Name: In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę in situ hybrydyzacji do badania ekspresji genów w larwach i młodocianych osobnikach Danio rerio podczas rozwoju mezonefrosu. Technika ta umożliwia wizualizację komórek progenitorowych nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez Pennsylvania Academy of Science, Commonwealth of Pennsylvania Biologists oraz Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology oraz Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Linia transgeniczna Tg(lhx1a-EGFP) została dostarczona przez dr Neila Hukriede (University of Pittsburgh).

Wykorzystanie larw danio pręgowanego i osobników młodocianych jest zatwierdzone przez IUP IACUC (protokół #02-1920, #08-1920). Szczegółowe informacje na temat zawartości rozwiązania znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Hodowla larw
UWAGA: Potrzeba do 21 dni lub więcej, aby doprowadzić larwy i młode osobniki do etapu zainteresowania.
<ol>
	<li>Przygotuj dorosłe ryby, aby kojarzyły się, dodając 1 samca i 1 samicę do zbiornika godowego późnym popołudniem po ostatnim posiłku. 
	UWAGA: Nie wszystkie pary ryb będą się kojarzyć. Zacznij od ustawienia 20 par, aby określić częstotliwość krycia i odpowiednio dostosować w przyszłych eksperymentach.</li>
	<li>Następnego dnia po zakończeniu krycia ryb (około godziny 13) należy zebrać zarodki z pożywką E3 na płytkach Petriego.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że na jednej płytce nie ma więcej niż 30 zarodków.</li>
		<li>Usuń zanieczyszczenia (takie jak kał) z płytek Petriego i dodaj 20 ml pożywki E3.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 28,5 °C przez 1 dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść dorosłego danio pręgowanego z powrotem w systemie wodnym.</li>
	<li>Przy 1 dpf zastąp podłoże E3 świeżym E3.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 28,5 °C jeszcze przez 4 dni, aż do osiągnięcia 5 dpf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 400 μm w zbiorniku o pojemności 2,8 l i napełnij je 2 cm wodą systemową.
	<ol>
		<li>Dodać 5 larw dpf z 1 płytki (do 30 larw ogółem).</li>
		<li>Umieść zbiornik w systemie wodnym, ale nie uruchamiaj przepływu wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawaj larwom 4 ml sproszkowanego pokarmu dwa razy dziennie do 14 dpf.</li>
	<li>Przy 6 dpf rozpocznij przepływ wody z prędkością 1 kropli na sekundę. 
	UWAGA: Codziennie sprawdzaj przepływ wody i odpowiednio dostosuj.</li>
	<li>Przy 8 dpf zwiększ przepływ wody do powolnego, stałego strumienia.</li>
	<li>W temperaturze 14 dpf oprócz karmy w proszku podawaj żywe krewetki solankowe.</li>
</ol>
2. Dzień 1 - 2: Naprawianie larw
<ol>
	<li>Usuń zbiornik larw w żądanym punkcie czasowym.</li>
	<li>Napełnij płytkę Petriego 20 ml wody systemowej.</li>
	<li>Użyj siatki o drobnych oczkach, aby delikatnie zgarnąć larwy i wynieść je na powierzchnię wody.
	<ol>
		<li>Odciąć końcówkę pipety transferowej, aby uzyskać szerszy otwór i przenieść larwy na płytkę Petriego. Większy otwór pipety pozwala na przenoszenie kilku małych larw lub kilku większych jednocześnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 2 ml tricainy (2%, bulion o pH 7), aby unieruchomić larwy.
	<ol>
		<li>Gdy larwy przestaną się poruszać, usuń większość wody i dodaj 10 ml tricainy. Odczekaj 15 minut, aż larwy zostaną poddane eutanazji.</li>
		<li>Opcjonalnie: W przypadku osobników młodocianych dłuższych niż 8 mm odciąć głowy i ogony żyletką (po eutanazji) pod mikroskopem preparacyjnym, aby poprawić penetrację roztworu utrwalającego. Upewnij się, że zapisałeś całkowitą długość każdego zwierzęcia przed odcięciem głowy i ogona i wyizoluj każde z nich na osobnej płytce Petriego. Zapoznaj się z krokiem 3, aby dowiedzieć się, jak mierzyć zwierzęta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp tricainę 20 ml roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu, 1% DMSO). Umieść pokrywkę z powrotem na szalce Petriego i powoli kołysz się w dygestorium. 
