Name: W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj wielofunkcyjny system do w pełni optycznego badania mechanobiologicznego białka YAP w ludzkich komórkach nowotworowych i normalnych. Ta metoda umożliwia automatyczne, wielokanałowe obrazowanie żywych komórek z korekcją dryfu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt jest wspierany finansowo przez Cancer Pilot Award od UF Health Cancer Center (X. T. and D. S.) oraz Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Autorzy szczerze doceniają intelektualne dyskusje i wsparcie techniczne ze strony dr Jonathana Lichta (UFHCC), dr Rolfa Renne (UFHCC), dr Ji-Hyun Lee (biostatystyka, UF), dr Hugh Fana (MAE, UF), dr Warrena Dixona (MAE, UF), dr Ghatu Subhash (MAE, UF), dr Marka Sheplaka (MAE & ECE, UF), dr Malisy Sarntinoranont (MAE, UF), dr Scotta Banksa (MAE, UF, UF), dr Matthew Traum (MAE, UF), dr David Hahn (University of Arizona), dr Weihong Wang (Oracle Corporation), dr Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) oraz zespół wsparcia firmy Nikon (dr Jose Serrano-Velez, Larry Kordon i dr Jon Ekman). Autorzy są głęboko wdzięczni za hojne i skuteczne wsparcie ze strony wszystkich członków laboratoriów badawczych Tanga, Siemanna i Guana oraz wszystkich pracowników MAE i ECE oraz Wydziałów Fizyki i Radioterapii Onkologicznej UF.

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+force+and+motion+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal force and motion in collective cell migration.</a> Scientific Data. 7 (1), 197(2020).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+tractions+control+the+size+of+a+collectively+moving+pack+in+a+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Extreme+Mechanics+Letters%22%5BJournal%5D)">Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer.</a> Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).</li>
<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+multi-functional+integration+program+%28AMFIP%29+towards+all-optical+mechanobiology+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Tulpule, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-mediated+RAS+signaling+via+membraneless+cytoplasmic+protein+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules.</a> Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).</li>
<li>Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+traction+force+microscopy+to+study+multi-cellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system.</a> PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).</li>
<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).</li>
<li>Phelps, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maleimide+cross-linked+bioactive+PEG+hydrogel+exhibits+improved+reaction+kinetics+and+cross-linking+for+cell+encapsulation+and+in+situ+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery.</a> Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).</li>
<li>Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+of+the+substrate+influences+the+phenotype+of+embryonic+chicken+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).</li>
<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+split+fluorescent+proteins+for+endogenous+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling.</a> Nature Communications. 8, 370(2017).</li>
<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
<li>Micro-Manager. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2">https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2</a> (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
<li>Okumurai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+generalization+of+Cerruti%27s+problem+in+an+elastic+half-space%5BTitle%5D)+AND+%22Doboku+Gakkai+Ronbunshu%22%5BJournal%5D)">On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space.</a> Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Hong, W. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YAP+and+TAZ+transcription+co-activators%3A+Key+downstream+effectors+of+the+mammalian+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+roots+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the roots of cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+yes-associated+protein+contributes+to+progression+and+poor+prognosis+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer.</a> Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+YAP+suppresses+CML+cell+proliferation+and+enhances+efficacy+of+imatinib+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134(2016).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically-induced+colon+cancer+cell+population+shows+increased+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential.</a> Molecular Cancer. 13, 131(2014).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+%28YAP%29+functions+as+a+tumor+suppressor+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).</li>
<li>Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+redistribution+mediated+by+nuclear+deformation+determines+dynamic+localization+of+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+regulates+cellular+mechanical+states%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Migration regulates cellular mechanical states.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
<li>Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+far+cardiac+cells+can+see+each+other+mechanically%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">How far cardiac cells can see each other mechanically.</a> Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+nucleus+and+cell+migration+through+the+perinuclear+actin+cap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Proces obrazowania (krok 6.3) ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że obrazy fluorescencyjne są wystarczająco dobrej jakości, aby uzyskać prawidłowe wyniki kwantyfikacji. Obrazy stosu z białka fluorescencyjnego lub kulek powinny mieć zakres z, który jest wystarczająco duży, aby zawierać obrazy ostrej dla wszystkich pozycji Z, które obejmuje próbka. Kolejnym krytycznym krokiem jest zebranie obrazów referencyjnych kulek fluorescencyjnych po rozpuszczeniu komórek (krok 6.5). Ponieważ obrazy referencyjne muszą być wykonywane w tych samych pozycjach co w kroku 6.3, nie należy indukować względnego przemieszczenia między szalką Petriego, komorą środowiskową i mikroskopem. Badacze wykonujący etap rozpuszczania muszą być ostrożni, aby zdjąć pokrywę szalki Petriego i upewnić się, że zastosowane zakłócenia mechaniczne nie są wystarczająco duże, aby zmienić położenie szalki w komorze środowiskowej.
