Name: Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę tworzenia sferoidów z komórek raka piersi i śródbłonka jako modelu 3D do badania mechanizmów proliferacji i przerzutów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Badań nad Rakiem / Szwajcarską Ligę Raka grant KFS-4125-02-2017 dla RKD oraz grant Narodowego Instytutu Zdrowia DK079307 dla EKJ.

1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Przeprowadzaj obsługę komórek w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Subkultura ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)
	<ol>
		<li>Kolby o długości75 cm 2 pokryć kolagenem (5 μg/cm2) (ogon szczura) przez noc (ON) w temperaturze pokojowej (RT) lub 2-3 h w temperaturze 37 °C, spłukać wodą i pozostawić kolbę do wyschnięcia.</li>
		<li>Hoduj HUVEC w pożywce wzrostowej (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) uzupełnionej glutaminą (1x = 2 mM), roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (AA; 100 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml penicyliny i 0,025 μg/ml amfoterycyny B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 3 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 10 μg/ml heparyny) i 10% FCS (płodowa surowica cielęca) w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2 ). Zmieniaj podłoże co 2 dni, aż komórki osiągną zbieżność 70%-80%.</li>
		<li>Umyj sub-zlewające się kultury 5 ml HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) i dodaj 3 ml trypsyny (0,25% rozcieńczonej w HBSS (bez Ca2+ i Mg2+). 
		UWAGA: HBSS można również zastąpić PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 minuty (sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki są odłączone i zaokrąglone do góry) i zatrzymać reakcję oddzielania przez dodanie 6 ml 10% pożywki FCS (DMEM-F12 lub EBM-2, 10% FCS).</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w pożywce wzrostowej i wysiewać nasiona w kolbach o długości 75cm2 lub szalkach hodowlanych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subkultura Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, ludzkie komórki gruczolakoraka piersi)
	<ol>
		<li>Hodować linie komórkowe ludzkiego raka piersi w 75 cm2 kolbach w pożywce wzrostowej (pożywka DMEM/F12 uzupełniona dostępną w handlu glutaminą (1x), roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (AA; 100 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml penicyliny i 0,025 μg/ml amfoterycyny B) i 10% FCS w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5 % emisji CO2 ). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
		<li>Przemyć subkonfluentne hodowle komórkowe (70%-80% konfluencji) 5 ml HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) i dodać 3 ml trypsyny (0,5% rozcieńczonej w HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) w temperaturze 37 °C przez 5 minut (mikroskopowo sprawdzić, czy komórki są oderwane). 
		UWAGA: HBSS można również zastąpić PBS.</li>
		<li>Dodać 8 ml 10% pożywki FCS w celu zatrzymania reakcji oddzielania, odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w pożywce wzrostowej i płytce w75 cm 2 kolbach lub szalkach hodowlanych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Formacja sferoidów
<ol>
	<li>Płytka 5 x 105 komórek/ml (HUVEC i MCF-7) w okrągłym naczyniu o średnicy 3,5 cm i hodowla przez 48 godzin.</li>
	<li>Poddawanie działaniu lub transfekcja posianych komórek przez 24 godziny lub w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Opcjonalny etap wykonywany na 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U: Umyj komórki 1 ml HBSS (Ca2+ i Mg2+) i wybarwić HUVEC za pomocą niebieskiego barwnika (0,5 μg/ml) i komórek MCF-7 za pomocą zielonego barwnika (0,5 μM) rozcieńczonego w odpowiednim podłożu wzrostowym i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30-40 minut.</li>
	<li>Umyj komórki 1 ml HBSS (bez Ca2+ i Mg2+), dodaj 1 ml enzymatycznego odczynnika oddzielającego (0,25% trypsyny dla HUVEC i 0,5% trypsyny dla MCF-7) do każdej okrągłej płytki za pomocą pipety P1000, a następnie inkubuj przez 2-5 minut, aż komórki zostaną odłączone.</li>
	<li>Zebrać każdy typ komórek osobno w okrągłodennej probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml i dodać 1 ml 10% pożywki FCS za pomocą pipety P1000, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Odwirować zawiesiny komórkowe o stężeniu 250 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i zawiesić komórki w 1 ml pożywki bezsteroidowej (EBM-2, glutamina, antybiotyk-antybiotyk, 0,4% FCS sf (węgiel drzewny). 
	UWAGA: Pożywkę bezsteroidową można zastąpić normalną pożywką wzrostową.</li>
	<li>Użyj 100 μl każdej zawiesiny komórkowej rozcieńczonej 10 ml rozcieńczalnika II (patrz tabela materiałów), aby określić całkowitą liczbę komórek i obliczyć ilość pożywki zabiegowej (EBM-2, glutamina, antybiotyk-antybiotyk, 0,4% FCS sf, nośnik/leczenie) potrzebnej do uzyskania zawiesiny komórek 5 x 103 komórek/ml lub 3,4 x 105 komórek/ml na typ komórek.
