Name: Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj technikę hybrydyzacji in situ multiplex do wizualizacji ekspresji receptorów sprzężonych z białkiem G w neuronach zwoju nerwu błędnego myszy. Metoda ta umożliwia precyzyjne mapowanie profili transkrypcyjnych zróżnicowanych populacji neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Neuroanatomię/Histologię/Mózg Injection Core, finansowaną przez grant NIH #5P01DK119130-02. Autorzy pragną podziękować za pomoc UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (kierowanej przez dr Phelpsa) i jej personelu (Abhijit Bugde i Marcel Mettlen), wspieranej częściowo przez NIH Grant #1S10OD021684-01, wspólny zasób Harold C. Simmons Cancer Center, wspierany częściowo przez NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.

UWAGA: Myszy użyte w tym badaniu były samcami typu dzikiego na czystym tle C57BL/6J. Do multipleksu ISH użyto w sumie 4 myszy. Wszystkie myszy miały około 8 tygodni w momencie złożenia ofiary. Jeden samiec myszy (w wieku około jednego roku) został również wykorzystany do wykazania endogennej fluorescencji związanej ze starzeniem się. Zwierzęta trzymano w wentylowanych klatkach w obiekcie barierowym z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UT Southwestern Medical Center dokonał przeglądu i zatwierdził procedury opisane poniżej. Szczegóły dotyczące odczynników i narzędzi można znaleźć w Tabeli materiałów.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>W dniu złożenia ofiary należy podać myszom nadmierną dawkę wodzianu chloralu (500 mg/kg, i.p.). Perfuzję głęboko znieczulonych myszy przezsercowo za pomocą pompy perystaltycznej z 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 50 ml 10% formaliny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Odbywa się to w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu formaliny.</li>
	<li>Ponieważ zwoje guzkowe, petrosalne i szyjne są zrośnięte, tworząc pojedynczą masę zwojową w mouse15, ostrożnie zbierz całą masę zwoju błędnego z każdej strony (lewej i prawej) za pomocą lunety preparacyjnej oraz cienkich nożyczek i kleszczyków sprężynowych (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Podczas ścinania głowy myszy dużymi nożyczkami (patrz Tabela materiałów), unikaj zmiażdżenia pnia mózgu.</li>
	<li>Postępując zgodnie z podejściem preparacyjnym opisanym wcześniej w klasie rat<sup="xref">40, usuń mięśnie mostkowo-gnykowe i omohyoidalne wzdłuż tchawicy za pomocą małych kleszczyków (Tabela materiałów), aby odsłonić kość potyliczną. Oczyść cały obszar mięśni, tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej, aż widoczna będzie tętnica szyjna, nerw błędny, nerw podjęzykowy i otwór wielki. Przetnij cały nerw podjęzykowy małymi nożyczkami sprężynowymi (tabela materiałów).</li>
	<li>Poszukaj zwoju nodose jako półprzezroczystej masy w pobliżu otworu magnum15. Za pomocą małych nożyczek (Tabela materiałów) ostrożnie przełam kość potyliczną, aby jeszcze bardziej odsłonić zwój szyjny. Szukaj czarnych melanocytów na powierzchni szyi jako wizualnego punktu orientacyjnego.</li>
	<li>Przeciąć przyczepy nerwowe między masą zwoju błędnego i usunąć całą masę zwojową, delikatnie pociągając za obwodowy koniec nerwu błędnego, jednocześnie przecinając zwój szyjny w kierunku pnia mózgu małymi nożyczkami sprężynowymi (tabela materiałów).</li>
	<li>Usuń tkankę spojówkową i tłuszcz przylegający do nerwu błędnego i masy zwojowej tak bardzo, jak to możliwe.</li>
	<li>Ponieważ łatwo jest zgubić jeden ganglion podczas przenoszenia z jednej rurki do drugiej, należy zachować ~0,5 cm nerwu błędnego, aby ułatwić przenoszenie i lokalizację próbek.</li>
	<li>Umieścić zwoje nerwowe za pomocą cienkich kleszczyków w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 4 °C w formalinie przez 24 godziny, a z 30% sacharozą przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Umieść zwoje nerwowe wewnątrz małej kropli (~4 mm Ø) medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na kawałku folii aluminiowej. Następnie zamrozić próbkę na podłożu z suchego lodu.</li>
	<li>Pociąć próbki za pomocą kriostatu w temperaturze -20 °C na odcinki o grubości 14 μm i zebrać na szklanych szkiełkach mikroskopowych w 3 seriach oddalonych od siebie o 42 μm. 
	UWAGA: Unikaj umieszczania sekcji blisko krawędzi zjeżdżalni. Aby oszczędzać odczynniki, sekcje tkanek powinny być jak najściślej upakowane, ale bez nakładania się na siebie.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do ISH przez co najmniej 6 miesięcy. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów dotyczących fluorescencji endogennej.</li>
</ol>
2. Obróbka wstępna i ISH
<ol>
	<li>Przed dniem eksperymentów należy przeprowadzić autoklaw laboratoryjne naczynia laboratoryjne przeznaczone do użycia w ISH, w tym naczynia do barwienia i mycia słoików buforowych. 
	UWAGA: Podczas pracy w warunkach wolnych od RNaz nie jest krytyczna, zawsze noś rękawice. Butelki z roztworem do odkażania RNazy (tabela materiałów) należy przechowywać w zasięgu ręki na wypadek podejrzenia zanieczyszczenia.</li>
	<li>Pierwszego dnia rozprowadź szkiełka do temperatury pokojowej na ławce specjalnie przeznaczonej do ISH. Opłucz szkiełka w 1x PBS i piecz je przez 30 minut w temperaturze 60 °C w piecu do pieczenia (tabela materiałów).</li>
	<li>Po utrwaleniu szkiełek w 4% formalinie przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Doprowadź odczynniki w zestawie multipleksowym (tabela materiałów) do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w 50%, 70% i 100% etanolu przez 5 minut każda. Nakładać roztwórH2O2na próbki przez 10 minut, a następnie spłukać w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).</li>