Poniżej znajdują się rozwiązania niektórych błędów, które mogą wystąpić podczas eksperymentów. Jeśli po kliknięciu Enter w kroku 6.4 nie zostanie aktywowane żadne makro, najprawdopodobniej jest to spowodowane tym, że lewy dolny obszar ekranu jest zajęty przez okno inne niż Element. W takim przypadku lewy dolny obszar okna musi zostać wyczyszczony, aby można było aktywować makra w Elementach. Innym częstym błędem jest to, że obrazy w jasnym polu wydają się czarne. Problem ten jest spowodowany niewystarczającym odstępem czasu między akwizycją obrazów fluorescencyjnych i obrazów w jasnym polu. Niewielkie opóźnienia w zliczaniu czasu obrazowania fluorescencyjnego mogą kumulować się w czasie i powodować znaczne opóźnienia oraz zakłócać obrazowanie w jasnym polu. Jednym z rozwiązań jest dostosowanie czasu trwania jednego cyklu obrazowania dla wszystkich pozycji tak, aby był krótszy (nierówny) odstępowi czasu między rozpoczęciem kolejnych ruchów. Ta operacja odświeża zliczanie czasu i eliminuje skumulowany błąd na początku każdego cyklu obrazowania.
Ta w pełni optyczna technologia przesłuchań obsługuje (1) szeroką gamę sprzętu/oprogramowania, w tym między innymi firmę Nikon, (2) różne typy zatwierdzonych systemów hydrożelowych, w tym żele żelatynowe, PEG, Matrigel i żele kolagenowe I, oraz (3) programowalne dostosowywanie w oparciu o różne potrzeby badaczy. Jeśli jednak którakolwiek z funkcji sterowania dolnego poziomu nie jest dostępna w komercyjnym mikroskopie, dostosowanie funkcji za pomocą AMFIP staje się wyzwaniem. Innym ograniczeniem tej techniki jest dryft przestrzenny próbki zarówno w płaszczyźnie XY, jak i ogniskowej (Z). Chociaż to ograniczenie można przezwyciężyć podczas przetwarzania końcowego obrazów, konieczne jest ulepszenie funkcji automatycznego ustawiania ostrości, aby skorygować dryf próbek w czasie rzeczywistym. To ulepszenie zwiększy przepustowość procesu obrazowania i zmniejszy potencjalny błąd spowodowany dryftem podczas eksperymentów.
Mechanoprzetworniki, takie jak YAP, mogą służyć jako nowe cele terapeutyczne dla rozwoju obiecujących terapii przeciwnowotworowych 25,26,27. Pojawiające się dane sugerują, że YAP sprzyja proliferacji i inwazji komórek nowotworowych. Indukowana mechanicznie translokacja YAP z cytoplazmy do jądra aktywuje transkrypcję genów związanych z migracją, proliferacją, inwazją i apoptozą komórek, prowadząc do nieprawidłowych zachowań komórek 28,29,30,31. Prace te miały na celu zbadanie potencjalnej korelacji między stosunkiem YAP N/C a mechaniką komórkową w dwóch typowych ludzkich liniach raka płuca i prawidłowych liniach komórkowych. Podczas 10-godzinnego okresu rozprzestrzeniania się komórek komórki PC9 wykazują podobne stężenia YAP w jądrze i cytoplazmie (ryc. 3D i ryc. 5A). Komórki B2B wykazują wyższe stężenie YAP w jądrze niż w cytoplazmie (Figura 3C i Figura 5A). Ta zależność stwierdzona we wczesnej fazie rozprzestrzeniania się różni się od większości opublikowanych wyników, które porównują stężenie YAP w jądrze między komórkami normalnymi a nowotworowymi. Chociaż niekoniecznie na wczesnym etapie rozprzestrzeniania się, większość opublikowanych wyników pokazuje, że YAP jest bardziej skoncentrowany w jądrze komórek rakowych niż w jądrze normalnych komórek27,28. Tylko jedno badanie dotyczące raka piersi wykazało wyjątek32, który pokazuje, że YAP jest bardziej skoncentrowany w cytoplazmie, co zgadza się z naszymi obecnymi obserwacjami dokonanymi w komórkach PC9 raka płuc. Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, praca ta jest pierwszą, która wykazała niższy stosunek YAP N/C w linii komórkowej ludzkiego raka płuca. Autorzy stawiają hipotezę, że przyczyną stabilnego stosunku YAP N / C w komórkach PC9 może być niewielka zmienność obszaru rozprzestrzeniania się komórka/jądro i trakcja w komórkach PC9 na wczesnym etapie rozprzestrzeniania się. Trwa analiza mechanizmów molekularnych leżących u podstaw niskiego stosunku YAP N/C w komórkach PC9 i B2B.