	<ol>
		<li>Liczba komórek
		<ol>
			<li>Włączyć urządzenie i przepłukać, naciskając przyciski Function i Start (konfiguracja S3), roztworem rozcieńczalnika II w fiolce z licznikiem komórek.</li>
			<li>Użyj konfiguracji S4 i naciśnij Start, aby zmierzyć ślepą próbę świeżym roztworem rozcieńczalnika II.</li>
			<li>Wymienić fiolkę scyntylacyjną na 100 μl zawiesiny komórek w 10 ml roztworu rozcieńczalnika II i zmierzyć próbki: ustawić S4 i nacisnąć Start.</li>
			<li>Zwróć uwagę na liczbę komórek na ml na wyświetlaczu cyfrowym. 
			UWAGA: Zliczanie komórek można również przeprowadzić przy użyciu innych systemów ręcznych lub automatycznych: linii siatki hemocytometru, technologii zliczania komórek z rozproszeniem światła, impedancji elektrycznej, systemów opartych na obrazowaniu wykorzystujących barwienie komórek, np. błękit trypanowy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U
		<ol>
			<li>Przygotuj 5 ml każdej zawiesiny komórek (5 x 103 komórki/ml) i wymieszaj je, aby uzyskać końcową objętość 10 ml w stosunku 1:1.</li>
			<li>Użyj ręcznej pipety powtarzalnej, aby odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki z 96-dołkowymi płytkami dolnymi w kształcie litery U.</li>
			<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej i sprawdzić, czy po 48 godzinach nie tworzą się sferoidy.</li>
			<li>Opcjonalny krok: Zrób zdjęcia sferoid (40x) za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. 
			UWAGA: Ta metoda generuje 96 sferoid (jedna sferoida/studzienka) po 48 godzinach (obszar 1-2 piksel2) i jest zwykle używana do badań wzrostu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wiszący drop
		<ol>
			<li>Wymieszaj zawiesiny komórek (3,4 x 105 komórek/ml) w stosunku 1:1, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.</li>
			<li>Za pomocą pipety P20 rozsiać mieszaninę komórek w postaci 15 μl kropli na odwróconej pokrywie 10 cm szalki Petriego.</li>
			<li>Odwróć pokrywkę z kroplami i dodaj 5 ml pożywki bazowej (EBM-2) na dno naczynia, aby uniknąć parowania kropli. 
			UWAGA: Ta metoda generuje jedną sferoidę/kroplę po 48 godzinach. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby nie łączyły się podczas zmiany pokrywy. W razie potrzeby użyj więcej niż jednej 10-centymetrowej szalki Petriego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Badanie wzrostu sferoidów
<ol>
	<li>Umieścić 100 μl mieszaniny komórek HUVEC i MCF-7 (5 x 102 komórek/dołek) na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U i umieścić je w inkubatorze.</li>
	<li>48 godzin po posiewie sprawdzić, czy nie tworzą się sferoidy za pomocą odwróconego mikroskopu (jasne pole). Zrób zdjęcia (co najmniej sześć zdjęć na zabieg, 40x) po 96 godzinach posiewu.</li>
	<li>Otwórz zdjęcia za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i przetwórz obraz do 300 pikseli/cal i zapisz obraz jako plik tiff.</li>
	<li>Pobierz oprogramowanie ImageJ i otwórz je. Kliknij opcję Plik i przejdź do Otwórz.</li>
	<li>Przekonwertuj obszary zainteresowania na nasycone czarne obszary w jednolity sposób, aby uzyskać obraz binarny (czarno-biały). W tym celu wybierz opcję Obraz, wybierz Typ | 8-bitowy. Teraz obraz jest czarno-biały.</li>
	<li>Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby narysować granicę sferoid.</li>
	<li>Aby obliczyć obszar zainteresowania i oddzielić obiekt lub piksele pierwszego planu od pikseli tła, użyj funkcji progu: Wybierz opcję Obraz, wybierz Dostosuj i kliknij Próg.</li>
	<li>Teraz otworzy się wyskakujące okienko Próg. Górny pasek wskazuje minimalną wartość progową: ustaw wartość na zero. Dolny pasek wskazuje maksymalną wartość progową: przesuwaj pasek, aż obszar zainteresowania stanie się całkowicie czerwony. 
	UWAGA: Jeśli kolor nie jest czerwony, wybierz opcję Czerwony w oknie Próg.</li>
	<li>Przejdź do punktu Analiza | Ustaw Measurements (Pomiary) i wybierz Area (Obszar i Obwód).</li>
	<li>Aby zmierzyć obszar zainteresowania, wybierz opcję Analizuj i użyj narzędzia Analizuj cząstki. W oknie Analizuj cząstki ustaw Rozmiar do zmierzenia (0,00003-Nieskończoność lub 3-Nieskończoność, w zależności od rozmiaru sferoid), wybierz opcję Podsumuj i Wyświetl wyniki. Następnie kliknij OK.</li>
	<li>Wyniki pojawią się na wykresie. Skopiuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego, aby przeanalizować dane. 