	<li>Próbki należy traktować odczynnikiem do pobierania docelowego przez 5 minut, przepłukać ddH2O, a następnie dodać 100% etanol i wysuszyć na powietrzu. Za pomocą pisaka hydrofobowego utwórz barierę wokół próbek. 
	UWAGA: Nie należy nakładać bariery hydrofobowej zbyt blisko odcinków tkanki.</li>
	<li>Nakładać proteazę przez 30 minut w temperaturze 40 °C w piecu do hybrydyzacji (tabela materiałów).</li>
	<li>W międzyczasie podgrzej sondy w temperaturze 40 °C i schłodzić je w temperaturze pokojowej przed użyciem. Inkubować szkiełka z pożądaną kombinacją sond docelowych (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; lub Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w piecu do hybrydyzacji.</li>
	<li>Inkubować tkankę kontroli ujemnej z sondą C1 z reduktazą dihydrodipikolinianu (DapB) przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w piecu do hybrydyzacji.</li>
	<li>Wypłucz szkiełka w buforze do płukania i przechowuj przez noc w 5x soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC) w temperaturze pokojowej. Dla wygody podziel eksperyment na dwa dni. Następnego dnia przepłukać szkiełka buforem do przemywania i inkubować je z odczynnikami do amplifikacji wymienionymi poniżej (patrz instrukcja obsługi w Tabeli materiałów).</li>
	<li>Zastosuj AMP1 (30 min w 40 °C), AMP2 (30 min w 40 °C) i AMP 3 (15 min w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.</li>
	<li>Rozpuścić każdy barwnik Opal (tabela materiałów) w dimetylosulfotlenku i przechowywać roztwory w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Dla kanału 1 inkubować szkiełka z HRP-C1 (15 min w 40 °C) i Opal 520 (kolor zielony; rozcieńczenie 1/1 500; 30 minut w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.</li>
	<li>Dla kanału 2 inkubować szkiełka z HRP-C2 (15 min w 40 °C) i Opal 570 (kolor żółty; rozcieńczenie 1/1 500; przez 30 minut w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.</li>
	<li>Dla kanału 3 inkubować szkiełka z HRP-C3 (15 min w 40 °C) i Opal 690 (kolor dalekiej czerwieni; rozcieńczenie 1/1,500; przez 30 minut w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.</li>
	<li>Umyj szkiełka i wystawij je na działanie 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) przez 30 s.</li>
	<li>Natychmiast nałóż podłoże mocujące na każde szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe na wycinku tkanki.</li>
	<li>Przechowywać tkanki poziomo w uchwycie na szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.</li>
</ol>
3. Mikroskopia i analiza danych
UWAGA: Dane Multiplex ISH mogą być obrazowane za pomocą szerokiej gamy instrumentów z odpowiednimi filtrami. Jednak preferowaną metodą obrazowania jest mikroskopia konfokalna z obiektywami 20x i 63x (olej); Zapoznaj się z dyskusją, aby poznać przyczyny. Patrz Rysunek 2 w celu określenia optymalnego stosunku sygnału do szumu.
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w linie laserowe o długości fali 488, 561 i 633 nm. Należy zastosować następujące parametry akwizycji (zob. tabela 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, zakres wykrywania 668-696 nm, moc 2,0, wzmocnienie 724); Opal 570 (laser DPSS 561 nm, zakres detekcji 579-627 nm, <moc 15,0, <wzmocnienie 450); Opal 520 (laser argonowy 488 nm, zakres detekcji 499-535 nm, <moc 6,0, <zysk 830); DAPI (laser diodowy 405, zakres wykrywania 415-502 nm, <moc 12.0, <wzmocnienie 532).</li>
	<li>Aby poprawić jakość obrazów, nabierz ze średnią linii 4 i rozmiarem piksela co najmniej 1024 x 1024. 
	UWAGA: Powyższe parametry są podane tylko jako przykład, a modyfikacje są zalecane w zależności od jednego instrumentu, powiększenia (20x lub 63x), poziomów ekspresji i endogennych poziomów fluorescencji dla danej tkanki.</li>
	<li>Gdy parametry akwizycji są zadowalające, zbierz obrazy przy użyciu tych samych ustawień. Przypisz fałszywe kolory do każdego kanału, aby ułatwić wizualizację. 
	UWAGA: Na przykład czerwony (Phox2b lub Prdm12), cyjan (Cck1r), żółty (Ghsr) i szary (DAPI).</li>
	<li>Przeprowadź zliczanie komórek za pomocą obrazów cyfrowych, identyfikując zarys profili RNAscope-dodatnich z jednym jądrem lekko wybarwionym DAPI. Oblicz procent profili RNAdodatnich wyrażających każdy transkrypt [<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-C].</li>
	<li>Aby poprawić rygor i dokładność szacunków, policz co najmniej 2000 profili neuronalnych od co najmniej 4 różnych zwierząt. Liczenie należy wykonywać oddzielnie od lewego i prawego zwoju.</li>
	<li>Wprowadź dane na wykresie kołowym z łączną liczbą zliczonych profili.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby uzyskać obrazy i zszyć ze sobą obrazy 20x. Użyj ImageJ-Fiji i innego oprogramowania do zdjęć i projektowania, aby wygenerować końcowe płyty. Dopasowania kontrastu i jasności można stosować równomiernie do wszystkich obrazów.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Technika ISH została wynaleziona pod koniec lat sześćdziesiątychXX wieku 42. Jednak dopiero w połowie lat 80. XX wieku zaczęto go stosować do wykrywania mRNA w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym43,44. Biorąc pod uwagę niejednorodność układu nerwowego i nawracające problemy z przeciwciałami, lokalizacja określonego transkryptu na poziomie komórkowym pozostaje nieocenionym narzędziem. Niemniej jednak tradycyjne metody ISH pozostały pra...

