DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

Metoda ta pozwala nam analizować, wizualizować i określać ilościowo architekturę układu wątrobowego, naczyniowego i żółciowego w 3D. Możemy teraz lepiej zrozumieć przestrzenne aspekty chorób wątroby i jej regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie opiera się ona na istnieniu przeciwciał ani obrazowaniu fluorescencyjnym.

Pozwala również na bezpośrednią wizualizację, które sieci są odpowiednio lumenizowane. Metoda ta nadaje się do analizy układów rurowych, dlatego badania naczyń krwionośnych, dróg żółciowych i dróg oddechowych są idealnymi obszarami. Wykorzystaliśmy DUCT, aby zrozumieć zmiany strukturalne związane z regeneracją dróg żółciowych.

Przed wstrzyknięciem żywicy do układu żółciowego myszy należy rozpocząć przesuwanie jelita i trzustki na lewą stronę myszy, używając bawełnianego wacika zwilżonego PBS, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy i żyłę wrotną. Następnie wykonaj małe poprzeczne nacięcie w żyle głównej dolnej. Odwróć brzuszną stronę wątroby w kierunku serca, aby odsłonić powierzchnię trzewną i obszar wnęki, a następnie zlokalizuj wspólny przewód żółciowy, który biegnie od obszaru wnęki przez trzustkę i do jelita przy zwieraczu Oddi.

Użyj prostych kleszczy, aby oczyścić otaczający obszar tkanki w odległości około pięciu milimetrów od wspólnego przewodu żółciowego. Następnie, umieszczając jedwabną nić do szwów pod wspólnym przewodzie żółciowym, zawiąż luźny węzeł wokół wspólnego przewodu żółciowego. Przytrzymaj nożyczki sprężynowe płasko przy wspólnym przewodzie żółciowym, aby wykonać ukośne nacięcie wspólnego przewodu żółciowego w miejscu, w którym wspólny przewód żółciowy wchodzi do trzustki i jelita obok zwieracza Oddi.

Następnie wymieszaj jeden mililitr żółtej żywicy z 50 mikrolitrami utwardzacza MV i napełnij jednomililitrową strzykawkę typu luer mieszaniną utwardzacza żywicy. Połącz napełnioną strzykawkę z pierwszym zestawem przewodów i naciśnij tłok, aby napełnić rurkę, aż mieszanina utwardzacza żywicy zacznie kapać z końcówki rurki. Użyj kleszczy, aby wyprostować obszar wokół wspólnego nacięcia przewodu żółciowego.

Przed włożeniem rurki do otworu we wspólnym przewodzie żółciowym najdłuższą krawędzią ściętej końcówki skieruj się w dół w kierunku grzbietowej strony przewodu żółciowego. Następnie zaciśnij węzeł jedwabnej nici, aby zabezpieczyć rurkę wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego. Po wstrzyknięciu żywicy do wspólnego przewodu żółciowego należy obserwować pęcherzyk żółciowy i poszczególne płaty wątroby.

Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę. Końcowe odgałęzienia dróg żółciowych wypełnionych żywicą będą słabo widoczne na powierzchni wątroby. Należy przerwać wstrzykiwanie żywicy, gdy na powierzchni wątroby pojawią się kropki żywicy lub gdy napotkany jest opór.

Następnie wyjmij rurkę, wyciągając ją ze wspólnego przewodu żółciowego i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. Odetnij luźne końce jedwabnego szwu, aby nie przeszkadzały w iniekcji żyły wrotnej. Przed wstrzyknięciem żywicy do żyły wrotnej należy oczyścić żyłę wrotną z otaczającej ją tkanki około dwóch centymetrów od jej wejścia do wątroby, za pomocą prostych kleszczy.

Następnie umieść jedwabną nić do szycia pod oczyszczonym obszarem żyły wrotnej, aby zawiązać luźny węzeł od góry. W żyle wrotnej dystalnie do wątroby wykonaj podłużne nacięcie przed zawiązaniem węzła. Następnie przygotuj mieszaninę utwardzacza z zieloną żywicą w strzykawce i napełnij rurkę mieszaniną, jak pokazano wcześniej.

Użyj kleszczy, aby wyprostować żyłę wrotną, ciągnąc otaczającą tkankę w kierunku strony ogonowej przed włożeniem rurki z najdłuższą krawędzią skośnej końcówki w kierunku grzbietowej strony naczynia. Dokręć jedwabną nić, aby zabezpieczyć rurkę w żyle wrotnej. Po wstrzyknięciu żywicy do żyły wrotnej obserwuj, jak naczynia krwionośne wypełniają się żywicą i masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby pomóc rozprowadzić żywicę.

Gdy wszystkie naczynia krwionośne zostaną wypełnione, wyciągnij rurkę z żyły wrotnej i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. W przypadku mikrotomografii komputerowej lub skanu mikrotomografii komputerowej wypreparowanej wątroby od myszy, umieść prawy przyśrodkowy płat wątroby w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i napełnij probówkę 1% żelem agarozowym do około dwóch trzecich całkowitej objętości probówki, aby zminimalizować niepożądany ruch próbki podczas pomiaru MicroCT. Zamontuj stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów z próbką na stoliku rotacyjnym urządzenia do tomografii komputerowej.

