Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne czterech typów komórek odpornościowych endometrium w nawracających poronieniach
4 sierpnia 2021
Pomimo postępów w immunohistochemii multipleksowej i obrazowaniu wielospektralnym, scharakteryzowanie gęstości i grupowania głównych komórek odpornościowych jednocześnie w endometrium pozostaje wyzwaniem. W artykule opisano szczegółowy protokół barwienia multipleksowego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji czterech typów komórek odpornościowych w endometrium.
Obecna technologia pozwala na wykorzystanie przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku do wykrywania do siedmiu markerów. Procedurę zademonstruje Loucia Chan, technik z laboratorium. Rozpocznij od przygotowania szkiełek szklanych z zatopioną parafiną utrwaloną w formalinie, zamontowanych z próbką tkanki, umieszczając szkiełka płasko w piekarniku, do pieczenia w temperaturze 60 stopni Celsjusza z chusteczką skierowaną do góry.
Po godzinie odwoskuj i ponownie nawodnij szkiełka po 10 minut za pomocą serii chemikaliów, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Zanurzyć szkiełka w soli fizjologicznej buforowanej tris, a następnie w plastikowym pudełku na szkiełka wypełnionym mieszaniną formaldehydu rozcieńczonego w metanolu, w celu utrwalenia próbek. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie w wodzie dejonizowanej przez dwie minuty.
Przejdź do pobierania epitopów, umieszczając stojak szkiełek w żaroodpornym pudełku wypełnionym buforem kwasu cytrynowego o pH 6,0. A następnie umieszczając pudełko w kuchence mikrofalowej, aby najpierw podgrzać szkiełka przy 100% mocy przez 50 sekund, a następnie 20 minut przy 20% mocy, aby utrzymać tę samą temperaturę. Po wypłukaniu szkiełek w wodzie destylowanej i umyciu TBST, zanurzyć szkiełko w słoiku zawierającym roztwór blokujący peroksydację na 10 minut.
Po inkubacji przepłukać szkiełka w wodzie destylowanej i przemyć TBST, a następnie użyć hydrofobowego pisaka barierowego, aby zaznaczyć granicę wokół części tkanki na szkiełku. Następnie przepłukać szkiełko w TBST, przykryć skrawki tkanki buforem blokującym i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 15 minut. Aby usunąć odczynniki blokujące, najpierw inkubuj szkiełka z badanym przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie usuń przeciwciało pierwszorzędowe, trzykrotnie przemłukując szkiełka TBST, przed inkubacją z polimerem znakowanym peroksydazą chrzanową, przeciwciałem drugorzędowym.
Po inkubacji umyć szkiełka przed nałożeniem flory opalizowej na roztwór roboczy TSA, a następnie przepłukać szkiełko buforem do pobierania antygenu. Usuwanie na bazie mikrofal należy przeprowadzić, podgrzewając szkiełka w buforze do odzyskiwania antygenu w kuchence mikrofalowej przy 100% mocy przez 50 sekund, a następnie 20% mocy przez 20 minut w pojemnikach nadających się do kuchenki mikrofalowej. Po schłodzeniu próbek w temperaturze pokojowej przez 15 minut, przepłukać szkiełka w wodzie destylowanej i TBST, a następnie inkubować z roztworem przez pięć minut.
Następnie wysuszyć prowadnicę na powietrzu przed montażem za pomocą odpowiedniego medium montażowego. Przed obrazowaniem slajdów należy wstępnie ustawić odpowiednie filtry na stacji roboczej. Uchwyć co najmniej 10 pól do analizy pod 200-krotnym powiększeniem.
Aby policzyć komórki, kliknij przycisk zliczania obiektów na pasku kroków, aby wyświetlić panel ustawień zliczania obiektów. Jeśli tkanka została podzielona na segmenty, należy wybrać kategorię tkanki, w której mają znajdować się obiekty. Następnie wybierz żądane skalowanie sygnału z automatycznej skali lub stałej skali.