W ciągu pierwszych 10 godzin rozprzestrzeniania się te dwie linie komórkowe wykazują wyraźny związek między stosunkiem YAP N / C, trakcją komórek i obszarem rozprzestrzeniania się (ryc. 5). W przypadku komórek B2B wyższy stosunek YAP N / C jest skorelowany z wyższym obszarem rozprzestrzeniania się komórek i jądra (ryc. 6A, B), co jest zgodne z raportowanymi danymi innych normalnych komórek33. Co ciekawe, chociaż trend rozwojowy tego związku występuje na ogół we wszystkich zarejestrowanych komórkach B2B, stwierdza się dwa różne stopnie (wysoki i niski) tego związku. Komórki B2B, które rozprzestrzeniają się i migrują jednocześnie, wykazują niższą trakcję i większą powierzchnię rozprzestrzeniania się komórek i jąder przy wyższym stosunku YAP N/C (2,05 ± 0,32). W przypadku komórek B2B, które rozprzestrzeniają się i pozostają w tym samym miejscu, wykazują wyższą trakcję i mniejszą powierzchnię rozprzestrzeniania się komórek i jądra przy niższym stosunku YAP N/C (1,74 ± 0,21). Te dwa stopnie zależności są pokazane w rozwidlonych rozproszonych grupach danych (Rysunek 6C,D). Jak podano w literaturze, stacjonarne normalne komórki, takie jak komórki brionalnego fibroblastu NIH 3T3, mają większą przyczepność niż komórki migrujące34. Dane przedstawione w tym artykule sugerują, że rozprzestrzeniające się i niemigrujące komórki B2B miały większą przyczepność niż rozprzestrzeniające się i migrujące komórki B2B, co prawdopodobnie sugeruje, że wysoka przyczepność jest potrzebna, aby komórki niemigrujące ustabilizowały się na podłożu.
Ponadto dane te pokazują, że stacjonarne normalne komórki B2B generują większą siłę okołojądrową, podczas gdy poprzednie badania przeprowadzone przez innych badaczy wykazały tylko wyższą trakcję komórek generowaną na obrzeżach komórek stacjonarnych 34,35,36,37. Autorzy sądzą, że różnica w wewnętrznej tendencji migracji w eksperymentach może powodować te sprzeczne wyniki. W opublikowanych eksperymentach zastosowano mikrowzory w kształcie kwadratu, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się pojedynczych komórek i zahamować migrację; Nie wiadomo, czy komórki miały tendencję do migracji. Ponieważ komórki migrujące często wykazują dużą siłę przyciągania na obrzeżach komórek38, jest prawdopodobne, że komórki z tendencją do migracji nadal będą utrzymywać wysoką przyczepność na obrzeżach, nawet jeśli ich migracja jest ograniczona. W niniejszym badaniu komórki stacjonarne nie są ograniczone żadnym mikrowzorcem, ale nie migrują, co wskazuje, że komórki mają tendencję do utrzymywania stanu bez migracji. Inną możliwością jest to, że kształt komórki określony przez mikrowzór może wpływać na rozkład zrostów ogniskowych i sił trakcyjnych39. Wyniki tego badania zostały wygenerowane bez żadnych ograniczających mikrowzorców i reprezentują rozkład sił komórek stacjonarnych w ich pierwotnym kształcie.
Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, tylko jedna publikacja do tej pory donosiła o odkryciu sił okołojądrowych w normalnych komórkach (mysich fibroblastach embrionalnych), potencjalnie spowodowanych przez czapeczkę aktynową rozciągającą się w jądrze40. Translokacja cytoplazmy do jądra YAP jest skorelowana ze wzrostem siły okołojądrowej40. Dokładne przeszukanie odpowiedniej literatury nie przyniosło żadnych publikacji, które donosiłyby o oddziaływaniu okołojądrowym lub kapku aktynowym w komórkach nowotworowych. Pośrednie badanie na komórkach raka czerniaka wykazało, że obręcz aktyny (inna organizacja aktyny okołojądrowej zlokalizowana wokół jądra, ale nie pokrywająca jądra) zmniejsza tempo migracji komórek41, pośrednio sugerując istnienie siły okołojądrowej. Nie podano jednak żadnych bezpośrednich danych doświadczalnych. W tym badaniu autorzy odkryli, że zarówno komórki PC9, jak i B2B wykazują przemieszczenie i trakcję okołojądrową. Mechanizmy powstawania sił okołojądrowych i ich skutki pozostają kontrowersyjne. W normalnych komórkach stwierdzono, że czapeczka aktynowa odgrywa rolę w regulacji morfologii jądra i organizacji chromatyny42, przesyłaniu sygnałów mechanicznych z ogniskowych zrostów do jądra przez łączniki kompleksu nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC)43 oraz regulacji migracji komórek44. Lamina A/C jest związana z powstawaniem i rozrywaniem kapu aktynowego 40,41,42,43,44. Jednak w raporcie, w którym stwierdzono, że kapon aktynowy generuje siły okołojądrowe, nie uwzględniono potencjalnej roli obręczy aktynowej40. W komórkach nowotworowych nadekspresja laminy A ułatwia tworzenie obręczy aktynowej i ogranicza migrację komórek rakowych. Nadekspresja laminy B zmniejsza tworzenie się obrzeży aktynowych i sprzyja migracji. Oddziaływanie okołojądrowe może być zaangażowane w ten proces ze względu na istnienie organizacji aktyny okołojądrowej i efekt Laminy A. Jednak wyniki tego badania nie wykazały żadnych dowodów na zmierzone siły okołojądrowe ani zachowanie kapu aktynowego. Dlatego odkrycie sił okołojądrowych w komórkach PC9 w niniejszym badaniu jest pierwszym raportem pokazującym siły okołojądrowe i przemieszczenia w komórkach raka płuc. Autorzy badają obecnie mechanizmy molekularne i funkcje sił okołojądrowych w komórkach PC9 i B2B zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9.
Poza całkowicie optycznym badaniem mechanobiologicznym, które zostało zademonstrowane w tym artykule, zintegrowany wielofunkcyjny system może być zastosowany do optycznego badania niezliczonych innych istotnych sygnałów fizjologicznych i patobiologicznych w żywych systemach. Na przykład laboratorium autorów ustaliło niedawno wiele stabilnie transdukowanych linii komórek nowotworowych u ludzi, które wykazują współekspresję trzech wrażliwych na światło białek błonowych: wskaźnika napięcia błonowego QuasAr2 (wzbudzenie: 640 nm; emisja: 660 nm-740 nm), membranowy depolaryzator napięcia CheRiff (wzbudzenie: 488 nm) i hiperpolaryzator napięcia membranowego eNpHR3 (wzbudzenie: 590 nm). Te trzy funkcjonalne białka mogą być aktywowane przez spektrum-ortogonalne linie laserowe w sposób wolny od przesłuchów, umożliwiając we wszystkich optycznych dwukierunkowych komunikatach sygnalizacyjnych (odczyt i kontrola) elektrofizjologii błonowej. Korzystając ze zintegrowanego systemu optoelektronicznego i ręcznego patch-clampu, autorzy przeprowadzili walidację w pełni optycznej kontroli i odczytu napięcia błony (Vm) w pojedynczych ludzkich komórkach nowotworowych i wielokomórkowych sferoidach guza. Całkowicie optyczne badania elektrofizjologiczne otwierają możliwość szczegółowych badań nad wcześniej niedostępną bioelektrycznością w komórkach nowotworowych, co może pomóc w rozwoju biologii guza z nowej osi.

Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie w pełni optycznego, wielofunkcyjnego obrazowania i analizy żywych komórek. Kompleksowy program do obrazowania, który umożliwia automatyczną koordynację wielofunkcyjnych urządzeń optoelektronicznych, zmniejszy pracochłonne i podatne na błędy operacje ręczne i jest niezbędny dla badaczy do prowadzenia długoterminowego obrazowania żywych komórek1,2,3,4. Jednak większość istniejących programów publicznych w społeczności badań biomedycznych albo dotyczy tylko ograniczonych urządzeń optoelektronicznych, albo wymaga dodatkowego sprzętu do koordynacji różnych urządzeń5,6,7,8,9. Niedawno opracowano program oparty na oprogramowaniu typu open source o nazwie "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", umożliwiający obrazowanie wielokanałowe i poklatkowe. Oparty na języku Java i interfejsie programowania aplikacji (API) μManager11,12, AMFIP został opracowany jako wtyczka w μManager, która wykonuje niestandardowe skrypty Java w celu realizacji opartej na oprogramowaniu komunikacji wielu platform sprzętu i oprogramowania optoelektronicznego, w tym między innymi tych firmy Nikon. Ustanowienie AMFIP otwiera możliwość programowalnego i wielofunkcyjnego badania zachowań komórek. W artykule opracowano zintegrowany system eksperymentalny i obliczeniowy, który łączy AMFIP z cyfrową analizą obrazowania i mikroskopią sił trakcyjnych komórek. System umożliwia wyjaśnienie odrębnej mechanobiologii YAP w ludzkich normalnych liniach komórkowych B2B (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i linii komórkowych raka płuc PC9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) za pomocą CRISPR/Cas9. System zapewnia społeczności naukowej kompleksowe rozwiązanie, które pozwala uniknąć konieczności zakupu dodatkowych urządzeń kontrolnych, które mogą nie być dostępne i/lub kompatybilne z każdym systemem obrazowania.
Protokoły przedstawione w tym artykule wprowadzają, jak (1) zastosować AMFIP do przeprowadzenia automatycznego długoterminowego obrazowania dla obu linii komórkowych zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9, które wyrażają YAP oznaczone mNEonGreen2; oraz (2) połączyć Fiji ImageJ, MATLAB i Origin do ilościowej analizy stosunku jądra/cytoplazmy YAP (N/C) na podstawie ich intensywności fluorescencji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4), komórkowe pole przemieszczenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C i <silna klasa="xfig">Rysunek 2C) oraz komórkowe pole trakcyjne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D i <silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Wyniki sugerują, że (1) w ciągu pierwszych 10 godzin rozprzestrzeniania się komórek na podłożach, które mają fizjologicznie istotną sztywność mechaniczną13,14,15,16,17,18, stosunek YAP N/C pojedynczych komórek B2B wykazuje bardziej zauważalną zmienność i fluktuację zależną od czasu w porównaniu z pojedynczym PC9 komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5 i <silna klasa="xfig">Rysunek 6); oraz (2) komórki rakowe PC9 generują zauważalną trakcję w swoich regionach okołojądrowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7). Zintegrowany system i metodologie opisane w tym protokole wykraczają poza specyficzne typy komórek i molekuł optogenetycznych. Naukowcy mogą zastosować te protokoły, aby dostosować swoje specyficzne eksperymenty z żywymi komórkami i wyjaśnić wieloaspektową dynamikę sygnalizacji w kontekście fizjologii i patologii komórki.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsyna</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Wirówka stołowa</td><td>Thermo</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>System konfokalny A1R</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>octowySigma-aldrich</td><td>695092</td><td>lodowcowy, odczynnik ACS, &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Komórki BEAS-2B (B2B)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>95102433</td><td>ludzkie komórki nabłonkowe z tkanki płucnej</td></tr><tr><td>Mikrosfery modyfikowane karboksylanem</td> Pożywka hodowlana <td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>(RPMI-1640)</td>Komputer stacjonarny <td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Dell</td><td></td><td>2018</td><td>z systemem operacyjnym Windows 10</td></tr><tr><td>Komora środowiskowa TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Białko ludzkie, osocze</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego</td><td>1.53k</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buforowany sól fizjologiczna</td><td>Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hydratu hydrazyny</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Platforma programistyczna</td></tr><tr><td>Java Zestaw programistyczny Java</td><td>Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Monochromatyczny&nbsp; Kamera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Zestaw do wykrywania mykoplazmy</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór N,N&prime;-Metylenobisakryloamidu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Platforma oprogramowania NIS-Elements</td> Platforma <td>oprogramowania</td><td>Nikon</td><td>4.50</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2017 (Learning Edition)</td><td>analiza danych i oprogramowanie do tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Komórki PC9</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>ludzkie komórki gruczolakoraka&nbsp; z tkanki płucnej</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; F-553S</td><td>polimeraza DNA o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>Taśma klejąca</td><td>klejąca Roztwór</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczanu sodu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Gorilla</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Ti2-E</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E Stolik zmotoryzowany z enkoderem</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Manager</td><td></td><td>w wersji 2.0</td><td>oprogramowanie do mikroskopii gamma typu open source (https://micro-manager.org/)</td></tr></tbody></table>

w pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Długoterminowe wielofunkcyjne obrazowanie i analiza żywych komórek wymagają usprawnionej, funkcjonalnej koordynacji różnych platform sprzętowych i programowych. Jednak ręczne sterowanie różnymi urządzeniami produkowanymi przez różnych producentów jest pracochłonne i czasochłonne, co potencjalnie zmniejsza dokładność, odtwarzalność i jakość pozyskiwanych danych. Dlatego kompleksowy i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczną, wielofunkcyjną i długoterminową akwizycję obrazu oraz jest kompatybilny z większością platform mikroskopii fluorescencyjnej, może przynieść korzyści społeczności naukowej. W niniejszym artykule przedstawiono kompletne protokoły operacyjne wykorzystania nowatorskiego zintegrowanego systemu oprogramowania, który składa się z (1) domowego oprogramowania o nazwie "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", który umożliwia automatyczną wielokanałową akwizycję obrazowania, oraz (2) pakietu ilościowej analizy obrazowania i pakietów obliczeniowych trakcji komórek. 
