Name: DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Poznaj metodę DUCT do analizy naczyń krwionośnych i dróg żółciowych wątroby w 3D. Technika ta umożliwia wizualizację architektury narządu bez użycia przeciwciał i fluorescencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kari Huppert i Stacey Huppert za ich wiedzę i pomoc w zakresie kaniulacji dróg żółciowych oraz za ich laboratoryjną gościnność. Dziękujemy również Nadji Schultz i Charlotte L. Mattsson za ich pomoc w kaniulacji dróg żółciowych wspólnych.
Dziękujemy następującym Agencjom Przyznającym za ich wsparcie:
Za pracę w ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Grant dla Szwedzkich Fundacji), European Association for the Study of the Liver (Nagroda Daniela Alagille'a), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) i Vetenskapsrådet (2019-01350).
Za pracę w JK Lab: Dziękujemy za infrastrukturę badawczą CzechNanoLab wspieraną przez MEYS CR (LM2018110). J.K. dzięki wsparciu grantu FSI-S-20-6353.

<ol><li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li>
<li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver%3A+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li>
<li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li>
<li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li>
<li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+%28Rumi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272(2012).</li>
<li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li>
<li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li>
<li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li>
<li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+liver%3A+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li>
</ol>

Osobny projekt w laboratorium ERA jest finansowany przez ModeRNA. ModeRNA nie odgrywał żadnej roli w opisanym tutaj projekcie/protokole.

O powodzeniu DUCT decyduje kilka kluczowych etapów, od przygotowania próbki po parametry urządzenia CT. Aby osiągnąć najlepsze wyniki, należy użyć dobrze skontrastowanej, dobrze wstrzykniętej i pozbawionej pęcherzyków powietrza żywicy, aby umożliwić proste przetwarzanie cyfrowe z automatycznym progowaniem w celu uzyskania danych 3D, obrazów i filmów. Dzięki szkoleniu i przestrzeganiu tego protokołu, 90% wstrzyknięć kończy się sukcesem i skutkuje powtarzalnymi danymi. Ważne jest, aby używać świeżej żółtej żywicy, aby uzyskać najlepszy kontrast między dwoma wtryskiwanymi systemami. Żółta żywica ma bardzo silną nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich, podczas gdy niebieska żywica ma niewykrywalną nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich. Najlepsze wyniki osiąga się w ciągu pierwszych trzech miesięcy po otwarciu nowej butelki z żółtą żywicą. Z czasem żywica wytrąca się, a po dłuższym przechowywaniu (>6 miesięcy) żółta i zielona żywica nie będą już widoczne w tomografii komputerowej. Obrazy o słabym kontraście wymagają rozległego i czasochłonnego ręcznego śledzenia i segmentacji obu systemów. Następnie dobrze rozciągnięta rurka jest niezbędna, aby zmieścić się we wspólnym przewodzie żółciowym dorosłych myszy oraz wspólnym przewodzie żółciowym i żyle wrotnej myszy po urodzeniu. Punkt wejścia do wstrzyknięcia należy utworzyć z zachowaniem ostrożności. Jeśli wspólny przewód żółciowy zostanie przecięty poprzecznie, prawdopodobnie odłączy się od otaczającej tkanki, uniemożliwiając pomyślne wejście rurki. Ten krok jest szczególnie delikatny dla myszy po urodzeniu, u których wspólny przewód żółciowy cofa się i "zwija się", jeśli odczepił się od otaczającej tkanki, co sprawia, że wprowadzenie rurki jest niezwykle trudne. Wspólne wejście do dróg żółciowych i wstrzyknięcie może wymagać pewnej praktyki. Podczas przygotowywania rurki z żywicą i podczas wstrzykiwania należy unikać tworzenia się pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki stworzą negatywną przestrzeń na obrazach CT i będą wymagały czasochłonnej ręcznej korekty. Ważne jest, aby delikatnie masować wątrobę, przetaczając się po jej powierzchni zwilżonym wacikiem w trakcie i po zabiegu iniekcji, ponieważ ułatwia to równomierne rozprowadzanie żywicy. Po zakończeniu iniekcji i usunięciu rurki węzeł szwu jedwabnego należy szybko i ostrożnie zacisnąć, aby żywica nie wypłynęła z wątroby przed jej całkowitą polimeryzacją. Aby obrazowanie mikrotomografii komputerowej zakończyło się sukcesem, próbka musi być odpowiednio zamocowana za pomocą agarozy i dostosowana termicznie w celu wyeliminowania artefaktów ruchu w danych TK. Kluczowe znaczenie mają również ustawienia akwizycji, które należy zoptymalizować, aby osiągnąć odpowiednią rozdzielczość przestrzenną pozwalającą na rozdzielenie drobnych struktur.
Można wprowadzić modyfikacje techniczne w procedurze wstrzykiwania, aby uzyskać wstrzyknięcie u młodszych myszy. Obecnie odlewanie żywicą młodszych wątroby myszy jest ograniczone dostępnością wystarczająco cienkich rurek, przy czym PE10 jest najmniejszą dostępną na rynku rurką. Tanimizu i in. z powodzeniem wstrzyknęli atrament węglowy do wspólnego przewodu żółciowego embrionalnego dnia 17 (E17) za pomocą szklanych naczyń włosowatych11. W związku z tym interesujące byłyby przyszłe testy mające na celu sprawdzenie, czy żywica może być dostarczana przez szklaną kapilarę. DUCT został następnie przystosowany do wstrzykiwania innych układów rurkowych, takich jak drogi oddechowe i naczynia płucne w płucach9. Podwójne wstrzykiwanie żywicy może być również zmodyfikowane tak, aby można je było stosować z innymi dostępnymi na rynku żywicami, lub ten protokół może być stosowany do wstrzykiwań z tuszem węglowym.
Jednym z głównych czynników ograniczających rurociąg DUCT jest lepkość żywicy. DUCT może być stosowany tylko do odlewania żywicą konstrukcji rurowych o średnicy powyżej 5 μm. W tym zestawie danych żywica może przenikać do rurek o najmniejszej średnicy 5μm9. To ograniczenie wielkości wyklucza analizę drobnych przewodów i małych naczyń włosowatych. Aby jeszcze bardziej rozwinąć rurociąg DUCT do zbiorników mniejszego kalibru, należy przetestować inne dostępne na rynku żywice, a opracowanie nowych środków nieprzepuszczających promieni rentgenowskich o niskiej lepkości może poprawić penetrację światła.
W Hankeova i wsp.9 DUCT porównano z dwiema innymi powszechnie stosowanymi technikami, podwójnymi wstrzyknięciami tuszu węglowego, a następnie oczyszczaniem tkanek i standardową fotografią oraz iDISCO+ z barwieniem naczyń krwionośnych aktyną alfa-komórek mięśni gładkich i dróg żółciowych cytokeratyną 7, a następnie obrazowaniem 3D9. DUCT przewyższył pozostałe dwie metody pod względem podwójnej analizy (co było wyzwaniem dla iDISCO+ ze względu na wysoką autofluorescencję wątroby), obrazowania 3D i kwantyfikacji (niemożliwe w przypadku wstrzykiwania atramentu węglowego) oraz lumenizacji (DUCT dostarcza danych dla wewnętrznej architektury światła i perfuzji systemu). Jak wspomniano powyżej, głównym ograniczeniem DUCT jest minimalna wielkość strumienia świetlnego, który może być wstrzykiwany i analizowany (limit 5 μm), parametr, w którym zarówno wtrysk atramentu węglowego, jak i iDISCO+ wypadły lepiej. DUCT jest lepszy od pojedynczego systemu odlewania żywicy 3,5,6, ponieważ umożliwia analizę każdego wtryskiwanego systemu z osobna, a także ułatwia podwójne badanie 3D w celu zbadania relacji architektonicznych między tymi dwoma systemami.
DUCT może być stosowany do badania dowolnych dwóch sieci rurowych w 3D. Jako dowód słuszności tej zasady, DUCT wykorzystano do wizualizacji układu wątroby, dróg żółciowych i żył wrotnych oraz unaczynienia tętnicy płucnej i dróg oddechowych w płucach9. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe rozwijają się w sąsiedztwie żyły wrotnej, a żyła wrotna stanowi strukturalny szablon i centrum sygnalizacyjne, które reguluje wzrost i różnicowanie drzewa żółciowego12. W badaniu Hankeova i wsp.9 w ramach projektu DUCT badano regenerację dróg żółciowych w mysim modelu zespołu Alagille'a cierpiącego na chorobę dziecięcą. Projekt DUCT ujawnił wcześniej nieopisywane mechanizmy architektoniczne, które układ żółciowy wykorzystywał do uzyskania objętości9 przypominającej typ dziki. Myszy z zespołem Alagille'a stosowały dwie różne strategie: (1) w wnękach i centralnych obszarach wątroby układ żółciowy zwiększył swoje rozgałęzienia, oraz (2) na obrzeżach wątroby drogi żółciowe generowane de novo były bardzo kręte. Te dwa czynniki połączyły się, aby uzyskać prawie normalną objętość układu żółciowego, pomimo nieprawidłowej architektury. Ponadto DUCT wykrył nieprawidłowe rozgałęzienia dróg żółciowych, które występowały niezależnie od rozgałęzienia żyły wrotnej i dróg żółciowych tworzących mostki łączące między dwiema żyłami wrotnymi9. Te fenotypy byłyby niemożliwe do wykrycia w odlewie z pojedynczej żywicy i mogłyby być błędnie zinterpretowane w przekrojach histologicznych 2D jako proliferacja dróg żółciowych. W ten sposób DUCT dostarcza danych opisujących architekturę 3D dwóch sieci rurowych na poziomie całego narządu lub płata z możliwością jakościowej i dogłębnej analizy ilościowej. Projekt DUCT może stać się nowym standardem w analizach rozwoju i regeneracji wątroby po urodzeniu w różnych modelach zwierzęcych.