	UWAGA: Obszar jest obliczany jako łączna liczba pikseli; Użyj pola Powierzchnia całkowita do obliczeń.</li>
</ol>
4. Badanie immunohistochemiczne sferoidów
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Mieszaninę komórek HUVEC i MCF-7 (5 x 103 komórki / studzienkę) umieścić na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U w pożywce wzrostowej HUVEC przez 96 godzin.</li>
		<li>Zebrać około 50 sferoid do probówki o pojemności 1,5 ml z odciętą końcówką pipety P200 μL; pozwolić im opaść grawitacyjnie na dnie probówki, a następnie wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Utrwalić sferoidy za pomocą 500 μl 4% PFA przez 1 godzinę, RT.</li>
		<li>Gotować 2% roztwór agaru Nobla w PBS za pomocą płyty grzejnej z mieszadłem magnetycznym przez 3-5 minut, aby całkowicie rozpuścić proszek agarozy i schłodzić do około 60 °C.</li>
		<li>Usunąć PFA za pomocą pipety P1000, przemyć sferoidy 500 μl PBS i pozostawić do osadnienia. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ostrożnie odpipetować 600 μl roztworu agarozy do probówki o pojemności 1,5 ml ze sferoidami i natychmiast umieścić probówkę w wirówce z poziomym wirnikiem o wymiarach 177 x g na 2 minuty.</li>
		<li>Dodaj krótki sznurek w środku roztworu agarozy, aby łatwo wyjąć zatyczkę z probówki.</li>
		<li>Zestalić korek agarozowy na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Dodać 500 μl PBS do probówki o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć wysychania granulki. 
		UWAGA: Próbki są gotowe do późniejszego odwodnienia, zatopienia parafiny, przekrojenia, przeniesienia na szkiełka mikroskopowe i barwienia IHC (wykonanego przez Sophistolab).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja i przetwarzanie obrazu
	<ol>
		<li>Rejestruj obrazy przekrojów sferoidalnych za pomocą mikroskopu stereoskopowego.</li>
		<li>Zapisz trzy obrazy dla każdej próbki jako pliki .jpg.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie ImageJ. Otwórz obraz JPEG, kliknij Plik, a następnie Otwórz.</li>
		<li>Wybierz Kolor i Dekonwolucja kolorów w opcji Obraz.</li>
		<li>Wybierz H DAB vectors (Wektory H DAB) w oknie Color Deconvolution 1.7 (Dekonwolucja kolorów 1.7), a pojawią się trzy obrazy. 
		UWAGA: Trzy obrazy to: Kolor 1 reprezentuje tylko barwienie hematoksyną (niebieski/fioletowy), a kolor 2 reprezentuje tylko barwienie DAB (brązowy). Kolor 3 nie jest potrzebny do analizy obrazu z dwoma barwieniami.</li>
		<li>Wybierz okno Kolor 1 i ustaw Próg: przejdź do punktu menu Obraz | Dostosuj i kliknij Próg. Zostanie wyświetlone okno Próg.</li>
		<li>Pozostaw minimalną wartość progową ustawioną na zero i dostosuj maksymalną wartość progową, aby usunąć sygnał tła bez wpływu na sygnał rzeczywisty. Kliknij Zastosuj.
		<ol>
			<li>Pomiar powierzchni
			<ol>
				<li>Kliknij Analizuj, wybierz Ustaw miarę. Wybierz Obszar, Średnia wartość szarości oraz Min i Max wartość szarości, a następnie kliknij OK, aby potwierdzić.</li>
				<li>Zmierz rozmiar jądra za pomocą opcji Analizuj, a następnie wybierz opcję Zmierz. 
				UWAGA: W oknie Wyniki wyświetlana jest nazwa obrazu (Etykieta), rozmiar obrazu (Obszar), średnia intensywność pikseli obrazu IHC (Średnia) oraz minimalne i maksymalne wartości szarości (Min., Maks.). Do obliczeń należy użyć wartości średniej.</li>
				<li>Powtórz kroki 4.2.6-4.7.1.2 dla okna Kolor 2 (i Kolor 3, jeśli występuje podwójne barwienie).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Kwantyfikacja komórek
			<ol>
				<li>Kliknij Proces, wybierz opcję Binarny i wybierz Zlewnia, aby oddzielić komórki.</li>
				<li>Przejdź do Analizuj i kliknij Analizuj cząstki. W oknie podręcznym Analizuj cząstki ustaw rozmiar komórek, aby wykluczyć nieokreślone cząstki. Następnie w opcji Pokaż kliknij listę rozwijaną i wybierz Konspekty. Następnie kliknij OK.</li>
				<li>Powtórz kroki 4.2.6-4.2.7 i kroki kwantyfikacji komórek (sekcja 4.2.7.2) dla okna Kolor 2 (i Kolor 3, jeśli występuje podwójne barwienie). 
