych typów komórek i dalsza analiza pojedynczego typu komórek nie są łatwo wykonalne w mieszanej kokulturze.

Obecne badanie miało na celu stworzenie dwóch oddzielnych warstw komórkowych ze znaczącą odległością między nimi, w których można wywołać uszkodzenie reprofuzyjne spowodowane niedotlenieniem oraz zbadanie wyniku i wpływu na pojedynczy typ komórek. Przygotowanie należy rozpocząć od rozmrożenia obu linii komórkowych. Umieścić komórki w kolbach T25 po umyciu ich świeżą pożywką.

Następnego dnia odśwież komórki pożywką i użyj, gdy się zlewają. Utrzymuj inkubator kultur komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 21% tlenu, 5% dwutlenku węgla i 74% azotu. Utrzymuj go w stanie nawilżenia.

Oszacuj zbieg linii komórkowych kardiomiocytów pod mikroskopem świetlnym. Usunąć pożywkę z kolb zawierających zbiegające się kultury komórkowe i trypsynizować trzema do pięciu mililitrami trypsyny-EDTA na kolbę. Delikatnie wymieszać kolbę i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut.

Następnie oceń postęp enzymatyczny pod mikroskopem świetlnym. Po odłączeniu dezaktywować roztwór trypsyny, dodając trysynę lub roztwór komórkowy do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki na kolbę T25. Odwirować zawiesinę komórek o sile 120 x g przez dwie minuty, aby uzyskać osad o miękkich komórkach.

Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki. Następnie wykonaj zliczanie komórek i potwierdź ich żywotność. Wymieszaj i podwielokrotn 10 mikrolitrów zawieszonych komórek i 10 mikrolitrów niebieskiego barwnika trypanowego, a następnie policz żywe komórki za pomocą licznika komórek.

Rozcieńczyć komórki świeżymi, regularnymi pożywkami, aby osiągnąć pożądaną gęstość wysiewu. Weź 24-dołkową płytkę, wstępnie pokryj ją macierzą zewnątrzkomórkową i płytkuj kardiomiocyty o gęstości wysiewu 300 000 na dołek na dnie płytki. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.

Po 24 godzinach umieść komórki śródbłonka we wkładkach z optymalną gęstością posiewu wynoszącą 100 000 na wkładkę. Po 24 godzinach powlekania komórek śródbłonka umieść wkładki komórek śródbłonka w studzienkach kardiomiocytów i rozpocznij kohodowlę. Pozwól komórkom na wspólną hodowlę przez 12 do 24 godzin przed wykonaniem eksperymentów.

Przygotuj podłoże hipoksyjne, wlewając około 25 mililitrów pożywki do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Uszczelnij górną część membraną silikonową i użyj wysterylizowanej pipety, aby wybić otwór. Następnie utwórz kolejny otwór i pozostaw około 2/3 pipet zanurzonych w pożywce.

Przepłukiwać pożywkę hipoksycznym gazem przez pięć minut z natężeniem przepływu 30 litrów na minutę, a następnie wyrzucić pożywkę z 24-dołkowych płytek lub wkładek hodowlanych zawierających przyłączone komórki. Umyj je bardzo delikatnie 100 mikrolitrami 10% PBS na studzienkę, dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej pożywki hipoksyjnej do każdej studzienki płytek lub wkładek. Zastąp oryginalną pożywkę świeżą, normalną pożywką zawierającą glukozę i surowicę w normoksyjnej grupie kontrolnej.

Umieść szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą w komorze hipoksji, aby nawilżyć komorę. Następnie umieść płytki zawierające grupy hipoksyjne w komorze. Przepłukać komorę hipoksji gazem hipoksyjnym przez pięć minut przy przepływie 30 litrów na minutę.

Następnie umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Po niedotlenieniu wyrzuć stare podłoża z płytek lub wkładek i dodaj 500 mikrolitrów normalnej pożywki zawierającej glukozę i surowicę do każdej ścianki płytki, a następnie przechowuj płytki w inkubatorze w normalnych warunkach hodowli przez dwie godziny, aby naśladować reperfuzję. Przenieś pożywkę do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej do płytki 96-dołkowej, a następnie weź 200 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki płytki 24-dołkowej i równomiernie rozprowadź do czterech dołków płytki 96-dołkowej.

Zmierz absorbancję LDH za pomocą zestawu do oznaczania cytotoksyczności na 96-dołkowej płytce i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić stopień uszkodzenia komórek. W tym badaniu oceniano trzy rodzaje wkładek. Wszystkie trzy wkładki miały ten sam rozmiar porów wynoszący 0,4 mikrometra.

Jedyną różnicą między nimi była wysokość wkładki do podstawy, dzięki czemu odległości między dwiema współhodowanymi warstwami komórek wynosiły 0,5, 1,0 i 2,0 milimetra. Korzystając z tego protokołu, komórki hodowano w normalnych warunkach tlenowych, a następnie podzielono na dwie grupy: normoksyjną grupę kontrolną i grupę niedotlenioną. Po 24 godzinach obie grupy odświeżyno pożywką i hodowano w normalnych warunkach tlenowych przez kolejne dwie godziny przed przeprowadzeniem testów końcowych.

Porównanie trzech typów wkładów hodowlanych w ocenie uwalniania dehydrogenazy mleczanowej dla samych kardiomiocytów, samych komórek śródbłonka i kohodowli kardiomiocytów z komórkami śródbłonka przedstawiono tutaj w warunkach normoksyjnych, tylko hipoksji i niedotlenienia. Przy odległości 0,5 milimetra między warstwami komórek, niedotlenienie doprowadziło do znacznie zwiększonego uwalniania LDH w porównaniu z normoksją, gdy kardiomiocyty były hodowane samodzielnie. Jednak LDH był tylko nieznacznie zwiększony w grupie reoksygenacji w porównaniu z grupą tylko niedotlenioną.

Gdy komórki śródbłonka i kardiomiocyty były hodowane razem, wzrost uwalniania LDH w warunkach tylko niedotlenienia nie był osłabiony. Wskazuje to, że komórki śródbłonka nie miały żadnego działania ochronnego w porównaniu z grupą samych kardiomiocytów w warunkach tylko niedotlenienia. Jednak komórki śródbłonka wywierały łagodną, ale znaczącą ochronę na kardiomiocyty podczas HR. Gdy odległość między warstwami komórek wynosiła jeden milimetr, uwalnianie LDH było również znacznie zwiększone w kardiomiocytach tylko w warunkach niedotlenienia.

Jednak w przeciwieństwie do wkładki 0,5 milimetra, wzrost LDH w kardiomiocytach był nasilany przez HR w warunkach tylko niedotlenienia. Wzrost ten był jeszcze bardziej wyraźny w przypadku wkładki o długości dwóch milimetrów. Stężenie komórek śródbłonka posianych w dwumilimetrowych wkładkach miareczkowano odpowiednio do 25 000, 50 000 i 100 000 komórek na wkładkę.

stwierdzono, że zwiększenie intensywności komórek śródbłonka w kohodowli prowadziło do zależnego od dawki osłabienia uwalniania LDH spowodowanego HR. Jednak takiego efektu nie zaobserwowano w warunkach normoksyjnych. Ta metodologia kohodowli nie ogranicza się do komórek śródbłonka i kardiomiocytów. Metody te powinny pomóc w badaniu specyficznych interakcji komórka-komórka między różnymi liniami komórkowymi w wielu narządach będących przedmiotem zainteresowania.