Odlewanie żywicy organowej to technika, której początki sięgają XVII wieku1. Jeden z pierwszych przykładów nowoczesnego odlewania żywicy został wykonany na ludzkiej wątrobie podczas autopsji. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe wypełniono środkiem kontrastowym zmieszanym z żelatyną, a następnie obrazowano za pomocą tomografii komputerowej RTG2. Celem techniki DUCT jest wizualizacja, digitalizacja i analiza dwóch rurowych sieci odlewanych z żywicy, w tandemie, w 3D.
DUCT opiera się na obszernej istniejącej wiedzy na temat jednosystemowego odlewania żywicy wątrobowej3,4,5,6,7,8 i obejmuje jednoczesną wizualizację 3D i analizę dwóch systemów9. W ramach projektu DUCT udało się przekształcić odlewanie żywicy pojedynczej w podwójne odlewnictwo żywicy, mieszając dwie żywice nieprzepuszczające promieni rentgenowskich o różnym kontraście i wstrzykując te żywice do dwóch różnych sieci, w szczególności do wspólnego przewodu żółciowego i żyły wrotnej. DUCT może być stosowany u młodych myszy po urodzeniu z powtarzalnymi wynikami już w 15. dniu po urodzeniu (P15). W porównaniu z technikami obrazowania opartymi na mikroskopii, główną zaletą jest to, że DUCT jest szybszy, wolny od przeciwciał, a autofluorescencja tkanki wątroby nie zakłóca obrazowania. Ponadto DUCT dostarcza danych ilościowych opisujących stan lumenizacji, średnicę wewnętrzną, łączność sieciową i perfuzję. Rozróżnienie między obecnością komórek tworzących światło a ich de facto morfogenezą w rurki jest niezbędne do analizy narządów, w których obecne są komórki przewodowe, ale nie tworzą jajowodów, jak może to mieć miejsce w przypadku zespołu Alagille'a10. Główną wadą DUCT jest ograniczona penetracja żywicy, która jest lepka i nie dostaje się do rur o małym kalibrze (<5 μm). DUCT może być stosowany do dowolnej struktury rurkowej po określeniu punktu wejścia do iniekcji, takiej jak tętniczy i żylny układ krążenia, drogi oddechowe, pozawątrobowy przewód żółciowy lub naczynia limfatyczne. W ten sposób może ułatwić analizę architektury całych narządów innych tkanek, takich jak płuca i trzustka.
Obrazy segmentowane mikrotomografią komputerową mogą być przetwarzane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ, lub specjalnie napisanych potoków (np. MATLAB). Wątroba wstrzyknięta żywicą może być analizowana jakościowo pod kątem rozbudowy sieci i łączności lub ilościowo pod kątem objętości, długości, rozgałęzień, krętości pojedynczego systemu i interakcji między dwoma systemami, takich jak odległość między dwoma systemami lub zależność od punktu rozgałęzienia (czy system 1 rozgałęzia się w pobliżu rozgałęzienia systemu 2?). Rurociąg DUCT obejmujący wstrzykiwanie żywicy, skanowanie mikrotomografią komputerową i segmentację danych TK, w połączeniu ze szczegółową analizą ilościową mechanizmów architektonicznych dwóch systemów rurkowych, może stanowić standard dla analizy całej wątroby w modelach zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml mikroprobówki SafeSeal</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>23 G igła motylkowa z rurką</td><td>BD bioscience</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>Igła 23 G</td><td>BD bioscience</td><td>305892</td><td></td></tr><tr><td>30 G</td> BD <td>bioscience</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Top-Bio</td><td>P045</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>108006</tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 ml probówki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430829-500EA</td><td>polipropylen</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Medicarier</td><td>60406</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Leica M60</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.41</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Falcon 15 ml</td><td>Verkon</td><td>331.850.084.006</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>Fine Graefe 10 cm zakrzywione</td></tr><tr><td>Kleszcze proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Fine Graefe 10 cm prosty</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td> Skaner <td>mikrotomografii komputerowej</td><td>Waygate Technologoies</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Leo Pharma</td><td>B01AB01</td><td>5000 IE/ml</td></tr><tr><td>Izolfuran</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11413413</td><td></td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-122</td><td>żywica syntetyczna żółta</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-120</td><td>żywica syntetyczna niebieska</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-rozcieńczalnik</td><td>przezroczysty rozcieńczalnik do żywicy</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Verkon</td><td>130.690.424.503</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>AgnThos</td><td>010.6131.M20</td><td></td></tr><tr><td>phoenix Oprogramowanie datos|x 2.0</td><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji danych Baker</td><td>Hughes</td><td></td> CT</tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR 444-0142</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szew jedwabny</td><td>AgnThos</td><td>14757</td><td>jedwab, 4-0, sterylny, 100 m</td></tr><tr><td>Nożyczki do skóry</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Prosta końcówka tęczówki 9 cm</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>Vannas micro, prosta końcówka 2 mm</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml Luer</td><td>BD biologia</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PE10</td><td>BD bioscience</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PE50</td><td>BD bioscience</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie VG Studio MAX 3.3</td><td>Volume Graphics GmbH</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania i analizy danych CT</td></tr></tbody></table>