				UWAGA: Teraz pojawią się trzy okna: 1) Wyniki podsumowania (liczba zliczonych komórek, łączna powierzchnia, średni rozmiar, % powierzchni i średnia), 2) Wyniki (w zależności od zliczanych komórek) i 3) Okno rysowania (przedstawiony obraz zliczanych komórek).</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Żywe/martwe barwienie w sferoidach
<ol>
	<li>Przygotować 4 mM roztwory podstawowe Calceiny AM w DMSO (barwi żywe komórki na zielono) i 2 mM homodimeru etydyny w DMSO (barwi martwe komórki na czerwono) w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Obliczyć ilość roztworu niezbędną do dodania 10 μl/basenik mieszaniny kalceiny AM i homodimeru etydyny rozcieńczonej w stosunku 1:50 w EBM-2.</li>
	<li>Dodać mieszaninę barwiącą do sferoid i umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej na 30-60 minut.</li>
	<li>Rejestruj zdjęcia (40x) za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
6. Izolacja białka sferoidy i RNA
<ol>
	<li>Przygotować zawiesiny komórek w proporcji 3,4 x 105 komórek/ml na typ komórek, wymieszać je w stosunku 1:1 i wysiać mieszaninę komórek za pomocą pipety P20 w postaci 15 μl kropli na pokrywie 10 cm szalki Petriego. Odwrócić pokrywkę i umieścić ją w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej na 96 godzin.</li>
	<li>Użyj 5-6 ml PBS, aby zebrać sferoidy w 15 ml okrągłodennej probówce z polistyrenu za pomocą sterylnych pipet polistyrenowych o pojemności 5 ml. 
	UWAGA: Możliwe jest również użycie probówek stożkowych o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę sferoid o stężeniu 250 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie zassać supernatant.</li>
	<li>Dodać 500 μl trypsyny (100%) i pipetować w górę iw dół za pomocą pipety P1000 przez 30 s, aby zdezagregować sferoidy, uzyskując zawiesinę komórek.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę 10% pożywką FCS, odwirować probówki przy 250 x g przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
	<li>Zgodnie z protokołem producenta (specjalny zestaw do izolacji RNA bez DNA), do lizy osadu komórkowego należy użyć 300 μl buforu do lizy RNA. 
	UWAGA: Bufor do lizy może być również bezpośrednio dodawany do nienaruszonych sferoid (nie jest wymagany etap trypsyny) w celu ekstrakcji RNA. Dodać 300 μl buforu do lizy do granulowanych sferoid, umieścić probówki w lodzie i rozcierać 10 razy za pomocą pipety P200. Następnie wyizoluj RNA jak powyżej. Dysocjacja sferoidalna może być potrzebna, jeśli odzysk RNA jest niski z powodu interferencji macierzy.</li>
	<li>Alternatywnie należy użyć 70 μl buforu do lizy do izolacji białek. Homogenizować przez 2-4 s metodą sonikacji i określić stężenie białka zgodnie z protokołem producenta za pomocą zestawu testowego BCA. 
	UWAGA: W celu izolacji białek, granulowane sferoidy mogą być poddawane lizie bezpośrednio w buforze do lizy, a następnie poddawane sonikacji. Użyj 25 μg białka całkowitego do wykonania western blot.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W porównaniu z hodowlami komórkowymi 2D, rewolucyjna technologia hodowli sferoidalnych 3D jest lepszym i potężniejszym narzędziem do rekonstrukcji mikrośrodowiska narządu, interakcji komórka-komórka i reakcji na leki in vitro. Jest to pierwszy protokół opisujący powstawanie sferoid z wielokomórkowych (nabłonkowych i śródbłonkowych) linii komórkowych do badań nad rakiem piersi. Protokół ten zapewnia sferoidalny wzrost sferoidów w 3D przez okres do 5 dni, a sferoidy można badać po zatopieniu parafiny, pocięciu i b...

Wykorzystanie zwierząt do eksperymentów ma ograniczenia. Badania na zwierzętach nie mogą dokładnie naśladować postępu choroby u ludzi, a zwierzęta i ludzie nie mają identycznych reakcji na patogeny. Dodatkowo, ograniczenia w eksperymentach na zwierzętach spowodowane obawami o cierpienie zwierząt i problemami etycznymi1,2 coraz bardziej ograniczają programy badawcze. Systemy in vitro zostały szeroko opracowane w celu obejścia wykorzystywania zwierząt; Co więcej, wykorzystanie komórek ludzkich sprawiło, że modele in vitro stały się bardziej przydatne w badaniach patofizjologicznych i terapeutycznych. Konwencjonalne monowarstwowe (2D) hodowle komórkowe są szeroko stosowane, ponieważ do pewnego stopnia naśladują ludzkie tkanki. Jednak monokultury 2D nie są w stanie naśladować ludzkich narządów, a monokultury 2D nie są w stanie symulować złożonego mikrośrodowiska oryginalnych narządów i naśladować sytuacji in vivo3,4,5,6. Dodatkowo, w jednowarstwowych hodowlach komórkowych, leczenie farmakologiczne może łatwo zniszczyć/uszkodzić wszystkie komórki. Co ważne, niektóre z tych ograniczeń można pokonać, przechodząc na wielowarstwowe trójwymiarowe (3D) hodowle komórek7,8. W rzeczywistości wykazano, że modele hodowli 3D lepiej odzwierciedlają strukturę komórkową, układ i funkcję komórek w tkankach pierwotnych. Te kultury 3D mogą być tworzone przy użyciu różnych linii komórkowych, podobnie jak funkcjonalny narząd. Rzeczywiście, istnieją dwa modele kultur 3D. Jeden model