Pozwól probówce dostosować się termicznie do komory pomiarowej przez co najmniej godzinę. Gdy próbka jest dostosowana termicznie, wyśrodkuj ją w polu view lub FOV, a następnie zoptymalizuj odległość próbki źródłowej i detektora próbki lub SSD i SDD, aby osiągnąć wystarczającą rozdzielczość wokseli. Po ustawieniu parametrów rozpocznij pomiar CT.

Użyj dedykowanego oprogramowania do rekonstrukcji tomograficznej, aby zrekonstruować dane z tomografii komputerowej. Aby przeanalizować dane CT, załaduj pliki, wybierając file, import i polecenie. Użyj funkcji określania powierzchni na górnym panelu, aby podzielić żywicę na segmenty w danych przy użyciu globalnego progowania.

W oknie dialogowym określ wartość progową za pomocą oceny histogramu, ustawiając położenie czerwonej linii izowartości, aby podzielić tylko naczynia wypełnione żywicą. Na lewym panelu wybierz moduł utwórz ROI z objętości lub CAD lub siatki, aby utworzyć obszar zainteresowania lub ROI naczyń wypełnionych żywicą. W oknie dialogowym skorzystaj z opcji utwórz ROI z bryły, aby wybrać i potwierdzić nazwę przetwarzanego woluminu.

Wyeliminuj błędną segmentację klastrów szumów w obszarze tła tego zwrotu z inwestycji. Zaznacz ROI na prawym panelu, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając moduł podzielony ROI. W oknie dialogowym ustaw parametr minimalnej głośności woksela, aby wykluczyć wszystkie cząsteczki hałasu.

Wartość parametru jest zależna od eksperymentu i danych oraz zoptymalizowana dla każdej próbki, która ma być analizowana. Na lewym panelu użyj modułu wygładzającego, aby stworzyć gładkie, ciągłe i solidne maski kanałowe bez artefaktów, takich jak obecność pęcherzyków powietrza lub wyciek żywicy w zwrocie z inwestycji w żywicę. Utwórz oddzielny zwrot z inwestycji, jak opisano wcześniej, dla systemu wypełnionego bardziej chłonną żywicą, taką jak żółta żywica używana do wstrzykiwania do wspólnego przewodu żółciowego o wyższych wartościach intensywności w danych CT.

Zaznacz i zamaskuj żywicą nowy zwrot z inwestycji, klikając prawym przyciskiem myszy przed wybraniem opcji odejmij zwrot z inwestycji, a następnie odejmując nowy zwrot z inwestycji od zwrotu z inwestycji maski żywicznej, aby utworzyć nowy zwrot z inwestycji dla pozostałego systemu rurowego. Eksportuj wynikowe zwroty z inwestycji dla obu systemów rurowych w różnych formatach w oparciu o referencje operatorów w celu późniejszego przetwarzania w różnych programach. Dalej przetwarzaj wynikowe zwroty z inwestycji w oprogramowaniu graficznym woluminowym, aby wyeksportować ostateczną wizualizację w postaci obrazu lub wideo.

W tym badaniu osiągnięto udane podwójne wstrzyknięcie żywicy z dobrze wypełnionymi wewnątrzwątrobowymi drogami żółciowymi i unaczynieniem żyły wrotnej. Reprezentatywna analiza ilustruje wynik segmentacji danych z dobrze wstrzykniętej wątroby dla myszy P15 i dorosłej myszy, u której żywica jest widoczna w bocznych gałęziach. W typowym przykładzie nieudanego wstrzyknięcia, fizyczne uszkodzenie wątroby podczas zabiegu chirurgicznego spowodowało wyciek żywicy.

Również przedwczesne utwardzenie żywicy w igle lub końcówce rurki przed wstrzyknięciem oraz niewystarczająca perfuzja przezsercowa powodowały niedopełnienie systemu. Niewielki wyciek żywicy można ręcznie skorygować podczas segmentacji danych MicroCT. Wysokie ciśnienie wtrysku może spowodować pęknięcie naczyń lub kanałów i nieodwracalne uszkodzenie zbiornika lub architektury kanału.

Dodatkowo, pęcherzyki były kolejnym bardzo powszechnym artefaktem iniekcji, który doprowadził do rzadkiego wypełnienia sieci rurowych. Gdy użyto świeżo otwartej żywicy, zaobserwowano wyraźną różnicę w kontraście między żółtymi kanałami żółciowymi wstrzykniętymi żywicą a zielonymi żyłami wrotnymi wstrzykniętymi żywicą. Po trzech miesiącach przechowywania kontrast był wystarczający do odróżnienia żyły wrotnej od przewodu żółciowego.

Jednak wytrącanie się wpływało na mieszanie się dwóch żywic, co było widoczne jako niejednorodne zmętnienie w wypełnionej żyle wrotnej. Gdy żywica była starsza niż sześć miesięcy, kontrast uległ degradacji do punktu, w którym niemożliwe było odróżnienie przewodu żółciowego wstrzykniętego na żółto od żyły wrotnej wstrzykniętej na zielono, na podstawie samego kontrastu. Bardzo ważne jest wykonanie ukośnego nacięcia w przewodzie żółciowym wspólnym.

W przeciwnym razie włożenie rurki będzie bardzo trudne. Technika DUCT rzuca światło na nowe mechanizmy architektoniczne regeneracji dróg żółciowych w klinicznie istotnym modelu z wyraźnymi cechami w obszarach wnęki i płata obwodowego.