duct: podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3d

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

Wątroba jest największym organem wewnętrznym u ludzi i myszy, a wysoka autofluorescencja stanowi poważne wyzwanie dla oceny trójwymiarowej (3D) architektury narządu na poziomie całego narządu. Architektura wątroby charakteryzuje się wieloma rozgałęzionymi strukturami oświetlonymi, które mogą być wypełnione żywicą, w tym drzewami naczyniowymi i żółciowymi, ustanawiając wysoce stereotypowy wzór w miąższu bogatym w hepatocyty. Protokół ten opisuje proces wykonywania mikrotomografii komputerowej z podwójnym odlewem żywicy lub "DUCT". DUCT polega na wstrzyknięciu do żyły wrotnej i przewodu żółciowego wspólnego za pomocą dwóch różnych żywic syntetycznych nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie utrwaleniu tkanki. Kontrola jakości poprzez oczyszczenie jednego płata lub całej wątroby za pomocą optycznego środka czyszczącego pozwala na wstępne badanie przesiewowe odpowiednio wstrzykniętych próbek. W drugiej części rurociągu DUCT płat lub cała wątroba mogą być wykorzystane do skanowania za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT), (pół)automatycznej segmentacji i renderowania 3D sieci żył wrotnych i dróg żółciowych. Efektem mikrotomografii komputerowej są dane współrzędnych 3D dla dwóch żywic, co pozwala na analizę jakościową i ilościową obu układów oraz ich relacji przestrzennych. DUCT może być stosowany do wątroby myszy po urodzeniu i u dorosłych myszy i może być dalej rozszerzony na inne sieci kanalikowe, na przykład sieci naczyniowe i drogi oddechowe w płucach.