Ciała komórkowe aferentów nerwu błędnego znajdują się w zwojach szyjnych, petrosalnych i bezdawkowych1,2,3. Ich aksony przemieszczają się razem przez kilka gałęzi nerwu błędnego do terytoriów czaszkowo-szyjnych, piersiowych i brzusznych4,5,6,7. Ze swoich końcówek trzewnych, aferenty nerwu błędnego mogą reagować na szeroki zakres bodźców fizjologicznych i szkodliwych8,9,10. Jednak rozmieszczenie cząsteczek sygnałowych i receptorów zaangażowanych w wyczuwanie nerwu błędnego pozostaje słabo scharakteryzowane. Dzieje się tak częściowo dlatego, że zwoje nerwu błędnego, pomimo swoich niewielkich rozmiarów, wyrażają szerokie spektrum receptorów, w tym dużą liczbę GPCRs8,11,12,13. Co więcej, neurony doprowadzające nerwu błędnego są z natury heterogeniczne i wykazują odrębne profile molekularne14. Aby skomplikować sprawę, zwoje szyjne, petrosalne i bezdawkowe są przyczepione u myszy, tworząc w ten sposób pojedynczą masę zwojową. Wreszcie, w podgrupie zwierząt, zwój nodose jest przyłączony do współczulnego górnego ganglionu szyjnego15.
W przeszłości badacze zwracali się do immunohistochemii, aby badać neurochemiczny skład neuronów doprowadzających nerwu błędnego16,17,18. Chociaż immunohistochemia z wykorzystaniem zwalidowanych przeciwciał jest przydatna, wyniki badań immunohistochemicznych należy interpretować z ostrożnością. Na przykład liczne próby zidentyfikowania specyficznych przeciwciał przeciwko GPCR nie powiodły się19,20,21,22,23,24,25, co doprowadziło badaczy do wniosku, że większość przeciwciał przeciwko GPCR jest niewiarygodna. Aby obejść te problemy, ilościowy PCR (qPCR) jest szeroko stosowany do oceny ekspresji genów w masie zwojowej nerwu błędnego gryzoni26,27,28,29. Jednak badanie ekspresji genów za pomocą qPCR odbywa się kosztem utraty informacji przestrzennej. W szczególności nie można przewidzieć, ile komórek lub jakie typy komórek wyrażają określony gen będący przedmiotem zainteresowania (np. komórki nodose vs. komórki szyjne). Powtarzające się problemy obejmują również zanieczyszczenie sąsiednimi tkankami i włączenie różnych długości nerwu błędnego, górnych zwojów szyjnych i szyjnych podczas sekcji15. W wyniku powyższych trudności kontrowersje otaczają ekspresję i dystrybucję kilku GPCR w neuronach doprowadzających nerwu błędnego. Jeden szczególnie zagadkowy przykład dotyczy receptora greliny (Ghsr). Podczas gdy niektóre badania wykazały powszechną ekspresję tego receptora w neuronach doprowadzających nerwu błędnego30,31,32, inne wykazały, że mRNA Ghsr jest prawie niewykrywalne w zwoju bez dawki11,14. Szczegółowe mapowanie mRNA Ghsr w masie zwoju błędnego jest zatem uzasadnione.
Hybrydyzacja in situ (ISH) została również wykorzystana do oceny wzorców ekspresji genów w masie zwoju błędnego 7,11,12,33,34,35. Ponieważ techniki oparte na RNA pozostają w większości przypadków bardziej niezawodne i specyficzne niż techniki oparte na przeciwciałach36,37, badania ISH okazały się cenne dla lepszego zrozumienia neurochemicznego kodowania neuronów doprowadzających nerwy błędnego. Niemniej jednak tradycyjne techniki ISH same w sobie nie są pozbawione zastrzeżeń. Radioaktywny ISH jest wrażliwy, ale generuje tło i pozostaje uciążliwy38. Nieradioaktywny ISH jest mniej skomplikowany, ale też mniej czuły38. W przeciwieństwie do tego, niedawno opracowana metoda RNAscope ISH jest bardzo czuła i generuje minimalne background39. W obecnym badaniu zastosowano multipleksowy fluorescencyjny RNAscope do wykrywania GPCR w neuronach doprowadzających błędnych myszy. Skupiliśmy się na mapowaniu dystrybucji Ghsr i porównaliśmy jej dystrybucję z dystrybucją receptora cholecystokininy (Cck1r), innego GPCR, o którym dobrze wiadomo, że ulega ekspresji w zwoju nodose ganglion34. Wreszcie, dwa czynniki transkrypcyjne, sparowany homeobox 2b (Phox2b) i białko palca cynkowego 12 domeny PR (Prdm12), zostały użyte jako selektywne markery odpowiednio dla neuronów dozujących nodose i szyjnych14. Bez wizualizacji Phox2b lub Prdm12 trudno byłoby z całą pewnością zidentyfikować aferenty szyjne i aferentne bez dawki. W całym artykule omówiono również potencjalne pułapki techniczne.