wytwarza sferoidy zagregowanych komórek, które tworzą klastry i reorganizują je w sfery (modele bez rusztowań). Drugi daje organoidy, które mają bardziej złożoną strukturę i składają się z kombinacji wielu komórek specyficznych dla narządów, które są uważane za miniaturową wersję organów9,10. Z tego powodu systemy hodowli 3D stanowią innowacyjną technologię o wielu zastosowaniach biologicznych i klinicznych. Tak więc sferoidy i organoidy mają wiele zastosowań w modelowaniu chorób i badaniach związanych z medycyną regeneracyjną, badaniami przesiewowymi leków i badaniami toksykologicznymi6,11,12,13,14,15. Rakotwórcze sferoidy, wywodzące się z technologii 3D, odtwarzają morfologię i fenotyp odpowiednich typów komórek, naśladują mikrośrodowisko guza in vivo oraz modelują komunikację komórkową i szlaki sygnałowe, które działają podczas rozwoju nowotworu16,17,18. Ponadto, aby lepiej zrozumieć biologię raka, sferoidy/organoidy nowotworowe mogą być również wykorzystywane do identyfikacji potencjalnej terapii przeciwnowotworowej specyficznej dla pacjenta (spersonalizowanej) i oceny jej skuteczności, toksyczności i długoterminowych skutków19,20,21,22. Sferoidy otworzyły znaczące możliwości badania patofizjologii, modelowania chorób i badań przesiewowych leków ze względu na ich zdolność do zachowania komórkowej i trójwymiarowej architektury tkankowej, zdolność do naśladowania sytuacji in vivo oraz interakcji komórka-komórka. Należy jednak również zdawać sobie sprawę z ograniczeń tego systemu, takich jak brak komponentu naczyniowego/ogólnoustrojowego, funkcjonalnego układu odpornościowego lub nerwowego, a system ten reprezentuje podejście redukcjonistyczne w porównaniu z modelami zwierzęcymi. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do modeli zwierzęcych, struktury 3D zapewniają jedynie przybliżenie biologii w ludzkim ciele. Zrozumienie ograniczeń metody 3D może pomóc naukowcom w zaprojektowaniu bardziej wyrafinowanych i prawidłowych procesów wytwarzania sferoid, które lepiej reprezentują narząd w większej skali23,24,25.
Rak jest główną przyczyną zgonów na całym świecie, a rak piersi jest najczęstszym nowotworem u kobiet26,27,28. Aby naśladować złożone mikrośrodowisko raka piersi, sferoidy raka piersi powinny być hodowane przy użyciu komórek, które odgrywają znaczącą rolę w nowotworach piersi, tj. komórek nabłonka, komórek śródbłonka, fibroblastów i/lub komórek odpornościowych. Ponadto, w przypadku sferoidy reprezentującej raka piersi, należy również wziąć pod uwagę ekspresję żeńskich receptorów hormonalnych (receptorów estrogenowych/progesteronowych), zdolność do zachowania stanu histologicznego guza pacjenta oraz zdolność do naśladowania odpowiedzi na leczenie. Badania wykazały, że systemy kohodowli 3D mają organizację komórkową podobną do tkanki pierwotnej in vivo, mają zdolność reagowania w czasie rzeczywistym na bodźce i mają funkcjonalne receptory androgenowe29,30,31,32. W związku z tym podobne podejście może być przydatne do naśladowania guza piersi in vitro. Celem obecnego protokołu jest ustanowienie nowej metody generowania sferoid raka piersi. Metoda ta wykorzystuje komórki MCF-7 z dodatnim receptorem estrogenowym (nieśmiertelna ludzka linia komórkowa komórek nabłonkowych) i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych (HUVEC) lub komórki śródbłonka limfatycznego (HMVEC-DNeo) w celu stworzenia modelu, który naśladuje lub ściśle odzwierciedla interakcje między tymi komórkami w guzie. Chociaż MCF-7 (reagujące na estrogeny) i komórki śródbłonka zostały wykorzystane do rozwoju sferoid w obecnym badaniu, inne komórki, takie jak fibroblasty, które stanowią ~ 80% masy guza piersi, mogą być również połączone w przyszłości, aby lepiej reprezentować i naśladować guz piersi.
Istnieje kilka metod tworzenia sferoid, takich jak: 1) metoda wiszących kropel, która wykorzystuje grawitację33,34; 2) metoda lewitacji magnetycznej, która wykorzystuje nanocząstki magnetyczne wystawione na działanie zewnętrznego magnesu35, oraz 3) metoda mikropłytki sferoidalnej, która jest wykonywana przez wysiewanie komórek na płytkach o niskim przyczepie36,37. Na podstawie istniejących metod, które wykorzystują tylko jeden typ komórek, obecny protokół został zoptymalizowany przy użyciu komórek nabłonka i śródbłonka, aby lepiej naśladować warunki wzrostu guzów raka piersi in vivo38,39,40,41. Metodę tę można łatwo osiągnąć w laboratorium przy niskich kosztach i minimalnych wymaganiach sprzętowych. W oparciu o potrzeby/cele laboratorium, zastosowano różne podejścia do tworzenia sferoid i pozyskiwania odpowiedniego materiału komórkowego z tych sferoid. W tym kontekście, w przypadku analizy DNA, RNA lub białek, sferoidy 3D są wytwarzane przez jednoczesną hodowlę komórek śródbłonka i nabłonka metodą wiszącej kropli. Jednak w przypadku badań funkcjonalnych, na przykład w celu monitorowania wzrostu komórek po transfekcji krótkich zakłóceń (siRNA) i/lub leczeniu hormonalnym, sferoidy są generowane przy użyciu płytek U-bottom.