Procedura 
Prawidłowa podwójna iniekcja żywicy zostaje osiągnięta, gdy zarówno wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe, jak i naczynia żylne wrotne są dobrze wypełnione. W ramach kontroli jakości oczyszczanie jednego płata (na przykład lewego płata bocznego) pozwala na weryfikację powodzenia iniekcji przed obrazowaniem wybranych płatów. Optycznie oczyszczony płat może zostać przeskanowany później za pomocą microCT; w związku z tym możliwe jest optyczne oczyszczenie całej wątroby. W dobrze nasyconej żywicą wątrobie mysiej naczynia żylne wrotne powinny być wypełnione żywicą aż do obwodu wątroby, a żywica powinna być widoczna w odgałęzieniach bocznych (Rysunek 4) – taka architektura jest wiernie odwzorowana w danych przeskanowanych i segmentowanych za pomocą microCT. Ponadto prawidłowo wypełnione wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe powinny być widoczne obok głównych gałęzi żyły wrotnej, rozciągając się niemal do obwodu, a żywica powinna być widoczna w głównych odgałęzieniach bocznych. Jeśli płat kontrolny przejdzie etap kontroli jakości, płaty będące przedmiotem zainteresowania (w tym ten optycznie oczyszczony) mogą zostać przeskanowane za pomocą microCT. Wynik segmentacji danych z dobrze nasyconej żywicą wątroby przedstawiono dla myszy P15 (Rysunek 4A,B) oraz myszy dorosłej (Rysunek 4C,D).
Czego unikać 
Nienaruszona tkanka wątroby jest warunkiem koniecznym do prawidłowego wykonania wstrzyknięcia. Podczas nacinania jamy brzusznej i przepony należy zachować szczególną ostrożność, aby przypadkowo nie uszkodzić tkanki wątroby. Jeśli podczas tej procedury dojdzie do mechanicznego uszkodzenia wątroby, istnieje duże prawdopodobieństwo wycieku żywicy podczas wstrzykiwania do żyły wrotnej (Rycina 5A). W przypadku fizycznego uszkodzenia wątroby nie jest możliwe prawidłowe wypełnienie układu naczyniowego.
Jednym z częstych błędów jest niedostateczne wypełnienie wątroby żywicą, co może utrudniać wizualizację lub analizę. Jedną z przyczyn niedopełnienia układu jest przedwczesne twardnienie żywicy w igle lub końcówce cewki przed zakończeniem wstrzykiwania (Rycina 5B, niebieskie groty strzałek, nawiasy wskazują duże pęcherzyki powietrza). Dobrą praktyką jest stosowanie jednego zestawu do iniekcji na jedno zwierzę i szybka praca po dodaniu czynnika utwardzającego do żywicy. Jeśli żywica stwardnieje podczas iniekcji (co można zauważyć po połowie wypełnionym układzie, tutaj zilustrowanym w przypadku naczyniówki żyły wrotnej wypełnionej w połowie), należy usunąć cewkę, odciąć jej końcówkę (zawsze pod kątem, aby uzyskać ścięty koniec) i nacisnąć tłok. Jeśli żywica ponownie zacznie kapać, należy ostrożnie ponownie wprowadzić cewkę i zabezpieczyć ją szwem. Jeśli żywica stwardniała w igle, należy całkowicie wymienić cewkę, wypełnić ją żywicą (unikając pęcherzyków powietrza), ostrożnie ponownie wprowadzić cewkę i zabezpieczyć ją szwem. Wymiana cewki może być trudna, szczególnie u młodych myszy postnatalnych &lt;P30, ponieważ tkanka jest bardziej krucha. Inną przyczyną niedostatecznego wypełnienia naczyniówki żyły wrotnej żywicą może być niewystarczająca perfuzja transkardialna (Rycina 5C, niebieskie groty strzałek oznaczają krew widoczną w gałęziach końcowych). Można to zaobserwować, gdy końce naczyń są wypełnione krwią zamiast żywicy. Aby tego uniknąć, należy upewnić się, że żyła wrotna (poza wątrobą) nie zawiera krwi przed iniekcją. Trzecią przyczyną niedopełnienia wątroby jest zbyt głębokie wprowadzenie cewki do wątroby, w wyniku czego trafia ona do gałęzi prowadzącej do jednego z płatów. Aby temu zapobiec, należy wprowadzić cewkę w odległości co najmniej 0,5 cm od miejsca wejścia do wątroby.
W przeciwnym razie jeden lub oba systemy zostają przepełnione żywicą (Rysunek 5D). Konieczne jest monitorowanie wątroby wizualnie przez cały czas trwania wstrzykiwania. Odlewanie systemu żółciowego za pomocą żywicy jest trudniejsze niż odlewanie żywicy w żyle wrotnej, ponieważ wypełnione żywicą przewody są słabo widoczne na powierzchni wątroby, co utrudnia ocenę momentu, w którym system jest prawie pełny i należy przerwać proces. Pojawienie się małych żółtych kropek żywicy na powierzchni wątroby (Rysunek 2Ci, niebieska grot strzałki) jest sygnałem, że system żółciowy jest całkowicie wypełniony, a żywica zaczyna wyciekać z przewodów. Niewielkie wycieki żywicy można ręcznie skorygować podczas segmentacji danych microCT (Rysunek 5D, panele po prawej).
Jeśli ciśnienie wtrysku jest zbyt wysokie, może to doprowadzić do pęknięcia naczyń lub przewodów (Rysunek 5E), co nieodwracalnie uszkodzi architekturę naczyń lub przewodów. W takim przypadku wątroba nie będzie nadawać się do skanowania lub analizy microCT. Aby uniknąć przepełnienia żywicą, należy zoptymalizować objętość i ciśnienie stosowane podczas wtrysku dla każdego modelu mysiego. W przypadku pracy z myszami poddanymi działaniu toksycznej diety, modyfikacjom genetycznym lub urazom wątroby wpływającym na układ żółciowy lub żylny, a także przy sztywności wątroby, konieczne może być dostosowanie ciśnienia i objętości wtrysku, ponieważ tolerowana objętość i ciśnienie mogą różnić się od tych u myszy typu dzikiego. Niniejszy protokół opisuje ręczny wtrysk do obu układów, jednak możliwe jest podłączenie strzykawki do pompy w celu zestandaryzowania ciśnienia wtrysku. Pęcherzyki powietrza to kolejny bardzo częsty artefakt wtrysku, który prowadzi do niepełnego wypełnienia sieci cewkowych (Rysunek 5F-H, niebieskie groty strzałek). Aby uniknąć powstawania pęcherzyków, należy upewnić się, że strzykawka i rurki nie zawierają pęcherzyków powietrza, są całkowicie wypełnione żywicą, a żywica wycieka z końcówki rurki przed rozpoczęciem wtrysku. Małe pęcherzyki, które pojawiają się jako obszary ubytkowe w danych microCT, można skorygować ręcznie podczas etapów post-processingu, choć jest to proces żmudny.
Świeżość ma kluczowe znaczenie 
