Name: Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Poznaj dwukolorową spektroskopię korelacji krzyżowej FCCS z FRET do badania dynamiki receptorów GPCR w żywych komórkach CHO. Ta metoda umożliwia analizę interakcji białkowych i zmian konformacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, numer projektu 374031971, Projekt INF) dla J. B. i K.G.H.
Dziękujemy Centrum Rudolfa Virchowa za wsparcie finansowe oraz Core Unit Fluorescence Imaging za wsparcie techniczne. Dodatkowo dziękujemy Ashwinowi Balakrishnanowi za dokładną korektę.

1. Protokół eksperymentalny
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki 
	UWAGA: Wysiew i transfekcję komórek należy przeprowadzić w sterylnych warunkach.
	<ol>
		<li>Umieścić oczyszczone szkiełko nakrywkowe na studzience na 6-dołkowej płytce hodowlanej i przemyć trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). 
		UWAGA: Protokół czyszczenia szkiełka nakrywkowego jest szczegółowo opisany w uwadze uzupełniającej 1.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 2 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej czerwień fenolową (uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) i odłożyć płytkę na bok.</li>
		<li>Hodować komórki CHO w tym samym pożywce zawierającej czerwień fenolową w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Umyj komórki 5 ml PBS, aby usunąć martwe komórki.</li>
		<li>Dodaj 2 ml trypsyny i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Rozcieńczyć oderwane komórki 8 ml pożywki zawierającej czerwień fenolową i dokładnie wymieszać pipetując.</li>
		<li>Policz komórki w komorze Neubauera i zasiej nasiona o gęstości 1,5 x 105 komórek/basenik na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe (przygotowanej w kroku 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez 24 godziny, aby osiągnąć około 80% zbieżności.</li>
		<li>Rozcieńczyć 2 μg pożądanego DNA wektora (np. CT-SNAP lub NT-SNAP) i 6 μl odczynnika do transfekcji w dwóch oddzielnych probówkach, z których każda zawiera 500 μl pożywki o zredukowanej surowicy dla każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wymieszać oba roztwory razem, aby otrzymać mieszaninę transfekcji i inkubować ją przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W międzyczasie umyj wysiane komórki CHO raz sterylnym PBS.</li>
		<li>Zastąp PBS 1 ml / studzienkę pożywki wolnej od czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS bez żadnych antybiotyków.</li>
		<li>Dodać kroplami cały 1 ml mieszaniny transfekcji do każdej studzienki i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .</li>
		<li>W celu oznakowania konstruktu SNAP należy rozcieńczyć odpowiedni roztwór podstawowy substratu SNAP w 1 ml pożywki uzupełnionej 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.</li>
		<li>Przemyć transfekowane komórki raz PBS i dodać 1 ml na studzienkę 1 μM roztworu substratu SNAP. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od czerwieni fenolowej i dodaj 2 ml na dołek pożywki bez czerwieni fenolowej. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe wszystkich próbek do komory obrazowania i przemyć buforem obrazowym o pojemności 500 μl. Dodaj bufor obrazowania o pojemności 500 μl przed przejściem do konfiguracji FRET-FCS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary kalibracyjne 
	UWAGA: Zestaw FRET-FCS jest wyposażony w obiektyw wodny z mikroskopem konfokalnym, dwie linie laserowe, system zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC), dwie hybrydowe tuby fotopowielacza (PMT) i dwie fotodiody lawinowe (APD) do zbierania fotonów i oprogramowania do zbierania danych. Bardzo ważne jest, aby wyrównać konfigurację za każdym razem przed pomiarami na żywo komórek. Szczegółowy opis konfiguracji można znaleźć w uwadze uzupełniającej 2. Zarówno lasery, jak i wszystkie detektory (dwa PMT i dwa APD) są zawsze włączone podczas pomiarów, ponieważ wszystkie pomiary muszą być przeprowadzane w identycznych warunkach. Do pomiarów kalibracyjnych należy użyć szkiełka nakrywkowego z tej samej partii, na której wysiano komórki, co zmniejsza zmienność korekcji pierścienia kołnierza.