	UWAGA: Ważne jest, aby korzystać z platformy bujanej. Potrząsająca platforma o ruchu okrężnym spowoduje wygięcie osi zwierzęcia. Używaj tylko świeżego (nie wstępnie zamrożonego) roztworu utrwalającego. 
	UWAGA: Roztwór utrwalający zawiera paraformaldehyd, który jest prawdopodobnym czynnikiem rakotwórczym. Do odmierzenia proszku należy użyć dygestorium (lub maski) i rękawiczek.</li>
	<li>Po 30 minutach zastąp roztwór utrwalający świeżym roztworem utrwalającym.
	<ol>
		<li>Zużyty roztwór utrwalający należy zebrać w osobnym pojemniku na odpady w celu prawidłowej utylizacji.</li>
		<li>Przenieść larwy do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml świeżego roztworu utrwalającego.</li>
		<li>Upewnij się, że nakrętka jest szczelna i powoli kołysz się w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dzień 3: Pomiar larw
<ol>
	<li>W dygestorium zastąp roztwór utrwalający 20 ml PBST.</li>
	<li>Przenieś larwy na szalkę Petriego.</li>
	<li>Umieść płaską linijkę na mikroskopie preparacyjnym i połóż płytkę Petriego na linijce.</li>
	<li>Użyj manipulatora rzęs, aby przesunąć każdą larwę na linijkę, aby zmierzyć jej całkowitą długość (od pyska do czubka płetwy ogonowej) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Połączyć kilka larw o podobnej długości (np. 5,0 mm i 5,1 mm) w jednej szklanej fiolce o pojemności 5,5 ml, do 10 larw w każdej fiolce.</li>
</ol>
4. Dzień 3 - 4: Odwodnienie
<ol>
	<li>Zastąp PBST 4 ml 100% metanolu. Kołysz fiolką przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp metanol świeżym metanolem i kołysz się przez 5 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Przechowywać fiolkę w temperaturze -20 °C przez 2 dni. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.</li>
</ol>
5. Dzień 5: Nawodnienie
<ol>
	<li>Podgrzać fiolkę do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Zastąp metanol 4 ml 75% metanolu/25% PBST. Kołysz przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp roztwór w kroku 5.2 4 ml 50% metanolu/50% PBST i kołysz przez 5 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór w kroku 5.3 4 ml 25% metanolu/75% PBST i kołysz przez 5 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór opisany w kroku 5.4 4 ml PBST i kołysz przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
</ol>
6. Dzień 5: Trawienie proteinazy K
<ol>
	<li>Zastąp PBST 2 ml roztworu proteinazy K (20 μg/ml, 1% DMSO końcowe stężenie w PBST) i miażdż w temperaturze pokojowej przez 30 min. 
	UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm będą potrzebowały dłuższego czasu inkubacji i/lub wyższego stężenia proteinazy K. Dokładny czas i stężenie będą musiały zostać określone empirycznie. Rozpocząć od wydłużenia czasu inkubacji o 10 minut na każde 0,5 mm dłuższe niż 6 mm.</li>
	<li>Zastąp roztwór proteinazy K 4 ml PBST i kołysz się przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego roztworu utrwalającego i kołysz przez 1 godzinę. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Dzień 5: Wybielanie
<ol>
	<li>Zastąp roztwór utrwalający 4 ml PBST i miażdż w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Przenieś larwy na płytkę 6-dołkową (do 10 larw na studzienkę).</li>
	<li>Zastąp PBST 3 ml świeżego roztworu wybielającego.</li>
	<li>Kołysz w temperaturze pokojowej i monitoruj pigmentację pod mikroskopem preparacyjnym co 5 minut. Szukaj zaniku pigmentacji wzdłuż śródnercza (grzbietowo do pęcherza pławnego i jelita). 
