Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Ta procedura jest bardzo czuła i umożliwia wizualizację kilku transkrypcji przy minimalnym tle. Ta metoda może generować dokładne mapy profilu transkrypcyjnego wysoce heterogenicznych typów komórek. Procedurę zademonstrujemy ja i Johnson Bob-manuel, technik badawczy w laboratorium.

Zacznij od zebrania całej masy zwoju błędnego od ośmiotygodniowej myszy z każdej strony, za pomocą lunety sekcyjnej i narzędzi chirurgicznych. Po dekapitacji myszy użyj małych kleszczy, aby usunąć mięśnie mostkowo-gnykowe i omohyoidalne boczne do tchawicy, aby odsłonić kość potyliczną. Oczyść cały obszar mięśni i tkanek, aż widoczna będzie tętnica szyjna, nerw błędny i podjęzykowy oraz otwór wielki.

Następnie przetnij cały nerw podjęzykowy małymi nożyczkami sprężynowymi. Zlokalizuj zwój bez dawki jako półprzezroczystą masę w pobliżu otworu wielkiego. Za pomocą małych nożyczek ostrożnie złam kość potyliczną.

Aby jeszcze bardziej odsłonić zwój szyjny, zlokalizuj czarne melanocyty na powierzchni szyi jako wizualny punkt orientacyjny. Po znalezieniu ganglionów przetnij przyczepy nerwowe między masą zwojową nerwu błędnego i delikatnie pociągnij za obwodowy koniec nerwu błędnego, jednocześnie przecinając ganglion szyjny w kierunku pnia mózgu małymi nożyczkami sprężynowymi w celu ekstrakcji całej masy zwojowej. Usuń tkankę spojówkową, masę zwojową i tłuszcz przylegający do nerwu błędnego.

Utrzymywanie około pół centymetra nerwu błędnego w celu ułatwienia obsługi i lokalizacji próbek. Umieść usuń do zwojów za pomocą drobnych kleszczyków w 1,5-milimetrowych mikroprobówkach wirówkowych. I inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w formalinie przez 24 godziny.

A następnie z 30% sacharozą przez 24 godziny. Po inkubacji umieść zwoje nerwowe w kropli o średnicy czterech milimetrów pożywki o optymalnej temperaturze cięcia na kawałku folii aluminiowej. I wyprofiluj próbkę na podłożu z suchego lodu.

Zamrożone próbki należy pokroić za pomocą kriostatu na odcinki o grubości 14 mikrometrów w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i zebrać wycięte skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych w trzech seriach oddalonych od siebie o 42 mikrometry. Przepłukać szkiełka skrawkami tkanek w PBS. I piecz przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku.

Następnie umieść szkiełka w 4% formalinie przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Seryjnie odwadniaj szkiełka w 50%, 70% i 100% etanolu przez pięć minut każda. I nanieść roztwór nadtlenku wodoru na próbki na 10 minut przed spłukaniem w wodzie podwójnie destylowanej.

W przypadku hybrydyzacji in situ lub ISH należy traktować próbki odczynnikiem do odzyskiwania docelowego przez pięć minut. Następnie sekwencyjnie przepłucz próbki w podwójnie destylowanej wodzie i 100% etanolu, a następnie wysusz na powietrzu. Za pomocą pisaka hydrofobowego stwórz barierę wokół próbek.

Podczas gdy próbki są traktowane proteazą przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza i piecu do hybrydyzacji, przed użyciem podgrzej sondy w temperaturze 40 stopni Celsjusza i ostudź je w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu z pieca inkubuj szkiełka z pożądaną kombinacją sond docelowych przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Inkubować ujemną tkankę kontrolną z reduktazą dihydrodipikolinianu lub DapB, celować w sondę C1 przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Opłucz szkiełka w buforze do płukania i przechowuj przez noc w pięciokrotnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przepłukać szkiełka buforem do przemywania przed inkubacją z odczynnikami do amplifikacji. I potraktuj odczynnikami specyficznymi dla kanału, jak opisano w manuskrypcie.

Umyć szkiełka, a następnie poddać je działaniu DapB przez 30 sekund. Następnie natychmiast nałóż medium montażowe na każde szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe na sekcji tkanki. Trzymaj tkanki poziomo w uchwycie na szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obrazowania.

Przygotuj mikroskop konfokalny do obrazowania, ustawiając wymagane parametry. Uzyskaj obrazy ze średnią linii wynoszącą cztery i rozmiarem piksela co najmniej 1024 na 1024, aby poprawić jakość obrazów. Gdy będziesz zadowolony z parametrów akwizycji, zacznij pobierać obrazy przy użyciu tych samych ustawień.

Przypisz fałszywe kolory do każdego kanału, aby ułatwić wizualizację. Korzystając z obrazów cyfrowych, przeprowadź liczenie komórek, identyfikując zarys dodatnich profili zakresu RNA z jednym jądrem lekko wybarwionym DapB. Oblicz procent dodatnich profili zakresu RNA wyrażających każdy transkrypt.

Optymalne parametry akwizycji zostały dobrane dla każdego lasera w oparciu o niespecyficzną fluorescencję uzyskaną w tkance kontroli ujemnej. Endogenna fluorescencja w zwoju bez dawki młodej dorosłej myszy jest minimalna. A inkubacja z sondą DapB nie dała sygnałów.

Przy zwiększonej mocy lasera i wzmocnieniu lasera o długości 488 nanometrów pojawiają się niechciane tło i losowe kropki fluorescencyjne. Technikę zakresu RNA zastosowano do wykrycia trzech genów w wycinkach tkanki masy zwojowej nerwu błędnego. Profil tkankowy był dodatni dla GHSR i CCK1R.

Profil obejmował zarówno transkrypty Phox2b, jak i CCK1R w rostralnej części zwoju nodose. W wyniku multipleksu ISH w neuronach aferentnych bez dawki, sygnały Phox2b specyficznie kumulowały się w neuronach aferentnych, zlokalizowanych w zwoju dozu. Sygnały CCK1R intensywnie znakowane były wiele neuronów w zwoju nodose.

Przy małym powiększeniu nie można było łatwo zaobserwować komórek wyrażających niskie sygnały CCK1R lub GSHR. DapB pomógł uwidocznić tkankę i zidentyfikować neurony doprowadzające nerwu błędnego z dużym i lekko zabarwionym jądrem. Przy dużym powiększeniu widoczne są dodatnie profile Phox2b.

Profile drugi i trzeci to komórki Phox2b z wysokimi i umiarkowanymi sygnałami CCK1R. Profil czwarty wyrażał zarówno GHSR, jak i CCK1R. W wyniku multipleksowego ISH neuronów doprowadzających szyjnych, transkrypt PRDM12 można było zaobserwować specyficznie zgromadzony w neuronach doprowadzających zlokalizowanych w zwoju szyjnym.

Przy dużym powiększeniu wykryto umiarkowane sygnały dla CCK1R w profilu pierwszym i drugim. Profil trzeci jest przedstawicielem komórek PRDM12 ujemnych dla CCK1R lub GHSR. Ważnym czynnikiem jest konsystencja sekcji.

Równie ważne jest sprawdzenie, czy parametry akwizycji obrazowania nie generują niepożądanych sygnałów tła. Multipleksowa hybrydyzacja in situ stała się złotym standardem w medycynie molekularnej, zwłaszcza w dziedzinie neuroanatomii. Metodę tę można łatwo połączyć z immunohistochemią.