Name: Model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczuloną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczulonej. Ta metoda ocenia utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, eliminując śmierć zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esther Bloem i Thomas Nygaard są wdzięczni za wsparcie w pomiarach FVIII w plazmie. Bo Alsted jest znany z rysowania i obróbki szablonów oraz bloków tnących.

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Organ ds. Opieki nad Zwierzętami w Novo Nordisk A/S oraz Duński Inspektorat Eksperymentów na Zwierzętach, Duńskie Ministerstwo Żywności, Rolnictwa i Rybołówstwa. Zoptymalizowana metoda 40 minut obejmuje w projekcie znieczulenie i czas dozowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Do tej procedury wymagane są hemofilne myszy obu płci w wieku od 10 do 16 tygodni.
1. Przygotowania przed badaniem
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory dozujące w odpowiednich stężeniach.</li>
	<li>Rozpocząć łaźnię wodną i podgrzać do temperatury 37 °C. Napełnić probówki wirówkowe o pojemności 15 ml do pobierania krwi solą fizjologiczną (0,9% NaCl).</li>
	<li>Umieść 15 ml probówek z solą fizjologiczną w otworach w rozgrzanej płycie podstawy co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Zidentyfikuj myszy i zapisz ich wagę. Unikaj dotykania myszy częściej niż to konieczne, ponieważ może to powodować stres i wpływać na badanie.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do pracy przygotuj stanowisko pracy w dygestorium, aby wszystko było w zasięgu ręki: serwetki, uchwyt na ogon, gaza, strzykawki, skalpele, stopery i papier do notowania przepływu krwi.</li>
	<li>Umieść znak ogona i klocki tnące na płycie grzewczej - zimne bloki spowodują skurcz żył, a tym samym wpłyną na krwawienie.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Zabieg znieczulenia izofluranem należy przeprowadzić w dygestorium.</li>
	<li>Ustawić parownik gazu na początkowo 5% izofluranu w 30% O2/70% N2O w komorze anestezjologicznej o przepływie 1 L/min. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby komora anestezjologiczna się napełniła (około 5 minut w zależności od objętości komory i natężenia przepływu gazu). Zapewnij szybką indukcję (mniej niż jedną minutę).</li>
	<li>Umieść myszy w komorze anestezjologicznej, aż stracą przytomność. 
	UWAGA: Powinno to nastąpić w ciągu minuty lub krócej, jeśli komora jest wystarczająco wypełniona.</li>
	<li>Zapewnij odpowiednie znieczulenie poprzez brak bolesnej reakcji na odruch pedałowania (mocne szczypanie palca).</li>
	<li>Umieść myszy na płycie grzewczej, upewniając się, że nos znajduje się w stożku nosowym.</li>
	<li>Zmniejsz znieczulenie do poziomu utrzymania 2% izofluranu w 30% O2/70% N2O i umieść plastikową osłonę nad myszami, aby zmniejszyć utratę ciepła. Zastosuj odpowiednią maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Oznacz ogon o średnicy 2,5 mm za pomocą bloku znacznika ogona. Nie wciskaj ogona na siłę w szczelinę w bloku - musi ściśle przylegać (rysunek uzupełniający 1)</li>
	<li>Umieść ogon w probówce z solą fizjologiczną na co najmniej 5 minut, aby zapewnić ciepłą żyłę ogonową, która jest optymalna do dożylnego dawkowania.</li>
</ol>
3. Dozowanie roztworu testowego
<ol>
	<li>Umieść jedną mysz w uchwycie ogonowym z nosem w masce anestezjologicznej.</li>
	<li>Dozuj zwierzęciu interesujący go związek (w tym przypadku rFVIII) i natychmiast uruchom stoper (t = 0).</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem na płycie grzewczej z ogonkiem w rurce z solą fizjologiczną. Powtórz procedurę z innymi myszami.</li>
</ol>
4. Wykonywanie przecięcia żył ogonowych
<ol>