	UWAGA: W przypadku larw o długości do 6 mm wybielenie pigmentacji otaczającej śródnerce zajmie do 20 minut. Nie wybielać dłużej niż jest to konieczne, aby zachować integralność larw.</li>
	<li>Przenieść larwy z powrotem do szklanej fiolki.</li>
	<li>Zastąp roztwór wybielający 4 ml PBST. Kołysz się przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego roztworu utrwalającego i kołysz przez 1 godzinę. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
8. Dzień 5: Prehybrydyzacja
UWAGA: W przypadku czynności wykonywanych w temperaturze 70 °C, ważne jest, aby pracować szybko, aby zminimalizować wychładzanie się fiolki.
<ol>
	<li>Zastąp roztwór utrwalający 4 ml PBST i miażdż w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml roztworu Hyb- i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 min. 
	UWAGA: Roztwory Hyb-, Hyb+ i probówki zawierają formamid, który może podrażniać skórę. Do obsługi tych roztworów należy używać rękawiczek.</li>
	<li>Zastąp Hyb- 4 ml świeżego Hyb- i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
	<ol>
		<li>Zużyte roztwory Hyb-, Hyb+ i sondy należy zebrać do oddzielnego pojemnika na odpady w celu prawidłowej utylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp Hyb- 4 ml roztworu Hyb+.</li>
	<li>Inkubować fiolkę w temperaturze 70 °C przez noc.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę EGFP-fluoresceiny w stosunku 1:100 w 500 μl Hyb+ i inkubować ją O/N w temperaturze 70 °C. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi syntezy sondy.</li>
</ol>
9. Dzień 6: Hybrydyzacja sondy
<ol>
	<li>Zastąpić roztwór Hyb+ w fiolce podgrzaną sondą i inkubować w temperaturze 70 °C przez noc. 
	UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm potrzebują 2 dni inkubacji.</li>
	<li>Podgrzej bufor do mycia, roztwory 2x SSCT i 0,2x SSCT w temperaturze 70 °C na noc.</li>
</ol>
10. Dzień 7: Mycie sondy
<ol>
	<li>Zastąpić sondę 4 ml podgrzanego buforu do przemywania i inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Zużytą sondę należy zebrać w osobnym pojemniku na odpady w celu prawidłowej utylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąpić bufor do przemywania 4 ml świeżego buforu do płukania i inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Zastąpić bufor do przemywania 4 ml podgrzanego roztworu 2x SSCT i inkubować w temperaturze 70 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 50 ml podgrzanego 0,2x SSCT do probówki o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Włóż sitko do komórek (100 μm) do górnej części probówki. Upewnij się, że sitko do komórek jest wciśnięte do końca, aż się zatrzyma.</li>
		<li>Przenieść larwy ze szklanej fiolki do sitka do komórek. Upewnić się, że larwy są zanurzone w buforze i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować nową probówkę zawierającą 50 ml podgrzanego 0,2x SSCT.
	<ol>
		<li>Przenieść sitko komórkowe z kroku 10.4.2 do nowej probówki 0,2x SSCT i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Powtórz krok 10.5 jeszcze raz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. Dzień 7: Blokowanie
<ol>
	<li>Przenieść larwy do nowej szklanej fiolki i schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Zastąp 0,2x SSCT 4 ml 67% 0,2x SSCT/33% MABT i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór w kroku 11.2 4 ml 33% 0,2x SSCT/67% MABT i kołysz przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór w kroku 11.3 4 ml MABT i kołysz przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp MABT 4 ml świeżego MABT i rock przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Zastąpić MABT 4 ml roztworu blokującego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.</li>
</ol>
12. Dzień 8 - 9: Inkubacja przeciwciał
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało antyfluoresceinowe w stosunku 1:5 000 w 500 μl roztworu blokującego.</li>
	<li>Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.