	<ol>
		<li>Aby wyregulować ostrość, położenie otworka i pierścienia kołnierza, umieść zielony roztwór kalibracyjny 2 nM na szklanym szkiełku nakrywkowym i włącz laser 485 nm i 560 nm. Uruchom laser w trybie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE)16.</li>
		<li>Skoncentruj się na roztworze i dostosuj położenie pierścienia otworkowego i kołnierza tak, aby uzyskać najwyższą szybkość zliczania i najmniejszą objętość konfokalną, aby uzyskać maksymalną jasność molekularną.</li>
		<li>Powtórzyć ten proces dla kanałów czerwonych z czerwonym roztworem kalibracyjnym 10 nM i mieszaniną zarówno zielonego, jak i czerwonego roztworu kalibracyjnego.</li>
		<li>Umieść roztwór DNA 10 nM na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj ognisko, otwór i położenie pierścienia kołnierza tak, aby korelacja krzyżowa między zielonymi i czerwonymi kanałami detekcji była najwyższa, tj. wykazywała najwyższą amplitudę. 
		UWAGA: Kroki 1.2.1 i 1.2.4 mogą wymagać powtórzenia tam iz powrotem, aby znaleźć optymalne wyrównanie. Wykonaj 3-5 pomiarów z każdego roztworu kalibracyjnego przez 30 s - 120 s po optymalnym ustawieniu ostrości, otworka i pierścienia kołnierza dla zielonego i czerwonego kanału detekcji oraz objętości nakładania się konfokalnego.</li>
		<li>Zmierz kroplę ddH2O, pożywkę do obrazowania i nietransfekowaną komórkę 3-5 razy każdy przez 30 s - 120 s, aby określić szybkość zliczania tła.</li>
		<li>Zbierz funkcję odpowiedzi przyrządu z 3-5 pomiarami przez 30 s - 120 s. Jest to opcjonalne, ale wysoce zalecane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary żywych komórek
	<ol>
		<li>Znajdź odpowiednią komórkę, oświetlając ją lampą rtęciową i obserwując przez okular. 
		UWAGA: Odpowiednie komórki są żywe, wykazując typową morfologię odpowiedniej przylegającej linii komórkowej. Fluorescencja interesującego nas białka, w tym przypadku receptora powierzchniowego, jest widoczna na całej powierzchni. Mniej jasne komórki są bardziej odpowiednie niż jaśniejsze ze względu na lepszy kontrast w FCS, gdy w centrum uwagi znajduje się niewielka liczba cząsteczek.</li>
		<li>Włącz oba lasery w trybie PIE i skup się na membranie, patrząc na maksymalne zliczenia na sekundę. 
		UWAGA: Może być konieczne zmniejszenie mocy lasera w przypadku próbek ogniw (mniej niż 5 μW przy obiektywie). Zależy to od użytych fluoroforów i konfiguracji.</li>
		<li>Obserwuj krzywe automatycznej i krzyżowej korelacji eGFP lub oznakowanego znacznika SNAP przymocowanego do β2AR w podglądzie online oprogramowania do zbierania danych i zbierz kilka krótkich pomiarów (~2 -10) z czasem akwizycji od 60 do 180 s. 
		UWAGA: Nie pobudzaj komórek przez długi czas w sposób ciągły, ponieważ fluorofory mogą wybielić. Będzie to jednak zależeć od jasności każdej komórki, długości pomiarów i liczby pomiarów, które można w sumie wykonać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksport danych
	<ol>
		<li>Eksportuj krzywe korelacji, G(tc) i współczynniki zliczania, CR, ze wszystkich pomiarów.</li>
		<li>Zadbaj o poprawne zdefiniowanie okien czasowych "podpowiedzi" i "opóźnienia" oraz użyj opcji "bramkowania mikroczasowego" w oprogramowaniu do korelacji danych. 
