Model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczuloną

Modele krwawienia z ogona mogą być ważnymi narzędziami do oceny efektów farmakologicznych związków hemostatycznych in vivo, aby zapewnić odtwarzalność między eksperymentami. W porównaniu z innymi wrażliwymi modelami krwawienia, nasz model wykorzystuje utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, a nie przeżycie. Ponadto model jest wykonywany w znieczuleniu, co zmniejsza ból i niepokój zwierząt.

Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach przedklinicznych hemofilii i innych zaburzeń krzepnięcia, ponieważ mierzy zdolność krwi do krzepnięcia i zatrzymywania krwawienia po urazie. Szeroko korzystaliśmy z tego modelu, testując związki prokoagulacyjne w naszej pracy nad opracowaniem nowych terapii hemofilii przy użyciu myszy z hemofilią A. Jednak inne hemofilne szczepy myszy lub myszy, u których hemofilia jest indukowana przeciwciałem anty-czynnika VIII, mogą być również stosowane.

Eksperyment zademonstrują Sarah i Dennis, którzy są ekspertami technicznymi w moim laboratorium. Po znieczuleniu myszy umieść ją na płycie grzewczej i upewnij się, że nos znajduje się w stożku nosowym. Zastosuj odpowiednią maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.

Oznacz ogon o średnicy 2,5 milimetra za pomocą bloku znaku ogona, uważając, aby nie wcisnąć ogona na siłę w szczelinę i upewniając się, że dobrze przylega. Następnie umieść ogon w probówce z solą fizjologiczną na co najmniej pięć minut, aby zapewnić ciepłą żyłę ogonową, która jest optymalna do dożylnego dawkowania. W razie potrzeby dożylne dawkowanie można wykonać po pięciu minutach.

Następnie umieść plastikową osłonę na myszy, aby zmniejszyć straty ciepła. Pozostawić ogony zanurzone na pięć minut po podaniu roztworu testowego, a następnie przeprowadzić przecięcie żyły ogonowej, umieszczając ogon w bloku tnącym i obracając go o 90 stopni, aby odsłonić żyłę. Wykonaj nacięcie po przeciwnej stronie niż ta, po której dozowano roztwór badany.

Przeciągnij ostrze skalpela numer 11 przez szczelinę bloku tnącego, trzymając za ogon, aby wywołać krwawienie. Następnie natychmiast włóż ogon do soli fizjologicznej i zresetuj stoper. Krwawienie powinno być widoczne od razu.

Zanurzenie ogona w soli fizjologicznej jest ważne dla stałego krwawienia, ponieważ szybko zatrzyma się na wolnym powietrzu. Obserwuj krwawienie i przez 40 minut zapisuj początek i koniec krwawienia na papierze z notacją przepływu krwi. Zdyskwalifikuj i wymień mysz, jeśli pierwotne krwawienie nie ustanie w ciągu trzech minut po wykonaniu cięcia, co może wskazywać, że cięcie jest zbyt głębokie lub że mysz ma niedobór pierwotnej hemostazy.

Rzuć wyzwanie przecięciu ogona, jeśli nie ma krwawienia, 10, 20 i 30 minut po urazie. Za pomocą wacika nasączonego gazą i ciepłej soli fizjologicznej podnieś ogon z soli fizjologicznej i delikatnie, ale stanowczo przetrzyj go dwukrotnie mokrą gazą w kierunku dystalnym nad nacięciem ogona. Po każdym wyzwaniu natychmiast zanurz ogon w rurce z solą fizjologiczną.

Po zakończeniu eksperymentu usuń ogon z soli fizjologicznej, w razie potrzeby zbierz próbki krwi i poddaj myszy eutanazji, nadal będąc w pełnej narkozie. Odwirować 15-mililitrowe probówki do pobierania krwi z solą fizjologiczną w temperaturze 4 000 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant z probówek.

Zawiesić osad w dwóch mililitrach roztworu lizującego erytrocyty. Następnie rozcieńczyć go do 12 dodatkowych mililitrów roztworu lizy, aż osiągnie jasny kolor kawy. Zwróć uwagę na całkowitą objętość i przenieś dwa mililitry rozcieńczenia do probówki z hemoglobiną.

Wstaw do lodówki do czasu analizy hemoglobiny. Zaobserwowano znaczące zmniejszenie utraty krwi w grupach leczonych rekombinowanym czynnikiem krzepnięcia VIII przy użyciu zoptymalizowanego protokołu. Dawka 20 jednostek międzynarodowych na kilogram całkowicie znormalizowała krwawienie, a 10 j.m. na kilogram spowodowało znaczący efekt, zmniejszając utratę krwi prawie do górnej granicy zakresu typu dzikiego.

Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku krwawienia. Zmniejszenie zaobserwowano w grupach 5, 10 i 20 IU na kilogram, całkowicie normalizując się w grupie 20 IU na kilogram. U myszy typu dzikiego całkowita utrata krwi wahała się od 200 do 840 nanomoli hemoglobiny, a u myszy z nośnikiem od 5 300 do 7 100 nanomoli hemoglobiny.

Średnie krwawienie wynosiło 5 200 nanomoli u myszy leczonych podłożem i 720 nanomoli w grupie 20 IU na kilogram. Czas krwawienia myszy typu dzikiego wynosił od jednej do dziewięciu minut, a poziomy dawek 10 i 20 j.m. na kilogram skracały czas krwawienia do tego zakresu. W połączonych danych zaobserwowano silną korelację między utratą krwi a czasem krwawienia.

Wszystkie zarejestrowane epizody krwawienia zostały wykreślone w celu zapewnienia wizualizacji długości i liczby krwawień doświadczanych dla każdej myszy z osobna. Należy zauważyć, że w grupie otrzymującej podłoże, po drugim prowokacji, większość zwierząt kontynuuje krwawienie do końca eksperymentu. Pomiar stężenia czynnika VIII w osoczu potwierdził, że obserwowany efekt w zmniejszaniu utraty krwi i czasu krwawienia był zależny od stężenia rekombinowanego czynnika VIII.

Liczba płytek krwi nie była zauważalnie zaburzona, a poziomy hematokrytu mieściły się w normalnym zakresie u zwierząt otrzymujących umiarkowane i wyższe dawki rekombinowanego czynnika VIII, ale znacznie niższe u zwierząt, które intensywnie krwawiły, np. w grupie otrzymującej podłoże i jedną j.m. na kilogram. U zwierząt doświadczających obfitego krwawienia może wystąpić niewielki wpływ na morfologię krwi, zwłaszcza hemoglobinę całkowitą lub hematokryt. Aby ocenić wpływ płci w tym zoptymalizowanym modelu, zarówno wyniki utraty krwi, jak i czasu krwawienia poddano dwukierunkowej analizie ANOVA, z płcią i dawką jako czynnikami.

Wyniki te wskazują, że odpowiedź na leczenie nie różniła się u obu płci. Prawidłowe oznakowanie ogona i wykonanie cięcia są niezbędnymi krokami zapewniającymi niezawodność i powtarzalność techniki, podobnie jak wyzwanie, jeśli nie ma krwawienia. Ponadto szczególnie istotna jest dobra indukcja znieczulenia i utrzymanie temperatury ciała zwierzęcia.

Wykorzystaliśmy również ten model do zbadania zatrzymania ustalonych krwawień w warunkach bardziej zbliżonych do żądania, poprzez leczenie czynnikiem VIIA 10 minut po wywołaniu krwawienia.