	<ol>
		<li>Obracać fiolkę dwa razy dziennie w celu poruszenia larw. 
		UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm potrzebują jeszcze 1-2 dni inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
13. Dzień 10 - 11: Mycie przeciwciał
<ol>
	<li>Zastąp roztwór przeciwciała 4 ml PBST i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Przenieś larwy do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 40 ml PBST2. Połóż probówkę na boku i kołysz się w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Zastąp PBST2 40 ml świeżego PBST2 i kołysz w temperaturze 4 °C przez noc. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja. 
	UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm potrzebują jeszcze 1-2 dni mycia.</li>
</ol>
14. Dzień 12: Barwienie
<ol>
	<li>Przenieś larwy na płytkę 6-dołkową.</li>
	<li>Zastąp PBST2 3 ml buforu barwiącego i rozbujaj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zastąp bufor barwiący 3 ml świeżego buforu barwiącego i rozbujaj przez 5 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Zastąp bufor barwiący 3 ml roztworu barwiącego. Przykryj folią aluminiową i monitoruj plamy przez kilka następnych godzin.
	<ol>
		<li>W przypadku sond o słabym sygnale, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc i raz w międzyczasie zastąpić roztwór barwiący świeżym roztworem barwiącym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia zastąp roztwór barwiący 3 ml roztworu zatrzymującego i kołysz przez 30 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór zatrzymujący 3 ml świeżego roztworu zatrzymującego i kołysz przez 30 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Przenieść larwy do nowej szklanej fiolki i zastąpić roztwór zatrzymujący 4 ml świeżego roztworu utrwalającego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Larwy należy przechowywać w roztworze utrwalającym w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do roku.</li>
</ol>
15. Dzień 12: Obrazowanie
<ol>
	<li>Zastąp roztwór utrwalający 4 ml PBST i miażdż w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś larwy na płytkę 6-dołkową.</li>
	<li>Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Zastąp PBST 3 ml 50% glicerolu (w PBST) i kołysz się przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór w kroku 15.4 3 ml 100% glicerolu bez kołysania przez 10 minut.</li>
	<li>Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zobrazować larwy bezpośrednio w 6-dołkowej płytce lub przenieś larwy do szkiełka wgłębieniowego, aby zobrazować pod mikroskopem złożonym. Użyj manipulatora rzęs, aby zorientować larwy.</li>
</ol>

<ol><li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+zebrafish+research%3A+a+global+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li>
<li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+pronephros%3A+a+model+to+study+nephron+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li>
<li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+development%3A+basic+science+to+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li>
<li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+early+kidney+specification%2C+development+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845(2011).</li>
<li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li>
<li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li>
<li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+mesonephros%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li>
<li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiep%2C+CQ+%22The+Zebrafish+in+Biomedical+Research%3A+Biology%2C+Husbandry%2C+Diseases%2C+and+Research+Applications%22">The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications</a>. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).</li>
<li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Homeobox+4+%28lhx4%29+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977(2021).</li>
<li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167(2020).</li>
<li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li>
<li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li>
<li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisana tutaj metoda hybrydyzacji in situ ma na celu badanie rozwoju mesonephros. Można go jednak zastosować do badania rozwoju innych tkanek i narządów podczas metamorfozy, takich jak jelita, układ nerwowy, łuski i pigmentacja14. Można generować sondy dla genów endogennych lub markerów fluorescencyjnych w liniach transgenicznych.
Bardzo ważne jest, aby larwy pozostały nienaruszone, aby można było obserwować narządy i tkanki w ich naturalnym kontekście. Aby zac...