Stosowanie świeżej żółtej żywicy jest kluczowym czynnikiem, który znacząco wpływa na kontrast między dwiema żywicami oraz segmentację danych microCT. Przy użyciu świeżo otwartej żywicy (Rysunek 6A) występuje wyraźna różnica w kontraście między wstrzykniętymi żółtą żywicą drogami żółciowymi (jasnobiałe) a wstrzykniętymi zieloną żywicą żyłami wrotnymi (jasnoszare). Wątroba wstrzyknięta świeżą żywicą jest łatwo przetwarzana przy użyciu zautomatyzowanego globalnego progowania. Podczas długiego przechowywania żywica wytrąca się, co prowadzi do zmniejszenia kontrastu. Po 3 miesiącach przechowywania kontrast może być wciąż wystarczający, aby odróżnić żyłę wrotną od drogi żółciowej (Rysunek 6B), jednak wytrącanie wpływa na mieszanie się obu żywic, co objawia się jako niejednorodna opalescencja w wypełnionej żyle wrotnej (Rys. 6B, niebieskie groty strzałek). Niejednorodny kontrast negatywnie wpływa na automatyczne progowanie i wymaga ręcznych korekt, co wydłuża czas przetwarzania. Jeśli żywica jest starsza niż sześć miesięcy, kontrast ulega pogorszeniu do stopnia, w którym nie jest możliwe odróżnienie wstrzykniętej żółtą żywicą drogi żółciowej od wstrzykniętej zieloną żywicą żyły wrotnej na podstawie samego kontrastu (Rysunek 6C). W takim przypadku drogi żółciowe i żyły wrotne muszą być segmentowane ręcznie na podstawie ich średnicy i położenia w obszarze wnęki, a następnie śledzone ręcznie w całym zestawie danych microCT. Procedura ta jest niezwykle czasochłonna i najlepiej jej unikać.
<img alt="Dobór rozmiaru i pomiar cewników; obraz mikroskopowy przedstawiający średnice rurek PE10 i PE50 z linijką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zestaw do wstrzykiwania dla odlewu z żywicy. (A) Zestaw do wstrzykiwania nr 1 składa się z igły 30 G i rurki PE10 o długości ~30 cm. Zestaw do wstrzykiwania nr 2 składa się z igły 23 G i rurki PE50 o długości ~30 cm. (B) Końcówka rurki jest rozciągnięta i ścięta pod kątem w celu utworzenia ściętego wierzchołka. Linijka na zdjęciach A i B to linijka centymetrowa z głównymi podziałkami 1 cm, podziałkami pośrednimi 5 mm i podziałkami pomocniczymi 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura wstrzykiwania do przewodu żółciowego i żyły wrotnej, schemat i układ eksperymentalny, metoda perfuzji wątroby." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat blokowy podwójnego odlewu z żywicy. (A) Schemat przedstawiający żylny układ krwionośny myszy oraz serce z zaznaczonym prawym przedsionkiem, który należy wyciąć przed perfuzją, oraz lewą komorą, do której należy wprowadzić igłę w celu przeprowadzenia perfuzji i wypłukania krwi z układu krążenia. Żyła główna dolna powinna zostać przecięta poniżej nerek, aby zmniejszyć ciśnienie naczyniowe. (B) Schemat blokowy wstrzykiwania żywicy do przewodu żółciowego. (i) Powiększony obraz (A) pokazujący miejsce przecięcia IVC. (ii) Obraz przedstawiający wspólny przewód żółciowy (żółta przerywana linia) od obszaru wnęki wątroby do zwieracza Oddiego (czarne groty strzałek), z nicią chirurgiczną pod odsłoniętym wspólnym przewodem żółciowym. (iii) Odpowiednia pozycja dla luźnego węzła nadgarstkowego wokół wspólnego przewodu żółciowego. (iv) Żółta przerywana linia i czarne groty strzałek oznaczają zwieracz Oddiego, pokazując ukośny kąt nacięcia oraz wygląd otworu po wykonaniu nacięcia pod kątem. (v) Schemat demonstrujący orientację ściętego końca rurki PE10 (skierowanego do góry) podczas wprowadzania. (vi) Wygląd wstrzykiwanej żółtej żywicy; żywica powinna łatwo przejść przez luźno zawiązany węzeł. IVC, żyła główna dolna; CBD, wspólny przewód żółciowy. (C) Schemat blokowy wstrzykiwania żywicy do żyły wrotnej. (i) Zielona przerywana linia oznacza żyłę wrotną od obszaru wnęki. Niebieskie groty strzałek oznaczają przepełniony układ żółciowy. (ii) Odpowiednia lokalizacja dla luźnego węzła nadgarstkowego wokół żyły wrotnej. (iii) Schemat demonstrujący otwarcie ściętego końca (do góry) podczas wprowadzania. (iv) Wygląd wątroby po wstrzyknięciu zielonej i żółtej żywicy; zwróć uwagę na wypełnione żywicą naczynie krwionośne na obwodzie wątroby. PV, żyła wrotna. Rysunek 2A został stworzony za pomocą Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza obrazu struktur 3D; schematy z histogramami widmowymi; wyniki segmentacji mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przetwarzanie danych Micro CT w oprogramowaniu Volume Graphics. (A) Wyznaczanie powierzchni: (i) zawyżona wartość izo-powierzchni (obecny podgląd zaznaczenia wyświetlony w kolorze żółtym), (ii) zaniżona wartość izo-powierzchni, (iii) optymalny dobór wartości izo-powierzchni dla prawidłowego wyznaczenia powierzchni żyły wrotnej i dróg żółciowych. (B) Podział obszaru zainteresowania (ROI) utworzonego poprzez wyznaczenie powierzchni: (i) ustawienie w oknie dialogowym wartości na tyle wysokiej, aby pozostał tylko jeden segment (największy), (ii) w żółtych ramkach pokazano mniejsze (wykluczone) cząstki. (C) Wygładzanie powierzchni danych: (i) funkcja wygładzania znajduje się w panelu lewym, (ii) ustawienie siły wygładzania na 1 (maks. 2) i utworzenie nowego wygładzonego ROI, (iii) dane po wygładzeniu. (D) Separacja poszczególnych układów rurkowatych: (i) w funkcji wyznaczania powierzchni ustawiono wartość izo-powierzchni tak, aby w zaznaczeniu znalazł się tylko układ żółciowy (obecny podgląd zaznaczenia wyświetlony w kolorze żółtym), (ii) zaznaczenie ROI obu układów oraz ROI tylko układu żółciowego i odjęcie ROI układu żółciowego od ROI obu układów, (iii) żyła wrotna przedstawiona na szaro, układ żółciowy przedstawiony na zielono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy rozwoju naczyniowego, od P15 do dorosłości; mikroskopia gałęzi żyły wrotnej (PV) i przewodów żółciowych (BD); badanie anatomiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Prawidłowo wstrzyknięte systemy przewodów żółciowych (BD) i żyły wrotnej (PV). (A) Optycznie przejaśniony prawy płat przyśrodkowy (RML) wątroby w 15. dniu po urodzeniu (P15), w który wstrzyknięto dwie żywice do obu systemów. Pasek skali 1 mm. (B) Rendering 3D RML P15 przedstawionego w (A), obrazujący naczynia żyły wrotnej na biało, a system żółciowy na zielono. Pasek