Ten zintegrowany system jest stosowany do ujawnienia wcześniej nieznanego związku między przestrzenno-czasowym rozkładem mechano-wrażliwego białka związanego z Tak (YAP) a mechaniką komórki, w tym rozprzestrzenianiem się komórek i trakcją, w normalnych komórkach ludzkich (B2B) i komórkach raka płuc (PC9) zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9. Wykorzystując zdolność tego systemu do wielokanałowej kontroli i odczytu, wynik pokazuje: (1) normalne komórki B2B i komórki rakowe PC9 wykazują wyraźny związek między ekspresją, trakcją i dynamiką komórki YAP podczas procesów rozprzestrzeniania się komórek i migracji; oraz (2) komórki rakowe PC9 wywierają zauważalne siły okołojądrowe na substraty. Podsumowując, w artykule przedstawiono szczegółowy, krokowy protokół wykorzystania zintegrowanego systemu programowalnego przez użytkownika, który umożliwia automatyczne wielofunkcyjne obrazowanie i analizę w celu wyjaśnienia wrażliwości mechanicznej YAP. Narzędzia te otwierają możliwość szczegółowej eksploracji wieloaspektowej dynamiki sygnalizacji w kontekście fizjologii i patologii komórki.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół krokowy, jak wykorzystać zintegrowany wielofunkcyjny i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczne obrazowanie wielokanałowe i analizę mechanobiologiczną w celu wyjaśnienia mechano-wrażliwości białka związanego z Tak (YAP).

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Metoda ta pomoże zilustrować mechanizmy molekularne wieloaspektowych zjawisk biologicznych. Takich jak mechanobiologia, elektrofizjologia optyczna i obrazowanie białek DNA/RNA w superrozdzielczości przy użyciu technik automatycznego obrazowania żywych komórek. Protokół ten umożliwia automatyczną, wielofunkcyjną, wysokowydajną, samoczynną korekcję dryfu i długoterminową akwizycję obrazu.Jest kompatybilny z większością fluorescencyjnych platform mikroskopowych, takich jak NYCOM. Każdy, kto próbuje tej techniki po raz pierwszy, powinien zrozumieć funkcję każdego kroku, a nie tylko ściśle przestrzegać protokołu, aby zapewnić udany eksperyment. Zacznij od umieszczenia komory środowiskowej na zmotoryzowanym stoliku odwróconego mikroskopu.Ustaw natężenie przepływu CO2 na 160 mililitrów na minutę i dostosuj temperaturę komory. Następnie dodaj 40 mililitrów oczyszczonej wody do kąpieli komory. Wyjąć z inkubatora szalkę Petriego ze szklanym dnem z komórkami i umieścić ją w komorze środowiskowej.Włącz kontroler konfokalny i odwrócony mikroskop. Przełącz ścieżkę światła w prawo. Obserwuj przyłączanie się komórek za pomocą Micro Managera.Jeśli do żelu dołączono wystarczającą ilość komórek, przenieść szalkę Petriego z powrotem do inkubatora. Jeśli nie, kontynuuj inkubację komórek przez kolejne 30 minut w przypadku B2B i 60 minut w przypadku raka płuc lub komórek PC-9. Wytnij 2 małe kawałki taśmy klejącej i przyklej je do komory wokół okrągłego otworu.Następnie nałóż niewielką ilość kleju na obszar taśmy, który pokryje szalka Petriego. Wyjmij szalkę Petriego z inkubatora. Powoli umieść szalkę Petriego w komorze i pozwól, aby dno naczynia zetknęło się z klejem.Naciśnij pokrywkę szalki Petriego przez 1 minutę, aby klej w pełni zetknął się z szalką Petriego i zestalił się. Delikatnie popchnij szalkę Petriego poziomo, aby upewnić się, że klej zastygł, a szalka Petriego się nie porusza. Następnie zamknij pokrywę komory.Otwórz IntelliJ i ustaw parametr T1 w wierszu 93 pliku elements_script.java. Upewnij się, że wartość ta jest większa niż czas działania makro i elementów używanych do obrazowania konfokalnego jednego pola widzenia. Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić projekt AMFIP IntelliJ.Kliknij przycisk na żywo i wielokrotnego deakwizycji w głównym interfejsie Micro Managera, a następnie przełącz ścieżkę światła odwróconego mikroskopu w prawo, aby obrazować w jasnym polu. Przełącz się na obiektyw 10 razy i otwórz światło LED o intensywności ustawionej na 5%Kliknij na obiektyw mikroskopu mikroskopu ścieżki światła i diodę LED lamp przycisk w panelu elementów TI2. Wyreguluj joystick XY i pokrętło płaszczyzny Z, aby znaleźć prawidłową pozycję i płaszczyznę ostrości żelu na szalce Petriego.Użyj celu 10 razy, aby znaleźć odpowiednie pola widzenia wielu pojedynczych komórek przyczepionych do żelu. Zaznacz pole XY z wieloma pozycjami w oknie akwizycji wielowymiarowej. Kliknij przycisk edycji listy pozycji i obserwuj wyskakujące okno listy pozycji etapu.Zmień cel na 40 razy, zwiększ intensywność światła LED do 15%Dostosuj zmotoryzowany stolik XY, aby zlokalizować pola view i zapisz współrzędne, klikając przycisk znacznika w oknie listy pozycji sceny. Zapisz od 6 do 7 żądanych pól widzenia. Kliknij przycisk Zapisz jako w oknie listy pozycji etapu, aby zapisać współrzędne i wprowadzić T1 jako sekcję interwału czasowego akwizycji obrazowania do T1 w sekcji punktu czasowego w oknie akwizycji wielowymiarowej.Otwórz elementy, zmień ścieżkę światła w prawo dla obrazowania konfokalnego i wyłącz światło LED. Następnie kliknij przycisk usuwania blokady i włącz kanał laserowy FITC do obrazowania YAP, zaznaczając pole FITC. Po ustawieniu prędkości skanowania na 1 klatkę na 2 sekundy, zakręć pokrętłem płaszczyzny Z, aby szybko znaleźć pozycję Z dołączonych komórek.Zapisz dolny i górny limit stosu Z. Kliknij makro na górnej wstążce, wybierz edytor makr z menu rozwijanego makr i wprowadź dolne i górne limity stosu Z do pliku makra. Włącz kanał laserowy DAPI do obrazowania ściegów, zaznaczając pole DAPI, aby znaleźć i zapisać zogniskowaną pozycję Z koralików.Przejdź do edytora makr i wprowadź zarejestrowane wartości do pliku makra. Aby ustawić zadanie przesuwania zmotoryzowanej sceny za pomocą AMFIP, przejdź do Micro Manager, kliknij automatyzację wtyczek, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika AMFIP. Następnie kliknij przycisk dodaj punkt lub usuń punkt, aby uzyskać dokładną liczbę wybranych pól widoku.Wprowadź zarejestrowane współrzędne pól widoku do panelu współrzędnych. Zdefiniuj łączny czas eksperymentu w polu tekstowym Całkowity czas eksperymentu. Kliknij przycisk dodatkowej konfiguracji czasu i zdefiniuj przedział czasowy T2 przesuwania zmotoryzowanego stolika do każdego pola widzenia.Zmaksymalizuj rozmiar okna elementów i przeciągnij GUI AMFIP na prawą stronę ekranu, aby GUI nie zakłócało automatycznych operacji kursora, a następnie kliknij przycisk Enter. Po zakończeniu pierwszego makra. Kliknij przycisk Acquire (Pozyskaj) w oknie Akwizycji wielowymiarowej.Po zakończeniu obrazowania długoterminowego zatrzymaj zadanie AMFIP, klikając przycisk pauzy w oknie wtyczki automatyzacji oraz przycisk zatrzymania w oknie akwizycji wielowymiarowej. Otwórz elementy i ustaw obrazowanie stosu Z, klikając górny i dolny przycisk w oknie Akwizycja ND. Przełącz ścieżkę światła w prawo i otwórz