	<li>Przecięcie żyły ogonowej należy wykonać dokładnie 5 minut po podaniu. Umieść ogon w bloku tnącym i obróć o 90°, aby odsłonić żyłę (rysunek uzupełniający 2).</li>
	<li>Wykonać nacięcie po przeciwnej stronie/żyle od miejsca, w którym podano roztwór badany.</li>
	<li>Przeciągnij ostrze skalpela #11 przez szczelinę bloku tnącego, przytrzymując ogon, aby wywołać krwawienie. Zresetuj stoper i natychmiast włóż ogon do soli fizjologicznej.</li>
</ol>
5. Czas obserwacji i wyzwania
<ol>
	<li>Obserwuj krwawienie i notuj początek i koniec krwawienia przez 40 minut; zapisz to na papierze do notowania przepływu krwi. 
	UWAGA: Ta wizualna ocena krwawienia może się nieznacznie różnić ze względu na subiektywność.</li>
	<li>Pierwotne krwawienie musi ustąpić w ciągu 3 minut po wykonaniu cięcia. Jeśli tak nie jest, zdyskwalifikuj mysz, poddaj ją eutanazji i wymień (niezatrzymanie pierwotnego krwawienia może wskazywać na zbyt poważny uraz lub brak pierwotnej hemostazy, jak u myszy vWF KO).</li>
	<li>Jeśli nie ma krwawienia po 10, 20 i 30 minutach od urazu, zakwestionuj cięcie ogona zgodnie z opisem w krokach 4-5.</li>
	<li>Użyj wacika nasączonego ciepłą solą fizjologiczną z osobnej probówki przechowywanej w łaźni wodnej. Podnieś ogon z soli fizjologicznej i delikatnie przetrzyj dwukrotnie mokrą gazą w kierunku dystalnym nad nacięciem ogona.</li>
	<li>Po każdym wyzwaniu natychmiast ponownie zanurz ogon w rurce soli fizjologicznej.</li>
	<li>Po t=40 min zatrzymać pobieranie krwi, usuwając ogonek z probówki z solą fizjologiczną.</li>
</ol>
6. Pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Po t = 40 min pobrać próbki krwi z żyły nadoczodołowej.</li>
</ol>
7. Eutanazja
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, będąc jeszcze w pełnej narkozy.</li>
</ol>
8. Traktowanie próbek
<ol>
	<li>Odwirować 15 ml probówek do pobierania krwi z solą fizjologiczną o stężeniu 4000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant z probówek o pojemności 15 ml, ponownie zawieś osad w 2-14 ml roztworu lizującego erytrocyty (RBC), a następnie rozcieńcz go, aż osiągnie jasny kolor kawy.</li>
	<li>Zwróć uwagę na całkowitą objętość (objętość krwi + objętość roztworu lizującego erytrocyty (RBC) dodanego za pomocą podziałki na probówce).</li>
	<li>Przenieść 2 ml rozcieńczenia do probówki z hemoglobiną i przechowywać w lodówce do czasu analizy hemoglobiny.</li>
	<li>Określ utratę krwi, mierząc stężenie hemoglobiny w soli fizjologicznej. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm na czytniku mikropłytek (tabela materiałów).</li>
	<li>Przeliczyć absorbancję na hemoglobinę nmol za pomocą krzywej wzorcowej przygotowanej z hemoglobiny ludzkiej (tabela materiałów) i skorygować rozcieńczenie roztworem lizy RBC.</li>
</ol>
9. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Tutaj wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism. W szeregu badań stwierdzono, że następujące metody statystyczne są skuteczne. 
	UWAGA: Do analizy utraty krwi, czasu krwawienia, ekspozycji, liczby płytek krwi i hematokrytu; Zastosowano test ANOVA Browna-Forsythe'a i Welcha (ponieważ dane były ciągłe, ale bez jednorodności wariancji reszt), stosując test Dunnetta w celu dostosowania do wielokrotnych porównań. Test Pearsona został użyty do zbadania korelacji między czasem krwawienia, utratą krwi i dawkami. Aby określić wartości ED50, do danych dotyczących krwawienia i utraty krwi dopasowano czteroparametrowe równanie odpowiedzi odwrotnej logarytmu (dawki). Aby przeanalizować efekt płci, zastosowano dwukierunkowy test ANOVA, stosując poprawkę Bonferroniego w celu dostosowania do wielokrotnych porównań. Poziom istotności określono jako P < 0,05. Dane są wyświetlane jako ± SEM.</li>
</ol>

Autorzy są lub byli pracownikami i/lub udziałowcami Novo Nordisk A/S w czasie przeprowadzania niniejszego badania.

