Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

Tak więc ten protokół umożliwia nam indukowanie patologicznych przemian fazowych TDP-43 i zajęcie się ich konsekwencjami komórkowymi w rdzeniowych neuronach ruchowych in vivo, co jest istotne dla zrozumienia, dlaczego neurony ruchowe degenerują się w ALS. Ze względu na wysoką przezroczystość larw danio pręgowanego neurony ruchowe w rdzeniu kręgowym są bezpośrednio widoczne. Można więc wyobrazić sobie dynamiczne zachowanie TDP-43 zachodzącego w przemianach fazowych w pojedynczych rdzeniowych neuronach ruchowych.

Metoda ta oferuje nowatorski model zwierzęcy ALS. Uważamy, że każda metoda, która może zapobiec indukowanej światłem przemianie fazowej i agregacji TDP-43 w tym modelu ALS, może być potencjalnym kandydatem do terapii ALS. Inne białka związane z ALS z wewnętrznie nieuporządkowanymi regionami mogą być eksprymowane w celu zbadania neurotoksyczności związanej z nieprawidłowymi przejściami fazowymi.

Kluczem do sukcesu w tym podejściu jest ekspresja optogenetycznego TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych na poziomie nietoksycznym. Transgeneza BAC jest czasochłonnym krokiem, ale kiedy już stworzysz odpowiednią transgeniczną rybę, następujące kroki są stosunkowo łatwiejsze i proste. Aby rozpocząć, włącz diodę elektroluminescencyjną lub panel LED, korzystając z odpowiedniej aplikacji zainstalowanej na tablecie lub telefonie.

Następnie umieść sondę spektrometru w pustej studzience 6-dołkowej. Następnie za pomocą aplikacji dostosuj światło LED do długości fali o długości szczytowej 456 nm. Umieść czujnik optyczny miernika mocy optycznej w pustej studzience i wyreguluj moc światła LED.

Następnie umieść naczynie z ustawieniem panelu LED w inkubatorze w temperaturze 28 C. W celu zobrazowania larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję optogenetyczną TDP-43, należy zdechorionować podwójnie transgeniczne ryby i znieczulić je w buforze E3 zawierającym 250 g/ml tricanu. Następnie rozgrzej 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia zawierającą 250 g/ml metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu w temperaturze 42 C. Następnie umieść kroplę agarozy na szklanym naczyniu podstawowym. Średnica kropli agarozy w kształcie kopuły na szklanym naczyniu powinna wynosić od 8 do 10 mm.

Następnie za pomocą pipety Pasteura dodaj znieczuloną rybę do agarozy na szklanym naczyniu. Zminimalizuj ilość buforu E3 dodawanego do agarozy wraz z rybą. Następnie wymieszać kilka razy, pipetując.

Podczas krzepnięcia agarozy należy utrzymać rybę na boku za pomocą igły strzykawkowej, tak aby rdzeń kręgowy znajdował się w odpowiedniej pozycji poziomej. Po zestaleniu się agarozy dodaj kilka kropli buforu E3 na rybę w kształcie kopuły zamontowaną na agarozie. Za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę obiektywową z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie, uzyskaj szeregowe konfokalne przekroje Z rdzenia kręgowego.

Uwzględnij kloakę po brzusznej stronie ryby w obszarach zainteresowania jako odniesienie do identyfikacji i porównania segmentów kręgosłupa w różnych punktach czasowych. Jak tylko obrazowanie zostanie zakończone, użyj igły strzykawki, aby ostrożnie rozbić agarozę i usunąć rybę z agarozy. Utrzymuj jak najkrótszy czas, w którym ryba jest osadzona w agarozie, chociaż osadzanie agarozy przez mniej niż 30 minut nie wpływa na żywotność ryby.

Dodaj 7,5 ml buforu E3 do jednego dołka 6-dołkowego naczynia i umieść obrazowaną podwójnie transgeniczną rybę w tej studzience. Następnie umieść naczynie na panelu LED, trzymając naczynie i panel LED w odległości 5 mm od siebie za pomocą przekładki i włącz niebieskie światło LED. Trzymaj kilka podwójnie transgenicznych ryb w osobnym 6-dołkowym naczyniu pokrytym folią aluminiową dla nieoświetlonych ryb kontrolnych.

Po pożądanym czasie oświetlenia zobrazowano rdzeń kręgowy oświetlonej ryby, jak pokazano wcześniej. Cytoplazmatyczne przemieszczenie opTDP-43h w pojedynczych rdzeniowych neuronach ruchowych zostało uwidocznione poprzez oddzielenie obrazów serii Z uzyskanych w wieku 48 lat. i 72 godziny po zapłodnieniu do każdego kanału EGFP-TDP-43z i opTDP-43h.

Z obrazów projekcyjnych o maksymalnej intensywności EGFP-TDP-43z wybrano pojedynczy izolowany neuron rdzeniowy identyfikowalny zarówno po 48, jak i 72 godzinach od zapłodnienia. Interesujące obszary pokrywające somy neuronów ruchowych wyznaczono poprzez śledzenie krawędzi sygnału EGFP na 48.

i 72 godziny po zapłodnieniu. Wykreślono znormalizowaną intensywność fluorescencyjną wzdłuż głównej osi somy. A po 48 godzinach od zapłodnienia wzorce obu sygnałów w dużej mierze się na siebie nakładały.

Natomiast po 72 godzinach szczyt sygnału opTDP-43h stwierdzono w regionie, w którym sygnał EGFP-TDP-43z był niski, co wskazuje na cytoplazmatyczne przemieszczenie opTDP-43h. Aby określić ilościowo sygnały opTDP-43h i EGFP-TDP-43z przed i po stymulacji światłem niebieskim, niektóre obrazy projekcyjne dla każdego kanału tych samych obrazów z serii Z zostały wytworzone przy 48. i 72 godziny po zapłodnieniu.

Spośród czterech badanych komórek mnr2b+, komórka 1 w szczególności wykazywała nasycony sygnał EGFP-TDP-43z. Względne ilości opTDP-43h do EGFP-TDP-43z obliczono, dzieląc wartość zapytania ofertowego przez wartość GFP. Komórki od 2 do 4 wyświetlały malejące poziomy opTDP-43h po podświetleniu światłem niebieskim.

Ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym ryby są osadzone w agarozie, aby utrzymać je w zdrowiu. Dostosowując intensywność i czas trwania oświetlenia LED, kontrolujemy przejście fazowe TDP-43 w tymczasowo regulowany sposób, co może pomóc w analizie progresji patologicznej przemiany fazowej TDP-43 w neuronze ruchowym.