skali 1 mm. (C) Optycznie przejaśniony RML wątroby dorosłej, w który wstrzyknięto dwie żywice do obu systemów. Pasek skali 1 mm. (D) Rendering 3D dorosłego RML przedstawionego w (C), obrazujący naczynia żyły wrotnej na biało, a system żółciowy na zielono. H = wnęka, P = obwodowy. Pasek skali 1 mm. Panele A, B, D zostały opracowane za zgodą Hankeova et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza sieci naczyniowej; obrazowanie wątroby; mikroskopia; wzorce przestrzenne; wizualizacja anatomiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Typowe problemy podczas podwójnych iniekcji żywicy do wątroby. (A) Obraz przedstawia wątrobę, która została przypadkowo nacięta podczas początkowego otwierania jamy brzusznej, a żywica wycieka przez nacięcie (niebieski grot strzałki). (B) Nieprawidłowo wypełniony system żyły wrotnej z powodu twardnienia żywicy. Niebieskie groty strzałek wskazują puste gałęzie końcowe, a czerwone nawiasy duże pęcherzyki powietrza. Pasek skali 1 mm. (C) Nieprawidłowo wypełniony system żyły wrotnej z powodu niewłaściwej perfuzji transkardialnej. Niebieskie groty strzałek wskazują krew widoczną w gałęziach końcowych. Pasek skali 1 mm. (D) Przepełniony system żółciowy objawiający się izolowanymi grudkami żywicy. Panele po lewej stronie przedstawiają wątrobę poddaną oczyszczaniu optycznemu, a panele po prawej obraz renderowany mikro-CT 3D. Niebieskie przerywane obrysy wyznaczają obszary powiększenia. Czarne groty strzałek wskazują część wątroby uszkodzoną podczas oczyszczania optycznego po skanowaniu mikro-CT. Pasek skali 1 mm. (E) Wysokie ciśnienie podczas iniekcji żywicy może spowodować pęknięcie żyły wrotnej (zwierzę na tym panelu posiada mutację Jag1H268Q), zaznaczone niebieskimi grotami strzałek. Pasek skali 1 mm. (F) Pęcherzyki powietrza w żywicy podczas iniekcji do żyły wrotnej (niebieskie groty strzałek) oraz (G) iniekcji do systemu żółciowego (niebieski grot strzałki), pasek skali 1 mm. (H) Skan mikro-CT pęcherzyków powietrza (niebieski grot strzałki), słabo wypełnionych gałęzi końcowych (czerwone nawiasy) i wycieku żywicy (żółty grot strzałki), pasek skali 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Postęp zaniku wątroby, schemat: MRI pokazujące zmiany w PV i BD w czasie w 1. tygodniu, 3. i 6. miesiącu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Różnicowy kontrast żywicy. (A) Świeżo otwarta żółta żywica zapewnia wystarczający kontrast, aby odróżnić wstrzykniętą żywicą żyłę wrotną (szara) i drogi żółciowe (białe). (B) Trzymanie żółtej żywicy przez trzy miesiące prowadzi do wytrącenia żywicy, co skutkuje niejednorodną nieprzezroczystością (szaro-biała żyła wrotna, niebieska grot strzałki). (C) Przechowywanie żółtej żywicy przez dłuższy czas (&gt;6 miesięcy) zmniejsza kontrast między żyłą wrotną (szara) a drogami żółciowymi (szare). Pasek skali 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Metoda ta pozwala nam analizować, wizualizować i określać ilościowo architekturę układu wątrobowego, naczyniowego i żółciowego w 3D. Możemy teraz lepiej zrozumieć przestrzenne aspekty chorób wątroby i jej regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie opiera się ona na istnieniu przeciwciał ani obrazowaniu fluorescencyjnym.Pozwala również na bezpośrednią wizualizację, które sieci są odpowiednio lumenizowane. Metoda ta nadaje się do analizy układów rurowych, dlatego badania naczyń krwionośnych, dróg żółciowych i dróg oddechowych są idealnymi obszarami. Wykorzystaliśmy DUCT, aby zrozumieć zmiany strukturalne związane z regeneracją dróg żółciowych.Przed wstrzyknięciem żywicy do układu żółciowego myszy należy rozpocząć przesuwanie jelita i trzustki na lewą stronę myszy, używając bawełnianego wacika zwilżonego PBS, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy i żyłę wrotną. Następnie wykonaj małe poprzeczne nacięcie w żyle głównej dolnej. Odwróć brzuszną stronę wątroby w kierunku serca, aby odsłonić powierzchnię trzewną i obszar wnęki, a następnie zlokalizuj wspólny przewód żółciowy, który biegnie od obszaru wnęki przez trzustkę i do jelita przy zwieraczu Oddi.Użyj prostych kleszczy, aby oczyścić otaczający obszar tkanki w odległości około pięciu milimetrów od wspólnego przewodu żółciowego. Następnie, umieszczając jedwabną nić do szwów pod wspólnym przewodzie żółciowym, zawiąż luźny węzeł wokół wspólnego przewodu żółciowego. Przytrzymaj nożyczki sprężynowe płasko przy wspólnym przewodzie żółciowym, aby wykonać ukośne nacięcie wspólnego przewodu żółciowego w miejscu, w którym wspólny przewód żółciowy wchodzi do trzustki i jelita obok zwieracza Oddi.Następnie wymieszaj jeden mililitr żółtej żywicy z 50 mikrolitrami utwardzacza MV i napełnij jednomililitrową strzykawkę typu luer mieszaniną utwardzacza żywicy. Połącz napełnioną strzykawkę z pierwszym zestawem przewodów i naciśnij tłok, aby napełnić rurkę, aż mieszanina utwardzacza żywicy zacznie kapać z końcówki rurki. Użyj kleszczy, aby wyprostować obszar wokół wspólnego nacięcia przewodu żółciowego.Przed włożeniem rurki do otworu we wspólnym przewodzie żółciowym najdłuższą krawędzią ściętej końcówki skieruj się w dół w kierunku grzbietowej strony przewodu żółciowego. Następnie zaciśnij węzeł jedwabnej nici, aby zabezpieczyć rurkę wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego. Po wstrzyknięciu żywicy do wspólnego przewodu żółciowego należy obserwować pęcherzyk żółciowy i poszczególne płaty wątroby.Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę. Końcowe odgałęzienia dróg żółciowych wypełnionych żywicą będą słabo widoczne na powierzchni wątroby. Należy przerwać wstrzykiwanie żywicy, gdy na powierzchni wątroby pojawią się kropki żywicy lub gdy napotkany jest opór.Następnie wyjmij rurkę, wyciągając ją ze wspólnego przewodu żółciowego i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. Odetnij luźne końce jedwabnego szwu, aby nie przeszkadzały w iniekcji żyły wrotnej. Przed wstrzyknięciem żywicy do żyły wrotnej należy oczyścić żyłę wrotną z otaczającej ją tkanki około dwóch centymetrów od jej wejścia do wątroby, za pomocą prostych kleszczy.Następnie umieść jedwabną nić do szycia pod oczyszczonym obszarem żyły wrotnej, aby zawiązać luźny węzeł od góry. W żyle wrotnej dystalnie do wątroby wykonaj podłużne nacięcie przed zawiązaniem węzła. Następnie przygotuj mieszaninę utwardzacza z zieloną żywicą w strzykawce i napełnij rurkę mieszaniną, jak pokazano wcześniej.Użyj kleszczy, aby wyprostować żyłę wrotną, ciągnąc otaczającą tkankę w kierunku strony ogonowej przed włożeniem rurki z najdłuższą krawędzią skośnej końcówki w kierunku grzbietowej strony naczynia. Dokręć jedwabną nić, aby zabezpieczyć rurkę w żyle wrotnej. Po wstrzyknięciu żywicy do żyły wrotnej obserwuj, jak naczynia krwionośne wypełniają się żywicą i masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby pomóc rozprowadzić żywicę.Gdy wszystkie naczynia krwionośne zostaną wypełnione, wyciągnij rurkę z żyły wrotnej i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. W przypadku mikrotomografii komputerowej lub skanu mikrotomografii komputerowej wypreparowanej wątroby od myszy, umieść prawy przyśrodkowy płat wątroby w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i napełnij probówkę 1% żelem agarozowym do około dwóch trzecich całkowitej objętości probówki, aby zminimalizować niepożądany ruch próbki podczas pomiaru MicroCT. Zamontuj stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów z próbką na stoliku rotacyjnym urządzenia do tomografii komputerowej.Pozwól probówce dostosować się termicznie do komory pomiarowej przez co najmniej godzinę. Gdy próbka jest dostosowana termicznie, wyśrodkuj ją w polu view lub FOV, a następnie zoptymalizuj odległość próbki źródłowej i detektora próbki lub SSD i SDD, aby osiągnąć wystarczającą rozdzielczość wokseli. Po ustawieniu parametrów rozpocznij pomiar CT.Użyj dedykowanego oprogramowania do rekonstrukcji tomograficznej, aby zrekonstruować dane z tomografii komputerowej. Aby przeanalizować dane CT, załaduj pliki, wybierając file, import i polecenie. Użyj funkcji określania powierzchni na górnym panelu, aby podzielić żywicę na segmenty w danych przy użyciu globalnego progowania.W oknie dialogowym określ wartość progową za pomocą oceny histogramu, ustawiając położenie czerwonej linii izowartości, aby podzielić tylko naczynia wypełnione żywicą. Na lewym panelu wybierz moduł utwórz ROI z objętości lub CAD lub siatki, aby utworzyć obszar zainteresowania lub ROI naczyń wypełnionych żywicą. W oknie dialogowym skorzystaj z opcji utwórz ROI z bryły, aby wybrać i potwierdzić nazwę przetwarzanego woluminu.Wyeliminuj błędną segmentację klastrów szumów w obszarze tła tego zwrotu z inwestycji. Zaznacz ROI na prawym panelu, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając moduł podzielony ROI. W oknie dialogowym ustaw parametr minimalnej głośności woksela, aby wykluczyć wszystkie cząsteczki hałasu.Wartość parametru jest zależna od eksperymentu i danych oraz zoptymalizowana dla każdej próbki, która ma być analizowana. Na lewym panelu użyj modułu wygładzającego, aby stworzyć gładkie, ciągłe i solidne maski kanałowe bez artefaktów, takich jak obecność pęcherzyków powietrza lub wyciek żywicy w zwrocie z inwestycji w żywicę. Utwórz oddzielny zwrot z inwestycji, jak opisano wcześniej, dla systemu wypełnionego bardziej chłonną żywicą, taką jak żółta żywica używana do wstrzykiwania do wspólnego przewodu żółciowego o wyższych wartościach intensywności w danych CT.Zaznacz i zamaskuj żywicą nowy zwrot z inwestycji, klikając prawym przyciskiem myszy przed wybraniem opcji odejmij zwrot z inwestycji, a następnie odejmując nowy zwrot z inwestycji od zwrotu z inwestycji maski żywicznej, aby utworzyć nowy zwrot z inwestycji dla pozostałego systemu rurowego. Eksportuj wynikowe zwroty z inwestycji dla obu systemów rurowych w różnych formatach w oparciu o referencje operatorów w celu późniejszego przetwarzania w różnych programach. Dalej przetwarzaj wynikowe zwroty z inwestycji w oprogramowaniu graficznym woluminowym, aby wyeksportować ostateczną wizualizację w postaci obrazu lub wideo.W tym badaniu osiągnięto udane podwójne wstrzyknięcie żywicy z dobrze wypełnionymi wewnątrzwątrobowymi drogami żółciowymi i unaczynieniem żyły wrotnej. Reprezentatywna analiza ilustruje wynik segmentacji danych z dobrze wstrzykniętej wątroby dla myszy P15 i dorosłej myszy, u której żywica jest widoczna w bocznych gałęziach. W typowym przykładzie nieudanego wstrzyknięcia, fizyczne uszkodzenie wątroby podczas zabiegu chirurgicznego spowodowało wyciek żywicy.Również przedwczesne utwardzenie żywicy w igle lub końcówce rurki przed wstrzyknięciem oraz niewystarczająca perfuzja przezsercowa powodowały niedopełnienie systemu. Niewielki wyciek żywicy można ręcznie skorygować podczas segmentacji danych MicroCT. Wysokie ciśnienie wtrysku może spowodować pęknięcie naczyń lub kanałów i nieodwracalne uszkodzenie zbiornika lub architektury kanału.Dodatkowo, pęcherzyki były kolejnym bardzo powszechnym artefaktem iniekcji, który doprowadził do rzadkiego wypełnienia sieci rurowych. Gdy użyto świeżo otwartej żywicy, zaobserwowano wyraźną różnicę w kontraście między żółtymi kanałami żółciowymi wstrzykniętymi żywicą a zielonymi żyłami wrotnymi wstrzykniętymi żywicą. Po trzech miesiącach przechowywania kontrast był wystarczający do odróżnienia żyły wrotnej od przewodu żółciowego.Jednak wytrącanie się wpływało na mieszanie się dwóch żywic, co było widoczne jako niejednorodne zmętnienie w wypełnionej żyle wrotnej. Gdy żywica była starsza niż sześć miesięcy, kontrast uległ degradacji do punktu, w którym niemożliwe było odróżnienie przewodu żółciowego wstrzykniętego na żółto od żyły wrotnej wstrzykniętej na zielono, na podstawie samego kontrastu. Bardzo ważne jest wykonanie ukośnego nacięcia w przewodzie żółciowym wspólnym.W przeciwnym razie włożenie rurki będzie bardzo trudne. Technika DUCT rzuca światło na nowe mechanizmy architektoniczne regeneracji dróg żółciowych w klinicznie istotnym modelu z wyraźnymi cechami w obszarach wnęki i płata obwodowego.