<table><tbody><tr><td>10x</td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763-80</td><td></td></tr><tr><td>&deg; C</td><td>zamrażarka PHCBI</td><td>MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td>Oprogramowanie do</td><td>zdjęć i projektowania</td>Adobe <td></td></tr><tr><td>Piec do pieczenia</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model: 658</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Laboratoria Badań Mózgu</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L</td><td>medium montażowe</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>w piecu</td><td></td><td></td> HybEZ</tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fidżi</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki</td><td>Henry Schein</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki wirówkowe</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minipompa o zmiennym przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>Biomarker fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>Biomarker fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>Biomarker fluorescencyjny</td></tr><tr><td>ProLong Gold Podłoże montażowe Antifade Mountant</td><td></td><td></td><td>do komórek znakowanych fluorescencyjnie</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluorescencyjny zestaw odczynników v2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>323100</td><td>multiplex</td></tr><tr><td>sonda RNAscope Mysz Cck1r-C3</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mysz DapB</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mysz Ghsr</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td></td><td></td>426141</tr><tr><td>Sonda RNAscope Mysz Phox2b-C2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mysz Prdm12-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Roztwór odkażający Rnazy</td></tr><tr><td>Małe nożyczki preparacyjne</td><td>Prowadnice</td><td></td> Millipore Sigma Z265977 <td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek OCT medium</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Instrukcja obsługi</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania ZEN</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem g w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji multiplex in situ