światło LED.Powoli i ostrożnie zdejmij pokrywy komory i szalki Petriego, monitorując jasne pole view pod kątem wszelkich odchyleń pola widzenia. Użyj plastikowej pipety, aby pobrać 0,5 mililitra roztworu SDS. Ostrożnie trzymać plastikową pipetę nieco powyżej pożywki hodowlanej na szalce Petriego i dodać 1 do 2 kropelek roztworu SDS do pożywki hodowlanej.Gdy komórki i jasny widok pola zostaną rozpuszczone, zamknij diodę LED, przełącz ścieżkę światła w lewo, kliknij przycisk usuwania blokady. Uruchom obrazowanie stosu obrazów Z i zapisz stos obrazów jako reference_N, gdzie N jest numerem sekwencyjnym każdego pola widzenia. Kliknij przycisk XY z wieloma pozycjami w oknie akwizycji wielowymiarowej.Następnie wybierz następne pole view i kliknij przycisk przejdź, aby przenieść zmotoryzowaną scenę do drugiego pola widzenia. Powtórz ten krok dla każdego pola view. Lokalizacja jądrowa białka związanego z tak lub YAP w łokciach B2B wzrastała wraz ze wzrostem sztywności substratu, podczas gdy komórki PC-9 wykazywały podobne stężenie YAP w jądrze i cytoplazmie na podłożach o różnej sztywności.Komórka B2B monotonicznie zwiększała obszar rozprzestrzeniania się w czasie, wraz ze spadkiem stosunku jądra YAP do cytoplazmy, podczas gdy komórka PC-9 utrzymywała stosunkowo niezmienny obszar rozprzestrzeniania się komórki, orientację i stosunek jądra YAP do cytoplazmy w całym 10-godzinnym procesie rozprzestrzeniania się. W ciągu 10 godzin wczesnego rozprzestrzeniania się reprezentatywna komórka B2B konstytutywnie zdeformowała powierzchnię substratu i zastosowała trakcję komórkową zmieniającą się w czasie na całym obszarze komórki. W przeciwieństwie do tego, reprezentatywne ogniwo PC-9 rozwinęło przemieszczenie i trakcję tylko na 2 końcach ciała komórki, a jego przyczepność zmniejszyła się po 7,5 godziny.Stosunek jądra YAP do cytoplazmy i trakcja dipolowa komórek B2B wydawały się podążać za dwoma odrębnymi trendami, co sugeruje, że w eksperymencie mogły istnieć dwie grupy komórek B2B, które współistniały. W pierwszej grupie stosunek jądra do cytoplazmy YAP i trakcja dipolowa wzrosły wraz ze zwiększeniem obszaru rozprzestrzeniania się komórek i osiągnęły maksimum na około 1000 mikrometrów kwadratowych. W drugiej grupie stosunek jądra YAP do cytoplazmy i trakcja dipolowa rosły w wolniejszym tempie wraz ze wzrostem obszaru rozprzestrzeniania się komórek i utrzymywały prawie stałe wartości, gdy obszar rozprzestrzeniania się komórek nadal się zwiększał.Zakresy stosu Z dla wszystkich kanałów laserowych muszą być dokładnie określone, aby przezwyciężyć potencjalny dryft pola widzenia podczas ruchu stolika w obrazowaniu długoterminowym. Ta nowatorska technika umożliwia automatyczne, nieinwazyjne, długoterminowe i wielopozycyjne obrazowanie oraz może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu biologii molekularnej, który wymaga czasowego i przestrzennego śledzenia komórek i organelli.

all-optical-mechanobiology-interrogation-yes-associated-protein-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj wielofunkcyjny system do w pełni optycznego badania mechanobiologicznego białka YAP w ludzkich komórkach nowotworowych i normalnych. Ta metoda umożliwia automatyczne, wielokanałowe obrazowanie żywych komórek z korekcją dryfu.

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu (Wideo) | JoVE Journal

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

Przeglądaj więcej filmów