Ta zoptymalizowana metoda przecięcia żył ogonowych (TVT) ma kilka zalet w porównaniu z metodą przeżycia TVT. Zwierzęta są w pełni znieczulone przez cały czas trwania badania, co ułatwia obsługę myszy i zwiększa dobrostan zwierząt. Ponadto, w przeciwieństwie do modelu przeżycia TVT, obserwacja w nocy nie jest wymagana, a ten zoptymalizowany model oferuje możliwość pomiaru utraty krwi i obserwacji dokładnego czasu krwawienia powyżej 40 minut. Ponadto dłuższe okresy krwawienia u przytomnych zwierząt mogą powodować śmierć w ...

Modele zwierzęce są niezbędne do zrozumienia patogenezy hemofilii oraz opracowania i testowania schematów leczenia i terapii. Mysz z nokautem czynnika VIII (F8-KO) jest szeroko stosowanym modelem do badania hemofilii A1,2. Myszy te podsumowują kluczowe cechy choroby i są szeroko stosowane do opracowywania metod leczenia, takich jak rekombinowane produkty FVIII 3,4,5 i strategie terapii genowej6,7.
Istnieją różne modele urazów krwotocznych do oceny efektów farmakologicznych różnych związków hemostatycznych in vivo. Jednym z tych modeli krzepnięcia jest model przecięcia żyły ogonowej u myszy8,9,10,11,12,13,14, mierząc zdolność myszy hemofilnych do przetrwania wykrwawienia po przecięciu ogona. Ta metoda została wprowadzona ponad cztery dekady temu15 i jest nadal używana9,16,17. Jednak model wykorzystuje przeżycie jako punkt końcowy i wymaga obserwacji zwierząt przez okres do 24 godzin, podczas którego zwierzęta są przytomne, a zatem mogą odczuwać ból i niepokój.
Modele krwawienia o krótszym czasie trwania i w pełnym znieczuleniu zostały opisane wcześniej, takie jak model klipsa do ogona (znany również jako końcówka ogona)8,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28. Niemniej jednak, w celu pełnej normalizacji utraty krwi po prowokacji krwawienia, modele te wymagają dawek związków prokoagulantowych (np. FVIII) znacznie wyższych niż te podawane klinicznie29. Inny model uszkodzenia w znieczuleniu, metoda krwawienia z żyły sapheny, jest wrażliwy na niższe dawki związków prokoagulantowych30, ale wymaga wysokiego poziomu interwencji eksperymentatora, ponieważ skrzepy muszą być często przerywane (w przeciwieństwie do 3 razy w prezentowanym modelu).
Standaryzacja w kierunku wspólnego protokołu do testowania nowych związków prokoagulacyjnych znacznie ułatwiłaby porównywanie danych między laboratoriami31,32,33. W modelach TVT nie ma jeszcze wspólnej zgodności co do badanych punktów końcowych (utrata krwi7,26, czas krwawienia9,34 i wskaźnik przeżycia35,36), a długość eksperymentu różni się między badaniami13.
Naszym głównym celem jest opisanie i scharakteryzowanie zoptymalizowanego modelu o wysokiej odtwarzalności, możliwości badania na żądanie, jak również leczenia profilaktycznego, wrażliwości na interwencję farmakologiczną równoważnej modelowi przeżycia, ale bez użycia śmierci lub śmierci jako punktów końcowych. Aby zmniejszyć ból i niepokój, zwierzęta nie powinny być przytomne podczas krwawienia i należy wdrożyć bardziej etyczny punkt końcowy37.
Modele klipsów do ogona są zazwyczaj przeprowadzane w jednym z dwóch wariantów, albo amputacja końcówki ogona, np. amputacja 1-5 mm18,19,20,21,23,24 lub, w bardziej dotkliwym wariancie, transektowany przy średnicy ogona około 1-3 mm8,22,25. Powoduje to połączone krwawienie tętniczo-żylne, ponieważ żyły boczne i grzbietowe oraz tętnica brzuszna są zwykle przecinane, a ogólnie rzecz biorąc, im większa amputacja, tym mniejsza wrażliwość na związek prokoagulant. Ponadto, ponieważ końcówka ogona jest amputowana, uraz tętniczo-żylny jest odsłonięty bez żadnej przeciwstawnej tkanki; Tak więc, przynajmniej w teorii, jest niepodobny do najczęstszych krwawień hemofilowych.
Jak sama nazwa wskazuje, tylko żyła jest uszkodzona w modelach przecięcia żyły ogonowej, takich jak opisane w tym artykule, co skutkuje wyłącznie krwawieniem żylnym. Ponieważ naczynie nie jest całkowicie przecięte, oczekuje się, że uraz będzie mniejszy niż w modelach amputacji, a tkanka wokół cięcia, do której może przylegać skrzep, zostanie zachowana. Ponadto ciśnienie krwi w żyle jest niższe, a nie w tętnicy. Czynniki te przyczyniają się do zwiększonej czułości w stosunku do modeli amputacji, tak że normalizację krwawienia można osiągnąć za pomocą klinicznie istotnych dawek terapii zastępczej, np. rFVIII w hemofilii A, co jest przydatne do oceny wielkości i trwałości efektów leczenia prokoagulantem26,38,39.