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

To badanie opisuje protokół multipleksowej hybrydyzacji in situ (ISH) zwojów szyjnych myszy bez dawki, ze szczególnym naciskiem na wykrywanie ekspresji receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Utrwalone formaliną zwoje szyjne bez dawki przetworzono za pomocą technologii RNAscope w celu jednoczesnego wykrycia ekspresji dwóch reprezentatywnych GPCR (receptorów cholecystokininy i greliny) w połączeniu z jednym genem markerowym albo nodose (sparowany homeobox 2b, Phox2b), albo neuronów aferentnych szyjnych (białko palca cynkowego domeny PR 12, Prdm12). Oznaczone zwoje zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu określenia rozkładu i wzorców ekspresji wyżej wymienionych transkryptów. Krótko mówiąc, stwierdzono, że neurony doprowadzające Phox2b wykazują obfitą ekspresję receptora cholecystokininy (Cck1r), ale nie receptora greliny (Ghsr). Stwierdzono również, że niewielki podzbiór neuronów aferentnych Prdm12 wykazuje ekspresję Ghsr i/lub Cck1r. Omówiono potencjalne zastrzeżenia techniczne w projektowaniu, przetwarzaniu i interpretacji multipleksu ISH. Podejście opisane w tym artykule może pomóc naukowcom w generowaniu dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Choć metodę RNAScope można stosować u zwierząt w każdym wieku, płci lub o dowolnym podłożu genetycznym, zaleca się pracę z młodymi osobnikami dorosłymi (&lt;3 miesiąca życia). Wynika to z faktu, że artefakty fluorescencyjne (np. lipofuscyna) są powszechne w neuronach starszych zwierząt41. Zwoje utrwalone w formalinie pochodzące od starszych myszy często wykazują zaskakująco intensywną endogenną fluorescencję, którą można łatwo pomylić z rzeczywistym barwieniem (Rysunek 1A</str...

