Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Opisane w niniejszym dokumencie sferoidy komórek raka piersi pozwolą naukowcom zbadać mechanizmy molekularne interakcji komórek śródbłonka komórek rakowych, które są zaangażowane w proliferację i przerzuty komórek nowotworowych. Główną zaletą tego modelu 3D jest to, że zapewnia bardziej realistyczny układ komórek, który poprawia wiarygodność wnioskowania dotyczącego patofizjologii i leczenia raka piersi. Procedurę zademonstruje Giovanna Azzarito, doktorantka z mojego laboratorium.

Rozpocznij od traktowania lub transfekcji posianych komórek przez 24 godziny lub zgodnie z życzeniem. Aby zidentyfikować rozmieszczenie komórek w sferoidzie, umyj komórki jednym mililitrem zbilansowanego roztworu soli Hanksa lub HBSS, zawierającego wapń i magnez, i pozostań w HUVEC, używając 0,5 mikrograma na mililitr niebieskiego barwnika. I komórki MCF-7 przy użyciu 0,5 mikromolowego zielonego barwnika rozcieńczonego w odniesieniu do pożywki wzrostowej.

Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym CO2 na 30 do 40 minut. Umyj komórki jednym mililitrem HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj jeden mililitr enzymatycznego odczynnika odłączającego, który składa się z 0,25% trypsyny dla HUVEC i 0,5% ruchu w czterech MCF-7 do każdego brązowego naczynia za pomocą pipety P1000.

Wybierz każdy typ komórki osobno w pięciomililitrowej probówce z polistyrenu o okrągłym dnie i dodaj jeden mililitr 10% płodowej surowicy cielęcej lub pożywki FCS za pomocą pipety P1000, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Następnie odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 250 razy G przez pięć minut. Ostrożnie odessać supernatant i zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki wolnej od steroidów.

Użyj 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej rozcieńczonej 10 mililitrami rozcieńczalnika 2, aby określić całkowitą liczbę komórek. Włączyć urządzenie i przepłukać, naciskając przyciski funkcyjne i start, roztworem Diluent 2 w fiolce z licznikiem komórek. Użyj zestawu jako cztery i naciśnij start, aby zmierzyć ślepą próbę świeżym roztworem rozcieńczalnika 2.

Zamień fiolkę scyntylacyjną na 100 mikrolitrów zawiesiny komórek w 10 mililitrach roztworu rozcieńczalnika 2. Użyj opcji Ustaw jako cztery i naciśnij start, aby zmierzyć próbki. Zanotuj liczbę komórek na mililitr na wyświetlaczu cyfrowym, a następnie przygotuj pięć mililitrów każdej zawiesiny komórek i wymieszaj je, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów w stosunku jeden do jednego, używając ręcznej pipety powtarzalnej, aby odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U.

Umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej i sprawdzić, czy po 48 godzinach nie tworzą się sferoidy. Zrób zdjęcia tej sferoidy w 40-krotnym powiększeniu za pomocą kontrastu fazowego lub fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Aby przygotować hodowlę wiszącą, wymieszaj zawiesiny komórek w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów.

Użyj pipety P20, aby zobaczyć mieszaninę komórek w postaci 15 mikrolitrowych kropli na odwróconym przewodzie 10-centymetrowej szalki Petriego. Odwróć pokrywkę z kroplami i dodaj pięć mililitrów pożywki bazowej EBM-2 na dno naczynia, aby uniknąć parowania kropli. Zbierz około 50 sferoid w 1,5-mililitrowej probówce z końcówką jelitową pipety mikrolitrowej P200.

Pozwól im opaść grawitacyjnie na dnie probówki, a następnie wyrzuć supernatant. Napraw te sferoidy za pomocą 500 mikrolitrów 4% PFA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Gotuj 2% roztwór Algor Nobla w PBS za pomocą płyty grzejnej z mieszadłem magnetycznym przez trzy do pięciu minut, aby całkowicie rozpuścić wróżbowy proszek i schłodzić do około 60 stopni Celsjusza.

Usuń PFA za pomocą pipety P1000, umyj te sferoidy 500 mikrolitrami PBS i pozwól im się osadzić. Po osadzeniu się supernatant należy ostrożnie odpipetować 600 mikrolitrów roztworu Agory do 1,5 mililitrowej probówki ze sferoidami i natychmiast umieścić probówkę w wirówce z poziomym wirnikiem o temperaturze 177 razy G na dwie minuty. Dodaj krótki sznurek na środku Agro Solution, aby łatwo wyjąć korek z tubki.

Zestal korek Agros na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodaj 500 mikrolitrów PBS do 1,5 mililitrowej probówki, aby uniknąć wysuszenia granulki. Rejestruj obrazy przekrojów sferoidalnych za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Obliczyć ilość roztworu niezbędną do dodania 10 mikrolitrów na studzienkę mieszaniny homodimerów wapnia, Aam i etydyny rozcieńczonej przy użyciu EBM-2 w stosunku jeden do 50.

Dodać mieszaninę barwiącą do sferoid i umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej na 30 do 60 minut. Rób zdjęcia w powiększeniu 40x za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. W płytkach z dnem w kształcie litery U tworzenie się sferoid zaobserwowano 48 godzin po wysiewie siedmiu komórek MCF.

Nie zaobserwowano jednak powstawania sferoid w przypadku komórek śródbłonka czy komórek limfatycznych. Wysiewanie MCF siedem plus komórek śródbłonka lub MCF siedem plus komórki limfatyczne w stosunku jeden do jednego również spowodowało powstanie sferoidów. Zależny od czasu sekwencyjny wzrost sferoidy MCF seven zarejestrowano w zakresie od 24 do 120 godzin.

Rozmiar sferoid zwiększył się z około 100 mikrometrów do około 200 mikrometrów w ciągu pięciu dni. Ze zwiększoną szybkością wzrostu obserwowaną w sferoidach poddanych działaniu stymulatora wzrostu. Struktura sferoidów i kształt ich komórek nie wykazywały żadnych nieprawidłowości po transfekcji oligonukleotydami kontrolnymi w obecności lipofekcaminy.

Komórki wyrażające ich marker proliferacyjny Ki-67 były rozmieszczone jednorodnie w tych sferoidach. Rozszczepienie do kaspazy trzy barwienie tych sferoid wykazało apatyczne komórki po czterech dniach hodowli. Badanie komórek w tych sferoidach z CD-31 i Ki-67 wykazało, że 55% komórek jest nabłonkowych, 45% to śródbłonek, a 25% komórek się proliferuje.

Aby ocenić procent żywych i martwych komórek, czterodniowe sferoidy wybarwiono wapniem Aam i homodimerem etydyny. Świeżo przemyślana sferoida, która również wybarwia martwe i żywe komórki, ujawniła, że sferoidy są bardzo wrażliwe na warunki zamarzania. Postępując zgodnie z jego protokołem, upewnij się, że zdrowe komórki są używane do mieszania afrodyty Kolejną rzeczą do zapamiętania byłoby unikanie uszkadzania tych afrodyt podczas czapki DP, aby uzyskać dobre sekcje, które zapewniają również podniebienie afrodyty, zanim dojdzie do polimeryzacji.

Model ten można jeszcze udoskonalić, uwzględniając inne komórki, takie jak fibroblasty biorące udział w progresji nowotworu, i wykorzystując go do oceny skuteczności środków terapeutycznych ukierunkowanych na wzrost nowotworu.