<table><tbody><tr><td>#11 Ostrze skalpela</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>15 mL probówki wirówkowe</td><td>Greiner Bio-One, Austria</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>igłami 30 G podłączonymi do 300 &mikro; Precyzyjne strzykawki (insulinowe) L do dozowania</td><td>Strzykawka insulinowa BD Micro-Fine + U-100</td><td>320830</td><td></td></tr><tr><td>Advate</td><td>Takeda, Japonia</td><td></td><td>Rekombinowany czynnik VIII terapia zastępcza (rFVIII)</td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem 70% etanolu</td><td>Hartmann, Soft-Zellin</td><td>999 979</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szablon do cięcia (stal nierdzewna)</td><td>Wyprodukowany samodzielnie, zapraszamy do kontaktu z autorami w celu uzyskania dokładnych rysunków</td><td></td><td>Rysunek uzupełniający 2: Specyfikacje rozmiarów: 20 mm x 40 mm x 10 mm (dł. x szer. x wys.). Rufa: głębokość 3 mm i szerokość 3 mm; promień 1,5 mm</td></tr><tr><td>Roztwór lizujący erytrocyty (RBC)</td><td>Lysebio, ABX Diagnostics</td><td>906012</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator hematologiczny</td><td>Sysmex</td><td>CT-2000iv</td><td></td></tr><tr><td>Lampa grzewcza na stojaku</td><td>Phillips</td><td>IR250</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza z termostatem</td><td>CMA</td><td>model 150</td><td></td></tr><tr><td>Wzorce i kontrole hemoglobiny - 8,81 mmol / l zależne od partii</td><td>HemoCue, duński</td><td>kalibrator HemoCue, 707037</td><td>Wzorce i kontrole są wykonane z 2 różnych szklanek kalibratora HemoCue. Wartość określa się w odniesieniu do Międzynarodowej Metody Referencyjnej dla hemoglobiny (ICSH).</td></tr><tr><td>System anestezjologiczny z izofluoranem w komplecie z rurkami, maskami i skrzynką indukcyjną</td><td>Sigma Delta Dameca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Lupa ze światłami</td><td>Eschenbach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szablon pomiarowy (aluminium)</td><td>Własnej produkcji, zapraszamy do kontaktu z autorami w celu uzyskania dokładnych rysunków</td><td></td><td>Rysunek uzupełniający 1: Specyfikacje rozmiarów: 20 mm x 40 mm x 10 mm (dł. x szer. x wys.). Rufa: głębokość 2,5 mm i szerokość 2,5 mm; promień 1,25 mm</td></tr><tr><td>Mikropipety + końcówki</td><td>Fotometr Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices Corporation, CA, USA</td> Fotometr <td></td><td>SpectraMax 340</td></tr><tr><td>Prism Software</td><td>GraphPad, San Diego, CA, USA</td><td>Wersja 9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,9% NaCl</td><td>Fresenius Kabi, Szwecja</td><td>883264</td><td></td></tr><tr><td>Specjalny blok znacznika ogona do cięcia</td><td></td> <td>ogona TVT</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt</td><td></td><td></td><td></td>tylny</tr><tr><td>Próżniowe odsysanie cieczy</td><td>Vacusafe comfort, IBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna i termostat</td><td>TYP 3/8 Julabo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią a w pełni znieczuloną