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Ta procedura jest bardzo czuła i umożliwia wizualizację kilku transkrypcji przy minimalnym tle. Ta metoda może generować dokładne mapy profilu transkrypcyjnego wysoce heterogenicznych typów komórek. Procedurę zademonstrujemy ja i Johnson Bob-manuel, technik badawczy w laboratorium.Zacznij od zebrania całej masy zwoju błędnego od ośmiotygodniowej myszy z każdej strony, za pomocą lunety sekcyjnej i narzędzi chirurgicznych. Po dekapitacji myszy użyj małych kleszczy, aby usunąć mięśnie mostkowo-gnykowe i omohyoidalne boczne do tchawicy, aby odsłonić kość potyliczną. Oczyść cały obszar mięśni i tkanek, aż widoczna będzie tętnica szyjna, nerw błędny i podjęzykowy oraz otwór wielki.Następnie przetnij cały nerw podjęzykowy małymi nożyczkami sprężynowymi. Zlokalizuj zwój bez dawki jako półprzezroczystą masę w pobliżu otworu wielkiego. Za pomocą małych nożyczek ostrożnie złam kość potyliczną.Aby jeszcze bardziej odsłonić zwój szyjny, zlokalizuj czarne melanocyty na powierzchni szyi jako wizualny punkt orientacyjny. Po znalezieniu ganglionów przetnij przyczepy nerwowe między masą zwojową nerwu błędnego i delikatnie pociągnij za obwodowy koniec nerwu błędnego, jednocześnie przecinając ganglion szyjny w kierunku pnia mózgu małymi nożyczkami sprężynowymi w celu ekstrakcji całej masy zwojowej. Usuń tkankę spojówkową, masę zwojową i tłuszcz przylegający do nerwu błędnego.Utrzymywanie około pół centymetra nerwu błędnego w celu ułatwienia obsługi i lokalizacji próbek. Umieść usuń do zwojów za pomocą drobnych kleszczyków w 1,5-milimetrowych mikroprobówkach wirówkowych. I inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w formalinie przez 24 godziny.A następnie z 30% sacharozą przez 24 godziny. Po inkubacji umieść zwoje nerwowe w kropli o średnicy czterech milimetrów pożywki o optymalnej temperaturze cięcia na kawałku folii aluminiowej. I wyprofiluj próbkę na podłożu z suchego lodu.Zamrożone próbki należy pokroić za pomocą kriostatu na odcinki o grubości 14 mikrometrów w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i zebrać wycięte skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych w trzech seriach oddalonych od siebie o 42 mikrometry. Przepłukać szkiełka skrawkami tkanek w PBS. I piecz przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku.Następnie umieść szkiełka w 4% formalinie przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Seryjnie odwadniaj szkiełka w 50%, 70% i 100% etanolu przez pięć minut każda. I nanieść roztwór nadtlenku wodoru na próbki na 10 minut przed spłukaniem w wodzie podwójnie destylowanej.W przypadku hybrydyzacji in situ lub ISH należy traktować próbki odczynnikiem do odzyskiwania docelowego przez pięć minut. Następnie sekwencyjnie przepłucz próbki w podwójnie destylowanej wodzie i 100% etanolu, a następnie wysusz na powietrzu. Za pomocą pisaka hydrofobowego stwórz barierę wokół próbek.Podczas gdy próbki są traktowane proteazą przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza i piecu do hybrydyzacji, przed użyciem podgrzej sondy w temperaturze 40 stopni Celsjusza i ostudź je w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu z pieca inkubuj szkiełka z pożądaną kombinacją sond docelowych przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Inkubować ujemną tkankę kontrolną z reduktazą dihydrodipikolinianu lub DapB, celować w sondę C1 przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Opłucz szkiełka w buforze do płukania i przechowuj przez noc w pięciokrotnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przepłukać szkiełka buforem do przemywania przed inkubacją z odczynnikami do amplifikacji. I potraktuj odczynnikami specyficznymi dla kanału, jak opisano w manuskrypcie.Umyć szkiełka, a następnie poddać je działaniu DapB przez 30 sekund. Następnie natychmiast nałóż medium montażowe na każde szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe na sekcji tkanki. Trzymaj tkanki poziomo w uchwycie na szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obrazowania.Przygotuj mikroskop konfokalny do obrazowania, ustawiając wymagane parametry. Uzyskaj obrazy ze średnią linii wynoszącą cztery i rozmiarem piksela co najmniej 1024 na 1024, aby poprawić jakość obrazów. Gdy będziesz zadowolony z parametrów akwizycji, zacznij pobierać obrazy przy użyciu tych samych ustawień.Przypisz fałszywe kolory do każdego kanału, aby ułatwić wizualizację. Korzystając z obrazów cyfrowych, przeprowadź liczenie komórek, identyfikując zarys dodatnich profili zakresu RNA z jednym jądrem lekko wybarwionym DapB. Oblicz procent dodatnich profili zakresu RNA wyrażających każdy transkrypt.Optymalne parametry akwizycji zostały dobrane dla każdego lasera w oparciu o niespecyficzną fluorescencję uzyskaną w tkance kontroli ujemnej. Endogenna fluorescencja w zwoju bez dawki młodej dorosłej myszy jest minimalna. A inkubacja z sondą DapB nie dała sygnałów.Przy zwiększonej mocy lasera i wzmocnieniu lasera o długości 488 nanometrów pojawiają się niechciane tło i losowe kropki fluorescencyjne. Technikę zakresu RNA zastosowano do wykrycia trzech genów w wycinkach tkanki masy zwojowej nerwu błędnego. Profil tkankowy był dodatni dla GHSR i CCK1R.Profil obejmował zarówno transkrypty Phox2b, jak i CCK1R w rostralnej części zwoju nodose. W wyniku multipleksu ISH w neuronach aferentnych bez dawki, sygnały Phox2b specyficznie kumulowały się w neuronach aferentnych, zlokalizowanych w zwoju dozu. Sygnały CCK1R intensywnie znakowane były wiele neuronów w zwoju nodose.Przy małym powiększeniu nie można było łatwo zaobserwować komórek wyrażających niskie sygnały CCK1R lub GSHR. DapB pomógł uwidocznić tkankę i zidentyfikować neurony doprowadzające nerwu błędnego z dużym i lekko zabarwionym jądrem. Przy dużym powiększeniu widoczne są dodatnie profile Phox2b.Profile drugi i trzeci to komórki Phox2b z wysokimi i umiarkowanymi sygnałami CCK1R. Profil czwarty wyrażał zarówno GHSR, jak i CCK1R. W wyniku multipleksowego ISH neuronów doprowadzających szyjnych, transkrypt PRDM12 można było zaobserwować specyficznie zgromadzony w neuronach doprowadzających zlokalizowanych w zwoju szyjnym.Przy dużym powiększeniu wykryto umiarkowane sygnały dla CCK1R w profilu pierwszym i drugim. Profil trzeci jest przedstawicielem komórek PRDM12 ujemnych dla CCK1R lub GHSR. Ważnym czynnikiem jest konsystencja sekcji.Równie ważne jest sprawdzenie, czy parametry akwizycji obrazowania nie generują niepożądanych sygnałów tła. Multipleksowa hybrydyzacja in situ stała się złotym standardem w medycynie molekularnej, zwłaszcza w dziedzinie neuroanatomii. Metodę tę można łatwo połączyć z immunohistochemią.