Zarodek danio pręgowanego jest ważnym modelem do badania rozwoju tkanek ze względu na jego mały rozmiar, przezroczystość, dostępne narzędzia i możliwość przetrwania bez karmienia przez okres do pięciu dni1,2. Znacząco przyczynił się do zrozumienia rozwoju nerek i ochrony między danio pręgowanym a ssakami3,4,5. Nerki odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, filtrowaniu krwi i wydalaniu odpadów6. Nefron, jednostka funkcjonalna nerki, składa się z filtra krwi połączonego z długim kanalikiem. U danio pręgowanego przez całe życie tworzą się dwie struktury nerkowe. Przednercze (tymczasowa nerka embrionalna) tworzy się jako pierwsze we wczesnym okresie rozwoju. Składa się z dwóch nefronów biegnących wzdłuż osi przednio-tylnej i staje się funkcjonalny po około 2 dniach od zapłodnienia (dpf). Użyteczność przednercza polega na jego prostocie, ma tylko dwa nefrony, które są w większości liniowe i łatwe do wizualizacji (chociaż bliższy kanalik kręty zaczyna się zwijać przy trzech dpf)3. Ułatwiło to nie tylko badania nad jego wczesnym rozwojem od mezodermy pośredniej, ale także nad wzorcem segmentacji i naprawą kanalików7,8.
Użyteczność zebry staje się ograniczona po pięciu dpf, kiedy żółtko jest zmniejszone, a larwy polegają na żerowaniu w systemie wodnym9. W wieku około 2 tygodni larwy przechodzą metamorfozę w młode, gdzie tworzą się nowe tkanki, a stare tkanki są tracone i/lub reorganizowane9. Jest to również moment, w którym tworzy się mesonephros (stała dorosła nerka) class<="xref">10,11,12. Pierwszy dorosły nefron tworzy się w pobliżu szóstego somitu i łączy się z dystalnym wczesnym kanalikiem przednercza. Dodatkowe nefrony są początkowo dodawane z tyłu tej pozycji, ale później także w kierunku przedniej. Pierwotne nefrony w tej pierwszej fali łączą się z kanalikami przednerczy i dzielą wspólne światło, aby zdeponować swoje odpady. Nefrony wtórne tworzą się w następnej fali i łączą się z nefronami pierwotnymi. Ten powtarzający się proces tworzy mesonephros, który jest rozgałęziony, nieco podobny do nerki ssaków. Przypuszczalnie przednercze ostatecznie traci swoją tożsamość kanalików i staje się dwoma głównymi kanałami zbiorczymi, w których wszystkie nefrony odprowadzają swoje odpady13.
Przed powstaniem pierwszego dorosłego nefronu, pojedyncze komórki progenitorowe zaczynają pojawiać się w larwach ~4 mm (całkowitej długości) (~10 dpf). Komórki te, które są oznaczone w linii transgenicznej Tg(lhx1a-EGFP), przylegają do przednerczy i wydają się migrować do przyszłych miejsc nefrogenezy. Pojedyncze komórki łączą się w klastry, które różnicują się w nowe nefrony12. Nie jest jasne, gdzie znajdują się te komórki ani jakie geny wyrażają przed rozpoczęciem mezonfrogenezy.