W przypadku segmentacji obiektów wybierz komponent podstawowy z listy rozwijanej. Aby wykrywać obiekty stykające się z innymi obiektami jako pojedyncze, a nie połączone obiekty, zaznacz pole maksymalnego rozmiaru i pikseli, a następnie wybierz udoskonalony podział. Następnie policz wszystkie komórki zrębu w komórkach odpornościowych osobno, aby wyrazić dane jako procenty komórek odpornościowych w stosunku do całkowitej liczby komórek zrębu dla każdego przechwyconego obrazu.
Później podaj końcową liczbę komórek jako średnią ze wszystkich pól. Korzystając z edytora widoków, sprawdź wynikowe tabele danych po przetworzeniu, a następnie wyeksportuj tabelę danych zliczania. W reprezentatywnej analizie wyróżniamy cztery typy komórek odpornościowych w próbce endometrium.
Przetworzony obraz pokazuje segmentację tkanek jako przedziały nabłonkowe i zrębowe. Multipleksowe barwienie immunologiczne przeprowadzono na biopsjach endometrium od płodnej kobiety kontrolnej i kobiety z niewyjaśnionymi nawracającymi poronieniami, w barwieniu immunologicznym ujawniono pojedyncze piętro dla nas reprezentujące CD3, CD56, CD68 i CD20. Po zidentyfikowaniu dźwięku immunologicznego, dalsze barwienie pod cytokiną może pomóc w określeniu ich interakcji i mechanizmu powodzenia implantacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem jednoczesnej charakterystyki gęstości i grupowania głównych komórek odpornościowych w błonie śluzowej macicy z wykorzystaniem multipleksowej immunohistochemii oraz obrazowania wielospektralnego. Opisano szczegółowy protokół barwienia służący do jednoczesnej lokalizacji czterech typów komórek odpornościowych w endometrium.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Immunologia
- Biologia endometrium
- Techniki obrazowania multipleksowego
Wstęp
- Znaczenie charakterystyki komórek odpornościowych w biologii rozrodu.
- Wyzwania związane z tradycyjnymi metodami barwienia.
- Postępy w technologii obrazowania.
Zastosowane metody
- Multiplexowa immunohistochemia
- Próbki tkanek utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie
- Obrazowanie wielospektralne
Główne wyniki
- Pomyślnie zróżnicowano cztery typy komórek odpornościowych (CD3, CD56, CD68, CD20) w błonie śluzowej macicy.
- Zwizualizowano rozkład i skupiska komórek odpornościowych.
- Przedstawiono ulepszenia protokołu do dalszych badań.
Wnioski
- Badanie przedstawia wiarygodną metodę analizy komórek odpornościowych w błonie śluzowej macicy.
- Ma to znaczenie dla zrozumienia zdrowia rozrodczego i sukcesu implantacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multipleksowe fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne umożliwia jednoczesną kwantyfikację wielu populacji komórek odpornościowych w obrębie jednego przekroju tkanki, co pozwala wypełnić istotną lukę w badaniach nad immunologią rozrodczą. Podejście to wspiera weryfikację mechanistyczną hipotez dotyczących mikrośrodowiska błony śluzowej macicy, dostarczając danych z multipleksowego profilowania odpornościowego z rozdzielczością przestrzenną, bezpośrednio z próbek pobranych od pacjentek. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w działaniach związanych z walidacją celów terapeutycznych w kontekście niepowodzeń implantacyjnych i nawracających poronień, umożliwiając bezpośrednie porównanie gęstości i klastrowania komórek odpornościowych między stanami płodności a stanami patologicznymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących oddziaływań komórek odpornościowych w błonie śluzowej macicy poprzez jednoczesną detekcję markerów CD3, CD56, CD68 i CD20.
- Wartość operacyjna: Redukuje konieczność seryjnego skrawania i barwienia, co pozwala na oszczędność cennych próbek klinicznych przy jednoczesnym zwiększeniu gęstości danych z jednego przekroju tkanki.