		UWAGA: W sumie wymagane są trzy różne korelacje: (1) autokorelacja kanału zielonego w oknie czasowym monitu (ACFgp), (2) autokorelacja kanałów czerwonych w oknie czasowym opóźnienia (ACFrd) i wreszcie (3) korelacja krzyżowa sygnału kanału zielonego w oknie czasowym monitu z sygnałem kanału czerwonego w oknie czasowym opóźnienia (CCFPIE). Eksport danych jest pokazany krok po kroku dla różnych programów w uwadze dodatkowej 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary kalibracyjne
	<ol>
		<li>Użyj funkcji autokorelacji roztworów fluoroforu zielonego (ACFgp) i czerwonego (ACFrd) i dopasuj je do modelu dyfuzji 3D z dodatkowym terminem trypletowym, jeśli jest to wymagane (równanie 1), aby skalibrować kształt i rozmiar objętości detekcji konfokalnej dla dwóch używanych kanałów kolorów: 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> równanie 1 
		Tutaj b jest linią bazową krzywej, N liczbą cząsteczek w ognisku, tD czasem dyfuzji (w ms), a s = z0/w0 współczynnikiem kształtu konfokalnego elementu objętościowego. Mruganie trypletowe lub inna fotofizyka jest opisana przez jej amplitudę R i czas relaksacji tR. 
		UWAGA: Wszystkie zmienne i symbole używane w protokole są wymienione w Tabeli 1.</li>
		<li>Użyj znanych współczynników dyfuzji D dla green26 i czerwonego standardu kalibracji27 oraz otrzymanych współczynników kształtu szielonego i s czerwonego, aby określić wymiary (szerokość w0 i wysokość z0) oraz objętość Veff konfokalnego elementu objętościowego (równanie 2a-c). 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg"> eq. 2a 
		<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg"> równanie 2b 
		<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg"> eq. 2c 
		UWAGA: Szablony do obliczania parametru kalibracji są dostarczane jako pliki uzupełniające (S7).</li>
		<li>Obliczyć α spektralny przesłuchu sygnału zielonej fluorescencji (zebranego w kanałach 0 i 2) do czerwonych kanałów detekcji (kanał numer 1 i 3) jako stosunek sygnałów z korekcją tła (BG) (równanie 3). 
		<img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> 
		Równanie 3</li>
		<li>Określić bezpośrednie wzbudzenie δ fluoroforowego akceptora przez długość fali wzbudzenia donora przez stosunek szybkości zliczania z korekcją tła pomiarów kalibracji czerwieni w "szybkim" oknie czasowym (wzbudzenie zielonym laserem) do szybkości zliczania skorygowanej o tło w oknie czasowym "opóźnienia" (wzbudzenie czerwonym laserem) (równanie 4). 
		<img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> 
		równanie 4</li>
		<li>Obliczyć jasność molekularną B zarówno zielonego, jak i czerwonego fluoroforu (równanie 5a-b) na podstawie współczynników zliczania skorygowanych o tło i uzyskanej liczby cząsteczek w ognisku, N, z dopasowania dyfuzyjnego 3D (równanie 1): 
		<img alt="Równanie 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg"> eq. 5a 
		<img alt="Równanie 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg"> równanie 5b</li>
		<li>Dopasuj zarówno ACFgp, jak i ACFrd, a także CCFPIE podwójnie znakowanego DNA do modelu dyfuzji 3D (równanie 1). Uzyskane współczynniki kształtu, szielony i sczerwony, należy utrzymywać na stałym poziomie odpowiednio dla ACFgp i ACFrd. Współczynnik kształtu dla CCF PIE, sPIE, znajduje się zwykle pomiędzy tymi dwiema wartościami. 
		UWAGA: W idealnej konfiguracji zarówno Veff, zielony, jak i Veff, czerwony miałyby ten sam rozmiar i idealnie na siebie zachodziłyby.</li>
		<li>Określić amplitudę przy zerowym czasie korelacji, G0(tc), na podstawie znalezionych wartości pozornej liczby cząsteczek w ognisku (Nzielony, Nczerwony i NPIE).</li>
		<li>Obliczyć stosunek amplitudy rGR i rRG dla próbki ze 100% kodyfuzją fluoroforów zielonych i czerwonych (równanie 6). Należy pamiętać, że NPIE nie odzwierciedla liczby podwójnie znakowanych cząsteczek w ognisku, ale odzwierciedla tylko 1/G0(tc). 