Zrozumienie rozwoju mesonephros dostarcza wglądu w nerki ssaków w sposób, w jaki nie mogą tego zrobić przednercze. Obejmują one tworzenie agregatów nefrogennych z pojedynczych komórek progenitorowych, funkcjonalną integrację nowych nefronów z istniejącymi oraz rozgałęziającą się morfogenezę. Istnieją jednak ograniczenia w badaniu rozwoju postembrionalnego. Larwy są mniej przezroczyste ze względu na większy rozmiar i pigmentację. Oś czasu rozwoju nie jest synchroniczna między poszczególnymi zwierzętami i jest silnie zależna od czynników środowiskowych, takich jak karmienie i zatłoczenie9,14. Chociaż istnieją odczynniki knockdown, są one mniej skuteczne u larw w porównaniu do embryos15. W tym protokole opisano metodę hybrydyzacji in situ w celu określenia ekspresji genów podczas rozwoju mesonephros danio pręgowanego. Zoptymalizowano kilka kroków w celu zwiększenia wizualizacji śródnercza oraz penetracji i mycia sondy i przeciwciała. Linia transgeniczna Tg (lhx1a-EGFP) jest używana wraz z sondą do EGFP do znakowania pojedynczych komórek progenitorowych, agregatów nefrogennych i dystalnych kanalików powstających nefronów. Metoda ta zapewni głębsze zrozumienie rozwoju śródnerki i wgląd w terapie regeneracyjne.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało antyfluoresceinowe</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> wybielający <td>0,8% KOH, 0,9% H2O2 w PBST</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Stosować do roztworu blokującego, przygotować zgodnie z instrukcją producenta</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 22-363-549</td><td>100 &mu; m</td></tr><tr><td>E3 medium</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001% błękit metylenowy</td></tr><tr><td>Manipulator rzęs</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1083208</td><td>Służy do manipulowania larwami</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> utrwalający <td>4% paraformaldehydu, 1% DMSO w PBS; ciepło w 65&deg; C wstrząsając, aż proszek się rozpuści, a następnie dodać DMSO po ostygnięciu</td></tr><tr><td>Synteza sondy fluoresceinowej</td><td>Che/Sigma-Aldrich</td><td>11685619910</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka szklana</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr><tr><td>Kapsułka Hatchfry</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyb- roztwór</td><td></td><td></td><td>50% formamidu, 5X SSC, 0,1% roztwór</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Tween-20 Hyb+</td><td>HYB-, 5 mg/ml torula RNA, 50 ug/ml heparyny</td></tr><tr><td>MAB (10X)</td><td></td><td></td><td>1 M kwas maleinowy, 1,5 M NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>1X MAB, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td></td><td></td><td>8% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBST2</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,2% Tween-20</td></tr><tr><td>Żywność</td><td></td><td></td> w proszku <td>Wymieszaj po 2 g spiruliny i enkapsulonu hatchfry w 50 ml wody z systemu rybnego i dobrze wstrząśnij</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5568</td><td>Służy do przepuszczalności larw</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> <td>proteinazy K20&nbsp; &mu; g / mL, 1% DMSO końcowe stężenie w PBST</td></tr><tr><td>Spirulina mikrodrobny proszek</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 0,3 M octan sodu bezwodny, pH 7, autoklaw</td></tr><tr><td>SSCT (0,2X)</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony od 20X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (2X)</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony od 20X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> <td>barwiący100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>barwiący</td><td>200 &mu; g/ml chlorek jodonitrotetrazolu, 200 &mu; g/ml soli disodowej fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu, w buforze barwiącym</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> zatrzymujący <td>1 mM EDTA, pH 5,5, w PBST</td></tr><tr><td>Torula (drożdże) RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>2%, pH 7</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>50% formamidu, 2X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr></tbody></table>

in situ hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Danio pręgowany tworzy dwie struktury nerkowe w ciągu swojego życia. Nercze (nerka zarodkowa) tworzy się podczas rozwoju embrionalnego i zaczyna funkcjonować po 2 dniach od zapłodnienia. Składa się tylko z dwóch nefronów, przednercze służy jako jedyna nerka podczas życia larwalnego, dopóki nie będzie wymagana większa funkcja nerek ze względu na rosnącą masę ciała. Aby poradzić sobie z tym wyższym zapotrzebowaniem, mesonephros (dorosła nerka) zaczyna tworzyć się podczas metamorfozy. Nowe nefrony pierwotne łączą się z przednerczymi i tworzą połączone światła. Następnie nefrony wtórne łączą się z pierwotnymi (i tak dalej), tworząc rozgałęziającą się sieć w mezonach. Zdecydowana większość badań koncentruje się na przednerczach ze względu na łatwość wykorzystania zarodków. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania technik badania starszych i większych larw oraz młodych ryb, aby lepiej zrozumieć rozwój mesonephros. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ do analizy ekspresji genów jest zoptymalizowany pod kątem penetracji sondy, mycia sond i przeciwciał oraz wybielania pigmentów w celu lepszej wizualizacji śródnercza. Linia transgeniczna Tg (lhx1a-EGFP) służy do znakowania komórek progenitorowych i dystalnych kanalików powstających nefronów. Protokół ten wypełnia lukę w badaniach nad mesonephros. Jest to kluczowy model pozwalający zrozumieć, w jaki sposób powstają nowe tkanki nerkowe i integruje się z istniejącymi nefronami, a także dostarcza informacji na temat terapii regeneracyjnych.