Celem tego technicznego protokołu jest dostarczenie szczegółowego opisu krok po kroku dla 1) tworzenia wielokomórkowych sferoidów raka piersi, 2) przygotowania próbek do barwienia histologicznego oraz 3) zbierania komórek do ekstrakcji RNA, DNA i białek. Zarówno niedroga metoda wiszącego kropli, jak i droższe płyty dolne w kształcie litery U są używane do tworzenia sferoid. W tym miejscu przedstawiono protokół przygotowania (utrwalania) sferoid do cięcia, a następnie barwienia immunologicznego za pomocą markerów w celu oceny proliferacji komórek, apoptozy i rozmieszczenia komórek nabłonka i śródbłonka w sferoidzie. Dodatkowo protokół ten pokazuje pełną analizę danych histologicznych krok po kroku za pomocą oprogramowania ImageJ. Interpretacja danych biologicznych różni się w zależności od rodzaju eksperymentu i zastosowanych przeciwciał. Cięcie nieruchomych sferoid, a następnie barwienie skrawków zostało przeprowadzone przez rutynowe laboratorium patomorfologiczne (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table><tbody><tr><td>100 mm i razy; 20 mm Naczynia hodowlane poddane działaniu kultur tkankowych</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>149MULTI0C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipet serologiczny, polistyren, pakowany pojedynczo, sterylny</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td></td><td></td><td>Wersja: 13.0.1 (64- bit)</td></tr> <tr><td>Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100 razy;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (klaster różnicowania 31)</td> <td>Cell Marque</td><td>131M-95</td><td>monoklonalna mysz ab klon JC70</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA (dioctan 5-chlorometylofluoresceiny)</td> <td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CK8/18 (cytokeratyny 8 i 18)</td> <td>DBS</td><td>Mob189-05</td><td>mysz monoklonalna ab, klon 5D3</td></tr><tr><td>CKX41 Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td>Aparat cyfrowy Olympus DP27</td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza 3</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9661L</td><td>poliklonalny królik ab</td></tr><tr><td>Kolagen (ogon szczura)</td><td>Roche</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>Redlica ISOTON II Rozcieńczalnik</td><td>Beckman Coulter</td><td>844 80 11</td><td>Rozcieńczalnik II</td></tr><tr><td>Redlica Z1, Redlica z licznikiem komórek</td><td> Elektronika, Luton, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwodnione podłoża hodowlane: Szlachetny agar</td><td>BD Difco</td><td>BD 214220</td><td></td></tr><tr><td>Skórny mikronaczyniowy śródbłonek noworodków, łączeni dawcy (HMVEC-DNeo)</td><td>Lonza</td><td>CC-2516</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 Szynka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6434</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Wzrost komórek śródbłonka Podłoże podstawowe-2</td><td>Lonza</td><td>190860</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu Charcoal Stripped (FCS sf)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3006803</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopy fluorescencyjne Leica M205 FA</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC &ndash; Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, USA</td><td></td><td>Wayne Rasband Wersja: 1.52a (64-bitowa)</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Cell Marque</td><td>275R-16</td><td>monoklonalny królik ab, klon SP6</td></tr><tr><td>W pełni zmotoryzowany stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny Leica</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td><td></td><td>149MULTI0C1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw suplementów wzrostu o niskiej surowicy (zestaw LSGS)</td> <td>Komórki Gibco</td><td>S003K</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 &ndash; ludzka linia komórkowa gruczolakoraka piersi</td><td>Klinika Ginekologii, Szpital Uniwersytecki w Zurychu</td><td></td><td>Opracowany przez dr Andr&egrave; Fedier uzyskany z płytki ATCC</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96U-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174925</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x</td><td></td> Zestaw do oznaczania białek <td>BCA Gibco</td> 10010015 <td></td></tr><tr><td>Pierce Thermo</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy białek</td><td>Sygnalizacja komórkowa, Danvers, USA</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprzygotowawczy Quick-RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1060-1-100</td><td>Zawartość w zestawie Quick-RNA Miniprep</td></tr><tr><td>Wirówka Rotina 46R Okrągłe</td> probówki polistyrenowe <td>Hettich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Tecan Infinite serii M200</td><td>Tecan, Salzburg, AU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych 75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr></tbody></table>

sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Rak piersi jest główną przyczyną śmiertelności kobiet. Wzrost komórek raka piersi i ich późniejsze przerzuty są kluczowym czynnikiem jego progresji. Chociaż mechanizmy zaangażowane w promowanie wzrostu raka piersi były intensywnie badane przy użyciu monokultur komórek raka piersi, takich jak komórki MCF-7, udział innych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka naczyniowego i limfatycznego, które są ściśle zaangażowane we wzrost guza, nie został dogłębnie zbadany. Interakcja komórka-komórka odgrywa kluczową rolę we wzroście i progresji guza. Neoangiogeneza, czyli rozwój naczyń krwionośnych, jest niezbędna do wzrostu guza, podczas gdy układ limfatyczny służy jako portal dla migracji komórek rakowych i późniejszych przerzutów. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że komórki śródbłonka naczyń krwionośnych i limfatycznych mogą znacząco wpływać na wzrost komórek rakowych. Obserwacje te wskazują na potrzebę opracowania modeli in vitro, które bardziej realistycznie odzwierciedlałyby procesy wzrostu raka piersi in vivo. Co więcej, ograniczenia w badaniach na zwierzętach wymagają opracowania modeli ex vivo, aby lepiej wyjaśnić związane z tym mechanizmy.