- Pewność prognostyczna: Dostarcza ilościowych, rozdzielonych przestrzennie parametrów komórek odpornościowych, co wspiera biologiczną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w interakcję między błoną śluzową macicy a układem odpornościowym podczas implantacji.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje standaryzowane, powtarzalne odczyty fluorescencyjne odpowiednie dla platform obrazowania wysokotreściowego oraz zautomatyzowanych procesów analizy obrazu.
- Skalowalność: Kompatybilność z biobankami tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE), co umożliwia retrospektywną analizę dużych kohort w celu odkrywania biomarkerów.
- Optymalizacja multipleksowa: Eliminuje interferencje fluoroforów poprzez sekwencyjne cykle barwienia i usuwania barwnika, zapewniając specyficzność sygnału dla każdego markera komórek odpornościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Bezpośrednio stosowany w biopsjach endometrium u ludzi, zapewniając klinicznie istotny model do badania dysregulacji immunologicznej w nawracających poronieniach.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania w profilowaniu immunologicznym z walidacją przedkliniczną, umożliwiając spójne fenotypowanie immunologiczne w różnych typach próbek.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wspiera badanie oddziaływań komórek odpornościowych zapośredniczonych przez cytokiny po wstępnej identyfikacji typów komórek, co ułatwia walidację celów na poziomie szlaków sygnałowych.
Integracja potoków i procesów roboczych
Metoda ta wpisuje się w fazę biologii odkrywczej, wspierając w szczególności walidację celów immunologicznych oraz działania w zakresie przesiewu fenotypowego w programach immunologii rozrodu.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących składu komórek odpornościowych i ich organizacji przestrzennej w błonie śluzowej macicy w oknie implantacyjnym.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników immunofluorescencji, co umożliwia porównanie gęstości komórek odpornościowych oraz wzorców ich skupiania w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Analityka: Dostarcza zmultipleksowane dane dotyczące intensywności fluorescencji i kolokalizacji, które służą do fenotypowania komórek odpornościowych oraz wnioskowania o ich stanie funkcjonalnym.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przejścia od analizy próbek ludzkich do mechanistycznych badań następczych poprzez dostarczenie zwalidowanych markerów komórek odpornościowych do dalszych testów funkcjonalnych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy reużywalną platformę barwienia immunocytochemicznego, którą można zastosować w wielu badaniach profilowania immunologicznego błony śluzowej macicy oraz innych tkanek.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez umożliwienie bezpośredniego, multipleksowego porównania populacji komórek odpornościowych w tkankach chorobowych i kontrolnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia wydajność odczynników i redukuje zmienność dzięki zoptymalizowanym protokołom sekwencyjnego barwienia i usuwania barwnika na pojedynczych preparatach.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań nad terapiami reprodukcyjnymi poprzez wyjaśnienie wpływu mikrośrodowiska odpornościowego na sukces lub niepowodzenie implantacji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o gęstość komórek odpornościowych, ich klastrowanie oraz korelację przestrzenną z przedziałami nabłonkowymi lub zrębowymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy obrazów wielospektralnych w celu dokładnego wykrywania i kwantyfikacji sygnału.
- Zależne od dostępu do systemów odzyskiwania antygenów opartych na mikrofalach, skanerów slajdów z możliwością obrazowania fluorescencyjnego oraz zwalidowanych zestawów fluoroforów Opal do cyklicznego multipleksowania.
- Wymaga standaryzacji warunków blokowania, inkubacji przeciwciał oraz usuwania przeciwciał (strippingu) pomiędzy laboratoriami w celu zapewnienia powtarzalności wyników multipleksowych.
- Wymaga adaptacji paneli przeciwciał i etapów walidacji przy zastosowaniu metody do różnych typów tkanek lub markerów komórek odpornościowych innych niż CD3, CD56, CD68 i CD20.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalne przenikanie sygnałów (bleed-through) fluoroforów oraz konieczność starannej separacji spektralnej podczas obrazowania, co rozwiązuje się poprzez sekwencyjny stripping i zwalidowane ustawienia filtrów.