Wykorzystując linię transgeniczną Tg(lhx1a-EGFP) wykazano, że niniejszy protokół hybrydyzacji in situ jest skuteczny w znakowaniu komórek progenitorowych nerek oraz różnych struktur nefronu podczas rozwoju mezonephros. Zgodnie z oczekiwaniami, w tej linii transgenicznej znakowany jest również ośrodkowy układ nerwowy (niepokażano). Pierwszy nefron mezonephros tworzy się przy długości około 5,2 mm, grzbietowo względem pronephros (Rycina 2A), a cewka dystalna tego nefronu jest...

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na określenie ekspresji genów u starszych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas metamorfozy. Zaletą tej techniki jest to, że kilka kroków zostało zoptymalizowanych pod kątem penetracji sondy i wizualizacji nerki. Na początek przygotuj dorosłe rybo danio pręgowane do krycia, dodając jednego samca i jedną samicę do zbiornika godowego późnym popołudniem po ostatnim posiłku.Następnego dnia należy zebrać zarodki na płytkach Petriego zawierających pożywkę E3. Pięć dni po zapłodnieniu umieść sitko o średnicy 400 mikrometrów w zbiorniku o pojemności 2,8 litra i napełnij je 2 centymetrami wody systemowej. Następnie dodaj larwę z jednej płytki Petriego.Aby naprawić larwę, wyjmij zbiornik z larwą w żądanym punkcie czasowym, a następnie, za pomocą siatki i przenieś pipetę z odciętą końcówką, przenieś larwę na płytkę Petriego. Następnie dodaj dwa mililitry 2% trikainy, aby unieruchomić larwę. Po unieruchomieniu zastąp tricainę 20 mililitrami roztworu utrwalającego.Po 30 minutach przenieś larwę do 50-mililitrowej probówki zawierającej 25 mililitrów świeżego roztworu utrwalającego. Następnie, upewniając się, że nakrętka jest szczelna, powoli kołysz rurką w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni. Trzeciego dnia zastąp roztwór utrwalający 20 mililitrami PBST, a następnie przenieś larwę na szalkę Petriego.Aby zmierzyć larwę, umieść płytkę Petriego na płaskiej linijce pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie za pomocą manipulatora rzęs przesuń każdą larwę na linijkę, aby zmierzyć jej całkowitą długość. Po zmierzeniu wszystkich larw połącz kilka larw o podobnej długości na jednej 5,5-mililitrowej szklanej fiolce z PBST. W celu odwodnienia zastąp PBST w szklanej fiolce czterema mililitrami 100% metanolu, a następnie przechowuj fiolkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwa dni.W celu nawodnienia zastąp 100% metanol czterema mililitrami 75% roztworu metanolu i 25% PBST i kołysz fiolką przez pięć minut. Następnie zastąp metanol i roztwór PBST czterema mililitrami świeżego PBST i ponownie kołysz fiolką przez 10 minut. W celu roztrawienia proteinazy K zastąp PBST dwoma mililitrami roztworu proteinazy K i kołysz fiolkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie, w celu wybielenia, przenieś larwę na sześciodołkową płytkę i zastąp PBST trzema mililitrami świeżego roztworu wybielającego. Po całkowitym zaniku pigmentacji wzdłuż śródnercza przenieś larwę z powrotem do szklanej fiolki, zastąp roztwór wybielający czterema mililitrami PBST i kołysz fiolką przez 10 minut. W celu wstępnej hybrydyzacji zastąp roztwór utrwalający czterema mililitrami PBST i kołysz fiolką przez 10 minut, a następnie zastąp PBST czterema mililitrami roztworu Hyb i kołysz przez 10 minut.Po dwóch dodatkowych inkubacjach w roztworze Hyb, zastąp roztwór czterema mililitrami roztworu Hyb+. Jednocześnie rozcieńczyć sondę fluoresceiny EGFP od jednego do 100 na 500 mikrolitrów roztworu hybrydyzacji plus i inkubować