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

Modele krwawienia z ogona są ważnymi narzędziami w badaniach nad hemofilią, szczególnie do oceny efektów prokoagulantu. Model przeżycia przecięcia żyły ogonowej (TVT) jest preferowany w wielu sytuacjach ze względu na wrażliwość na klinicznie istotne dawki FVIII, podczas gdy inne uznane modele, takie jak model klipsa ogonowego, wymagają wyższych poziomów związków prokoagulantowych. Aby uniknąć wykorzystywania przeżycia jako punktu końcowego, opracowaliśmy model TVT, ustalając utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe i pełne znieczulenie podczas całego eksperymentu. Krótko mówiąc, znieczulone myszy umieszcza się z ogonem zanurzonym w roztworze soli fizjologicznej w temperaturze (37°C) i podaje się im badany związek w prawej bocznej żyle ogonowej. Po 5 minutach lewa boczna żyła ogonowa jest przecięta za pomocą szablonu, ogon jest zwracany do soli fizjologicznej, a wszystkie epizody krwawienia są monitorowane i rejestrowane przez 40 minut podczas pobierania krwi. Jeśli po 10 minutach, 20 lub 30 minutach od urazu nie wystąpi krwawienie, skrzep jest delikatnie usuwany, dwukrotnie przecierając ranę mokrym gazikiem. Po 40 minutach utratę krwi określa się ilościowo na podstawie ilości hemoglobiny wprowadzonej do soli fizjologicznej. Ta szybka i stosunkowo prosta procedura skutkuje stałymi i powtarzalnymi krwawieniami. W porównaniu z modelem przeżycia TVT zastosowano w nim bardziej humanitarną procedurę bez uszczerbku dla wrażliwości na interwencję farmakologiczną. Co więcej, możliwe jest użycie obu płci, zmniejszając całkowitą liczbę zwierząt, które muszą być hodowane, zgodnie z zasadami 3R. Potencjalnym ograniczeniem w modelach krwawienia jest stochastyczny charakter hemostazy, który może zmniejszyć odtwarzalność modelu. Aby temu przeciwdziałać, ręczne rozbijanie skrzepu zapewnia, że skrzep jest kwestionowany podczas monitorowania, zapobiegając zatrzymaniu krwawienia przez hemostazę pierwotną (płytkową). To uzupełnienie katalogu modeli urazów krwotocznych daje możliwość scharakteryzowania efektów prokoagulacji w ustandaryzowany i humanitarny sposób.

Aby ocenić przydatność zoptymalizowanego modelu, przeprowadzono badanie na myszach F8-KO (tło genetyczne C57BL), którym podano dostępną komercyjnie terapię zastępczą z użyciem rekombinowanego czynnika VIII (rFVIII); przetestowano cztery różne dawki: 1 IU/kg, 5 IU/kg, 10 IU/kg oraz 20 IU/kg. Ponadto zbadano odpowiadającą im kontrolę nośnika (negatywną) u myszy F8-KO oraz grupę typu dzikiego (WT) z wykorzystaniem myszy C57BL jako grupy kontrolnej pozytywnej, aby ocenić zakres odpowiedzi w modelu.
<p class="jove_content...