detection-g-protein-coupled-receptor-expression-mouse-vagal-afferent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

U myszy zdolność wykrywania feromonów jest zapośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO). W niniejszej pracy opisano przygotowanie ostrych skrawków tkanki VNO do obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację subpopulacji i/lub pojedynczych neuronów w żywej tkance i jest wygodne w procesie identyfikacji receptorów i ligandów.

Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Narząd jamistnokaczkowy (VNO) wykrywa wewnątrzgatunkowe sygnały chemiczne, które przekazują informacje społeczne i rozrodcze. Przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania Ca2+ z wykorzystaniem myszy transgenicznych wykazujących ekspresję G-CaMP2 w tkance VNO. Podejście to pozwala nam analizować złożone wzorce odpowiedzi neuronów jamistnokaczkowych na liczne bodźce feromonowe.

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Źródło: Baleriola, J.,  et. al., Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w sekcjach mózgu przy użyciu hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości.  J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.

Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

Ten protokół opisuje wykrywanie za pomocą mikroskopii konfokalnej internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w komórkach ssaków. Obejmuje podstawową procedurę hodowli komórek, transfekcji i mikroskopii konfokalnej oraz zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR wyrażanego fuzją.

Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Poznaj technikę hybrydyzacji in situ multiplex do wizualizacji ekspresji receptorów sprzężonych z białkiem G w neuronach zwoju nerwu błędnego myszy. Metoda ta umożliwia precyzyjne mapowanie profili transkrypcyjnych zróżnicowanych populacji neuronów.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Przeglądaj więcej filmów