Ten artykuł opisuje rozwój sferoid raka piersi składających się zarówno z komórek raka piersi (komórki MCF-7 z dodatnim receptorem estrogenowym), jak i komórek śródbłonka naczyniowego i/lub limfatycznego. Protokół opisuje szczegółowe podejście krok po kroku do tworzenia sferoid dwukomórkowych przy użyciu dwóch różnych podejść, wiszącego kropli (złoty standard i tani) oraz 96-dołkowych płytek U-bottom (drogich). Podano szczegółowe instrukcje dotyczące delikatnego podnoszenia uformowanych sferoid w celu monitorowania wzrostu poprzez mikroskopijne wymiarowanie i ocenę żywotności przy użyciu barwienia martwych i żywych komórek. Ponadto nakreślono procedury mocowania sferoid do cięcia i barwienia przeciwciałami specyficznymi dla wzrostu w celu różnicowania wzorców wzrostu sferoidów. Dodatkowo podano szczegóły dotyczące przygotowania sferoid z transfekowanymi komórkami oraz metod ekstrakcji RNA do analizy molekularnej. Podsumowując, ten artykuł zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania sferoid wielokomórkowych do badań nad rakiem piersi.

Model sferoidów z wykorzystaniem kokultur nabłonkowych i śródbłonkowych jest niezbędny do wiernego odtworzenia warunków in vivo guzów piersi w eksperymentach in vitro. Schemat przedstawiony na Rysunku 1 obrazuje protokół tworzenia sferoidów z nabłonkowych komórek raka piersi oraz śródbłonkowych komórek naczyniowych lub limfatycznych (Rysunek 1). Każdy typ komórek wysiewa się osobno do okrągłej szalki o średnicy 3,5 cm, a następnie poddaje dział...

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Opisane w niniejszym dokumencie sferoidy komórek raka piersi pozwolą naukowcom zbadać mechanizmy molekularne interakcji komórek śródbłonka komórek rakowych, które są zaangażowane w proliferację i przerzuty komórek nowotworowych. Główną zaletą tego modelu 3D jest to, że zapewnia bardziej realistyczny układ komórek, który poprawia wiarygodność wnioskowania dotyczącego patofizjologii i leczenia raka piersi. Procedurę zademonstruje Giovanna Azzarito, doktorantka z mojego laboratorium.Rozpocznij od traktowania lub transfekcji posianych komórek przez 24 godziny lub zgodnie z życzeniem. Aby zidentyfikować rozmieszczenie komórek w sferoidzie, umyj komórki jednym mililitrem zbilansowanego roztworu soli Hanksa lub HBSS, zawierającego wapń i magnez, i pozostań w HUVEC, używając 0,5 mikrograma na mililitr niebieskiego barwnika. I komórki MCF-7 przy użyciu 0,5 mikromolowego zielonego barwnika rozcieńczonego w odniesieniu do pożywki wzrostowej.Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym CO2 na 30 do 40 minut. Umyj komórki jednym mililitrem HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj jeden mililitr enzymatycznego odczynnika odłączającego, który składa się z 0,25% trypsyny dla HUVEC i 0,5% ruchu w czterech MCF-7 do każdego brązowego naczynia za pomocą pipety P1000.Wybierz każdy typ komórki osobno w pięciomililitrowej probówce z polistyrenu o okrągłym dnie i dodaj jeden mililitr 10% płodowej surowicy cielęcej lub pożywki FCS za pomocą pipety P1000, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Następnie odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 250 razy G przez pięć minut. Ostrożnie odessać supernatant i zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki wolnej od steroidów.Użyj 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej rozcieńczonej 10 mililitrami rozcieńczalnika 2, aby określić całkowitą liczbę komórek. Włączyć urządzenie i przepłukać, naciskając przyciski funkcyjne i start, roztworem Diluent 2 w fiolce z licznikiem komórek. Użyj zestawu jako cztery i naciśnij start, aby zmierzyć ślepą próbę świeżym roztworem rozcieńczalnika 2.Zamień fiolkę scyntylacyjną na 100 mikrolitrów zawiesiny komórek w 10 mililitrach roztworu rozcieńczalnika 2. Użyj opcji Ustaw jako cztery i naciśnij start, aby zmierzyć próbki. Zanotuj liczbę komórek na mililitr na wyświetlaczu cyfrowym, a następnie przygotuj pięć mililitrów każdej zawiesiny komórek i wymieszaj je, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów w stosunku jeden do jednego, używając ręcznej pipety powtarzalnej, aby odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U.Umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej i sprawdzić, czy po 48 godzinach nie tworzą się sferoidy. Zrób zdjęcia tej