Wyrafinowany model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej (TVT) u znieczulonych myszy jest czułą metodą in vivo do oceny krwawienia hemofilowego. Ten zoptymalizowany model krwawienia TVT wykorzystuje utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, udoskonalając inne modele i unikając śmierci jako punkt końcowy.

Model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczuloną

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

Modele krwawienia z ogona mogą być ważnymi narzędziami do oceny efektów farmakologicznych związków hemostatycznych in vivo, aby zapewnić odtwarzalność między eksperymentami. W porównaniu z innymi wrażliwymi modelami krwawienia, nasz model wykorzystuje utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, a nie przeżycie. Ponadto model jest wykonywany w znieczuleniu, co zmniejsza ból i niepokój zwierząt.Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach przedklinicznych hemofilii i innych zaburzeń krzepnięcia, ponieważ mierzy zdolność krwi do krzepnięcia i zatrzymywania krwawienia po urazie. Szeroko korzystaliśmy z tego modelu, testując związki prokoagulacyjne w naszej pracy nad opracowaniem nowych terapii hemofilii przy użyciu myszy z hemofilią A. Jednak inne hemofilne szczepy myszy lub myszy, u których hemofilia jest indukowana przeciwciałem anty-czynnika VIII, mogą być również stosowane.Eksperyment zademonstrują Sarah i Dennis, którzy są ekspertami technicznymi w moim laboratorium. Po znieczuleniu myszy umieść ją na płycie grzewczej i upewnij się, że nos znajduje się w stożku nosowym. Zastosuj odpowiednią maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.Oznacz ogon o średnicy 2,5 milimetra za pomocą bloku znaku ogona, uważając, aby nie wcisnąć ogona na siłę w szczelinę i upewniając się, że dobrze przylega. Następnie umieść ogon w probówce z solą fizjologiczną na co najmniej pięć minut, aby zapewnić ciepłą żyłę ogonową, która jest optymalna do dożylnego dawkowania. W razie potrzeby dożylne dawkowanie można wykonać po pięciu minutach.Następnie umieść plastikową osłonę na myszy, aby zmniejszyć straty ciepła. Pozostawić ogony zanurzone na pięć minut po podaniu roztworu testowego, a następnie przeprowadzić przecięcie żyły ogonowej, umieszczając ogon w bloku tnącym i obracając go o 90 stopni, aby odsłonić żyłę. Wykonaj nacięcie po przeciwnej stronie niż ta, po której dozowano roztwór badany.Przeciągnij ostrze skalpela numer 11 przez szczelinę bloku tnącego, trzymając za ogon, aby wywołać krwawienie. Następnie natychmiast włóż ogon do soli fizjologicznej i zresetuj stoper. Krwawienie powinno być widoczne od razu.Zanurzenie ogona w soli fizjologicznej jest ważne dla stałego krwawienia, ponieważ szybko zatrzyma się na wolnym powietrzu. Obserwuj krwawienie i przez 40 minut zapisuj początek i koniec krwawienia na papierze z notacją przepływu krwi. Zdyskwalifikuj i wymień mysz, jeśli pierwotne krwawienie nie ustanie w ciągu trzech minut po wykonaniu cięcia, co może wskazywać, że cięcie jest zbyt głębokie lub że mysz ma niedobór pierwotnej hemostazy.Rzuć wyzwanie przecięciu ogona, jeśli nie ma krwawienia, 10, 20 i 30 minut po urazie. Za pomocą wacika nasączonego gazą i ciepłej soli fizjologicznej podnieś ogon z soli fizjologicznej i delikatnie, ale stanowczo przetrzyj go dwukrotnie mokrą gazą w kierunku dystalnym nad nacięciem ogona. Po każdym wyzwaniu natychmiast zanurz ogon w rurce z solą fizjologiczną.Po zakończeniu eksperymentu usuń ogon z soli fizjologicznej, w razie potrzeby zbierz próbki krwi i poddaj myszy eutanazji, nadal będąc w pełnej narkozie. Odwirować 15-mililitrowe probówki do pobierania krwi z