fiolkę i sondę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, aby zhybrydyzować sondę, zastąp roztwór Hyb+ w fiolce podgrzaną sondą i inkubuj w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia dodaj 50 mililitrów podgrzanego 0,2 razy SSCT do 50-mililitrowej probówki. Następnie włóż sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów do górnej części probówki, przenieś larwę ze szklanej fiolki do sitka do komórek i upewniając się, że larwa jest zanurzona w buforze, inkubuj fiolkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji przenieść sitko komórkowe do nowej probówki zawierającej wstępnie podgrzane 0,2 razy SSCT i ponownie inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Następnie, w celu zablokowania, przenieś larwę do nowej szklanej fiolki i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie zastąp 0,2-krotny roztwór SSCT czterema mililitrami 67%0,2-krotnego roztworu SSCT i 33% MABT i kołysz fiolką w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie zastąp roztwór SSCTT MABT czterema mililitrami świeżego MABT i inkubuj fiolkę na wahaczu przez 10 minut.Następnie zastąp MABT czterema mililitrami roztworu blokującego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp roztwór blokujący roztworem przeciwciała i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni. W celu przemycia przeciwciał przenieś larwę do 50-mililitrowej probówki, następnie dodaj 40 mililitrów PBST2 i połóż probówkę leżąc na boku do nocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W 12 dniu, po przeniesieniu lawy na płytkę sześciodołkową, zastąp PBST2 trzema mililitrami buforu barwiącego. Po pięciominutowej inkubacji na kołysce zastąp bufor barwiący trzema mililitrami roztworu barwiącego. Po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia zastąp roztwór barwiący trzema mililitrami roztworu zatrzymującego i kołysz przez 30 minut.Następnie przenieś larwę do nowej szklanej fiolki, zastąp roztwór zatrzymujący czterema mililitrami świeżego roztworu utrwalającego i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Do obrazowania zastąp roztwór utrwalający czterema mililitrami świeżego PBST. Po 10-minutowej inkubacji na kołysce przenieś larwę na sześciodołkową płytkę, a następnie zastąp PBST czterema mililitrami świeżego PBST i ponownie kołysz płytką przez 10 minut.Następnie dodaj trzy mililitry 50% glicerolu do PBST i kołysz przez 10 minut, a następnie, za pomocą mikroskopu preparacyjnego, zobrazuj larwę bezpośrednio w sześciodołkowej płytce. Ten protokół hybrydyzacji in situ skutecznie znakuje komórki progenitorowe nerek i różne struktury nefronów za pomocą rozwoju mesonephros. Początkowy nefron mezonfryczny tworzy się na wysokości około 5,2 milimetra grzbietu do przednercza.Skupiska komórek progenitorowych są obecne podczas rozwoju śródnercza oprócz pojedynczych komórek progenitorowych. U większych osobników młodocianych w somitach może wystąpić barwienie tła. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana do badania innych tkanek, które tworzą się podczas metamorfozy, oprócz wypreparowanych narządów dorosłych.

in-situ-hybridization-zebrafish-larvae-juveniles-during-mesonephros

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Poznaj zoptymalizowaną metodę in situ hybrydyzacji do badania ekspresji genów w larwach i młodocianych osobnikach Danio rerio podczas rozwoju mezonefrosu. Technika ta umożliwia wizualizację komórek progenitorowych nerek.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Przeglądaj więcej filmów