sferoidy w 40-krotnym powiększeniu za pomocą kontrastu fazowego lub fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Aby przygotować hodowlę wiszącą, wymieszaj zawiesiny komórek w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów.Użyj pipety P20, aby zobaczyć mieszaninę komórek w postaci 15 mikrolitrowych kropli na odwróconym przewodzie 10-centymetrowej szalki Petriego. Odwróć pokrywkę z kroplami i dodaj pięć mililitrów pożywki bazowej EBM-2 na dno naczynia, aby uniknąć parowania kropli. Zbierz około 50 sferoid w 1,5-mililitrowej probówce z końcówką jelitową pipety mikrolitrowej P200.Pozwól im opaść grawitacyjnie na dnie probówki, a następnie wyrzuć supernatant. Napraw te sferoidy za pomocą 500 mikrolitrów 4% PFA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Gotuj 2% roztwór Algor Nobla w PBS za pomocą płyty grzejnej z mieszadłem magnetycznym przez trzy do pięciu minut, aby całkowicie rozpuścić wróżbowy proszek i schłodzić do około 60 stopni Celsjusza.Usuń PFA za pomocą pipety P1000, umyj te sferoidy 500 mikrolitrami PBS i pozwól im się osadzić. Po osadzeniu się supernatant należy ostrożnie odpipetować 600 mikrolitrów roztworu Agory do 1,5 mililitrowej probówki ze sferoidami i natychmiast umieścić probówkę w wirówce z poziomym wirnikiem o temperaturze 177 razy G na dwie minuty. Dodaj krótki sznurek na środku Agro Solution, aby łatwo wyjąć korek z tubki.Zestal korek Agros na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodaj 500 mikrolitrów PBS do 1,5 mililitrowej probówki, aby uniknąć wysuszenia granulki. Rejestruj obrazy przekrojów sferoidalnych za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Obliczyć ilość roztworu niezbędną do dodania 10 mikrolitrów na studzienkę mieszaniny homodimerów wapnia, Aam i etydyny rozcieńczonej przy użyciu EBM-2 w stosunku jeden do 50.Dodać mieszaninę barwiącą do sferoid i umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej na 30 do 60 minut. Rób zdjęcia w powiększeniu 40x za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. W płytkach z dnem w kształcie litery U tworzenie się sferoid zaobserwowano 48 godzin po wysiewie siedmiu komórek MCF.Nie zaobserwowano jednak powstawania sferoid w przypadku komórek śródbłonka czy komórek limfatycznych. Wysiewanie MCF siedem plus komórek śródbłonka lub MCF siedem plus komórki limfatyczne w stosunku jeden do jednego również spowodowało powstanie sferoidów. Zależny od czasu sekwencyjny wzrost sferoidy MCF seven zarejestrowano w zakresie od 24 do 120 godzin.Rozmiar sferoid zwiększył się z około 100 mikrometrów do około 200 mikrometrów w ciągu pięciu dni. Ze zwiększoną szybkością wzrostu obserwowaną w sferoidach poddanych działaniu stymulatora wzrostu. Struktura sferoidów i kształt ich komórek nie wykazywały żadnych nieprawidłowości po transfekcji oligonukleotydami kontrolnymi w obecności lipofekcaminy.Komórki wyrażające ich marker proliferacyjny Ki-67 były rozmieszczone jednorodnie w tych sferoidach. Rozszczepienie do kaspazy trzy barwienie tych sferoid wykazało apatyczne komórki po czterech dniach hodowli. Badanie komórek w tych sferoidach z CD-31 i Ki-67 wykazało, że 55% komórek jest nabłonkowych, 45% to śródbłonek, a 25% komórek się proliferuje.Aby ocenić procent żywych i martwych komórek, czterodniowe sferoidy wybarwiono wapniem Aam i homodimerem etydyny. Świeżo przemyślana sferoida, która również wybarwia martwe i żywe komórki, ujawniła, że sferoidy są bardzo wrażliwe na warunki zamarzania. Postępując zgodnie z jego protokołem, upewnij się, że zdrowe komórki są używane do mieszania afrodyty Kolejną rzeczą do zapamiętania byłoby unikanie uszkadzania tych afrodyt podczas czapki DP, aby uzyskać dobre sekcje, które zapewniają również podniebienie afrodyty, zanim dojdzie do polimeryzacji.Model ten można jeszcze udoskonalić, uwzględniając inne komórki, takie jak fibroblasty biorące udział w progresji nowotworu, i wykorzystując go do oceny skuteczności środków terapeutycznych ukierunkowanych na wzrost nowotworu.

mammary-epithelial-endothelial-cell-spheroids-as-potential-functional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę tworzenia sferoidów z komórek raka piersi i śródbłonka jako modelu 3D do badania mechanizmów proliferacji i przerzutów nowotworowych.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Przeglądaj więcej filmów