solą fizjologiczną w temperaturze 4 000 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant z probówek.Zawiesić osad w dwóch mililitrach roztworu lizującego erytrocyty. Następnie rozcieńczyć go do 12 dodatkowych mililitrów roztworu lizy, aż osiągnie jasny kolor kawy. Zwróć uwagę na całkowitą objętość i przenieś dwa mililitry rozcieńczenia do probówki z hemoglobiną.Wstaw do lodówki do czasu analizy hemoglobiny. Zaobserwowano znaczące zmniejszenie utraty krwi w grupach leczonych rekombinowanym czynnikiem krzepnięcia VIII przy użyciu zoptymalizowanego protokołu. Dawka 20 jednostek międzynarodowych na kilogram całkowicie znormalizowała krwawienie, a 10 j.m. na kilogram spowodowało znaczący efekt, zmniejszając utratę krwi prawie do górnej granicy zakresu typu dzikiego.Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku krwawienia. Zmniejszenie zaobserwowano w grupach 5, 10 i 20 IU na kilogram, całkowicie normalizując się w grupie 20 IU na kilogram. U myszy typu dzikiego całkowita utrata krwi wahała się od 200 do 840 nanomoli hemoglobiny, a u myszy z nośnikiem od 5 300 do 7 100 nanomoli hemoglobiny.Średnie krwawienie wynosiło 5 200 nanomoli u myszy leczonych podłożem i 720 nanomoli w grupie 20 IU na kilogram. Czas krwawienia myszy typu dzikiego wynosił od jednej do dziewięciu minut, a poziomy dawek 10 i 20 j.m. na kilogram skracały czas krwawienia do tego zakresu. W połączonych danych zaobserwowano silną korelację między utratą krwi a czasem krwawienia.Wszystkie zarejestrowane epizody krwawienia zostały wykreślone w celu zapewnienia wizualizacji długości i liczby krwawień doświadczanych dla każdej myszy z osobna. Należy zauważyć, że w grupie otrzymującej podłoże, po drugim prowokacji, większość zwierząt kontynuuje krwawienie do końca eksperymentu. Pomiar stężenia czynnika VIII w osoczu potwierdził, że obserwowany efekt w zmniejszaniu utraty krwi i czasu krwawienia był zależny od stężenia rekombinowanego czynnika VIII.Liczba płytek krwi nie była zauważalnie zaburzona, a poziomy hematokrytu mieściły się w normalnym zakresie u zwierząt otrzymujących umiarkowane i wyższe dawki rekombinowanego czynnika VIII, ale znacznie niższe u zwierząt, które intensywnie krwawiły, np. w grupie otrzymującej podłoże i jedną j.m. na kilogram. U zwierząt doświadczających obfitego krwawienia może wystąpić niewielki wpływ na morfologię krwi, zwłaszcza hemoglobinę całkowitą lub hematokryt. Aby ocenić wpływ płci w tym zoptymalizowanym modelu, zarówno wyniki utraty krwi, jak i czasu krwawienia poddano dwukierunkowej analizie ANOVA, z płcią i dawką jako czynnikami.Wyniki te wskazują, że odpowiedź na leczenie nie różniła się u obu płci. Prawidłowe oznakowanie ogona i wykonanie cięcia są niezbędnymi krokami zapewniającymi niezawodność i powtarzalność techniki, podobnie jak wyzwanie, jeśli nie ma krwawienia. Ponadto szczególnie istotna jest dobra indukcja znieczulenia i utrzymanie temperatury ciała zwierzęcia.Wykorzystaliśmy również ten model do zbadania zatrzymania ustalonych krwawień w warunkach bardziej zbliżonych do żądania, poprzez leczenie czynnikiem VIIA 10 minut po wywołaniu krwawienia.

tail-vein-transection-bleeding-model-fully-anesthetized-hemophilia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Model wstrząsu krwotocznego jest wiarygodnym i powtarzalnym narzędziem ułatwiającym identyfikację i zrozumienie kaskad sygnalizacyjnych związanych ze stanem zapalnym i uszkodzeniem narządów końcowych po urazach. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis krok po kroku aspektów chirurgicznych i mechanicznych związanych z procedurą eksperymentalną wstrząsu krwotocznego u myszy.