duct-double-resin-casting-followed-micro-computed-tomography-for-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji trójwymiarowej struktury żyły wrotnej wątroby myszy lub wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych. Tę technikę odlewu żywicznego można zastosować również do innych układów przewodowych lub naczyniowych, co umożliwia wizualizację lub kwantyfikację nienaruszonej architektury komunikacyjnej układu in situ.

Trójwymiarowe odlewanie w żywicy i obrazowanie żyły wrotnej myszy lub wewnątrzpasączniczego systemu przewodów żółciowych

Ten film opisuje procedurę odlewania żywicy układu żółciowego, aby zrozumieć architekturę dróg żółciowych 3D. Technika ta zapewnia wgląd w wewnętrzną średnicę i łączność sieciową układu żółciowego, co można wykorzystać do analizy regeneracji wątroby.

Odlewanie żywicy układu żółciowego: technika analizy architektury 3D układu żółciowego w modelu mysim z wykorzystaniem wstrzykiwania żywicy nieprzepuszczalnej dla promieni rentgenowskich

Narzędzia używane do wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wymagają metod kontrastowania drzew naczyniowych. Film ten zademonstrował delikatną technikę iniekcji zastosowaną w celu uzyskania optymalnego kontrastu drzew naczyniowych i zilustrował potencjalne korzyści wynikające ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych.

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego trójwymiarowego cyfrowego modelu do wczesnej diagnozy zwłóknienia wątroby, który obejmuje sztywność każdego woksela w wątrobie pacjenta i dlatego może być wykorzystany do obliczenia proporcji dystrybucji wątroby pacjenta w różnych stadiach zwłóknienia.

Trójwymiarowy cyfrowy model do wczesnej diagnostyki zwłóknienia wątroby w oparciu o elastografię rezonansu magnetycznego

W tym protokole omawiamy implementację modelu udanego ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy. Dodatkowo omówiono adiuwanty do dalszej analizy drożności przeszczepu allogenicznego po udanym OLT u myszy, w szczególności z wykorzystaniem skanów tomografii mikrokomputerowej (microCT).

Udany ortotopowy przeszczep wątroby u myszy z wykorzystaniem angiografii tomografii mikrokomputerowej

Protokół ten wprowadza nowoczesne, wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby (RHIT) do mikroskopii śródżyciowej (IVM) żywych myszy, które zwiększa stabilność tkanek podczas szybkich i ostrych eksperymentów. Konstrukcja RHIT, drukowana w 3D, oferuje opłacalną produkcję, skalowalność i wszechstronność, umożliwiając długotrwałą obserwację procesów metabolicznych u myszy o różnych rozmiarach.

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Poznaj metodę DUCT do analizy naczyń krwionośnych i dróg żółciowych wątroby w 3D. Technika ta umożliwia wizualizację architektury narządu bez użycia przeciwciał i fluorescencji.

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

Przeglądaj więcej filmów