Stała objętość czy stałe ciśnienie: mysi model wstrząsu krwotocznego

Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.

Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy

Klinicznie istotne modele zwierzęce krwotoku wewnątrzczaszkowego (ICH) są niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat udaru krwotocznego oraz do badania nowych strategii terapeutycznych. W niniejszym badaniu opisujemy i oceniamy dwa modele ICH, w których stosuje się jednostronne wstrzyknięcia autologicznej krwi pełnej lub bakteryjnej kolagenazy do jąder podstawy (ciała prążkowanego) myszy.

Modelowanie krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy: wstrzykiwanie krwi autologicznej lub bakteryjnej kolagenazy

Opisano standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego za pomocą wewnątrzświetlnego koła perforacji Willisa. Perforacja naczynia i krwawienie podpajęczynówkowe są monitorowane za pomocą monitorowania ciśnienia śródczaszkowego. Ponadto rejestrowane i kontrolowane są różne parametry życiowe w celu utrzymania warunków fizjologicznych.

Mysi model krwotoku podpajęczynówkowego

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

Niekontrolowany krwotok, ważna przyczyna śmiertelności wśród pacjentów po urazach, może być modelowany za pomocą standardowego uszkodzenia wątroby w modelu mysim. Model ten skutkuje konsekwentną utratą krwi, przeżywalnością i pozwala na testowanie środków hemostatycznych. Ten artykuł zawiera krok po kroku proces wykonywania tego cennego modelu.

Niekontrolowany wstrząs krwotoczny modelowany za pomocą uszkodzenia wątroby u myszy z monitorowaniem hemodynamicznym w czasie rzeczywistym

Opisujemy tutaj zwężenie w żyle głównej dolnej jako mysi model zakrzepicy żył głębokich. Model ten podsumowuje ograniczenie przepływu krwi, jeden z głównych czynników wywołujących zakrzepicę żylną u ludzi.

Zwężenie żyły głównej dolnej: mysi model zakrzepicy żył głębokich

Opisaliśmy w tym protokole standaryzowany model myszy z krwotokiem podpajęczynówkowym (SAH) poprzez podwójne wstrzyknięcie autologicznej krwi pełnej do cisterna magna. Wysoki stopień standaryzacji procedury podwójnej iniekcji stanowi model SAH od średniego do ostrego ze względnym bezpieczeństwem w odniesieniu do śmiertelności.

Podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do Cisterna Magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego

Ten artykuł ma na celu przedstawienie zoptymalizowanej metody oceny zakrzepicy żylnej w modelu raka myszy, przy użyciu klipsów naczyniowych do uzyskania podwiązania żylnego. Optymalizacja minimalizuje zmienność pomiarów związanych z zakrzepicą i zwiększa znaczenie dla zakrzepicy żylnej związanej z rakiem u ludzi.

Test zakrzepicy żylnej w mysim modelu raka

To badanie przedstawia hybrydowy model ilościowy krwotoku ze skrzyżowania pachowego u świń, poprawiając ocenę przedszpitalnej interwencji hemostatycznej.

Nowy hybrydowy model oceny ilościowej krwotoku ze skrzyżowania pachowego u świń

Celem tego badania jest opracowanie skutecznej metody osiągania hemostazy w tętnicach myszy.

Prosty i skuteczny zabieg na hemostazę w tętnicach myszy

Poznaj model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczulonej. Ta metoda ocenia utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, eliminując śmierć zwierząt.

Model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczuloną

Przeglądaj więcej filmów