		<img alt="Równanie 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg"> i <img alt="Równanie 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> równanie 6</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymenty z żywymi komórkami
	<ol>
		<li>W przypadku konstrukcji z pojedynczym etykietą dopasuj próbki komórek do odpowiedniego modelu. W przypadku pokazanego receptora błonowego dyfuzja zachodzi w sposób bimodalny z krótkim i długim czasem dyfuzji. Dodatkowo należy wziąć pod uwagę fotofizykę i mruganie fluoroforów: 
		<img alt="Równanie 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> równanie 7 
		Tutaj td1 i td2 to dwa wymagane czasy dyfuzji, a1 to ułamek pierwszego czasu dyfuzji. 
		UWAGA: W przeciwieństwie do pomiarów kalibracyjnych, w których wolne barwniki i nici DNA swobodnie dyfundują we wszystkich kierunkach, receptor błonowy wykazuje tylko dyfuzję 2D wzdłuż błon komórkowych. Ta różnica między dyfuzją 3D i 2D znajduje odzwierciedlenie w zmodyfikowanym współczynniku dyfuzji (porównaj równanie 1), gdzie t D w przypadku 2D nie zależy od współczynnika kształtu s konfokalnego elementu objętościowego.</li>
		<li>Obliczyć stężenie c białek znakowanych na zielono lub czerwono z odpowiednich N i Veff, korzystając z podstawowej matematyki (równanie 8): 
		<img alt="Równanie 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg"> eq. 8 
		gdzie N A = liczba Avogadro</li>
		<li>Dla N-końcowej etykiety SNAP i wewnątrzkomórkowego eGFP dopasuj dwie autokorelacje (ACFgp i ACFrd) podwójnie znakowanej próbki przy użyciu tego samego modelu, co dla jednoznakowanych konstruktów dla ACF (równanie 7) i CCFPIE przy użyciu bimodalnego modelu dyfuzji (równanie 9): 
		<img alt="Równanie 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg"> eq. 9 
		UWAGA: Aby uzyskać globalny opis systemu, wszystkie trzy krzywe muszą być dopasowane razem: Składnik dyfuzji jest identyczny dla wszystkich trzech krzywych, a jedyną różnicą jest składnik relaksacji dla CCF PIE. Ponieważ fotofizyka dwóch fluoroforów zwykle nie jest ze sobą powiązana, nie jest wymagany żaden termin korelacji. Ten brak warunków relaksacji skutkuje płaskim CCF PIE w krótkich czasach korelacji. Jednak przesłuchy i bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez fluorofor donorowy mogą wykazywać fałszywie dodatnie amplitudy i powinny być dokładnie sprawdzone pod kątem użycia pomiarów kalibracyjnych.</li>
		<li>Obliczyć stężenie c białek znakowanych na zielono lub czerwono z odpowiednich N i Veff, stosując równanie 8.</li>
		<li>Oszacować frakcję lub stężenie, cGR lub cRG, oddziałujących na siebie białek znakowanych na zielono i czerwono z próbek komórkowych, stosując współczynniki korygujące otrzymane z próbek DNA, współczynniki amplitudy rGR i rRG próbki komórkowej oraz ich odpowiednie otrzymane stężenia (równanie 10). 
		<img alt="Równanie 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> i <img alt="Równanie 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>W przypadku C-końcowej etykiety SNAP i wewnątrzkomórkowego eGFP dopasuj dwie autokorelacje (ACFgp i ACFrd) próbki FRET jako próbki znakowane pojedynczo (równanie 7) i CCFFRET do bimodalnego modelu dyfuzji zawierającego człon antykorelacji (równanie 11) 
		<img alt="Równanie 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> równanie 11 
		gdzief odzwierciedla amplitudę całkowitej antykorelacji, aR i tR odpowiednią amplitudę i czas relaksacji. 
		UWAGA: W przypadku antyskorelowanych zmian fluorescencji spowodowanych FRET, może być wymagany jeden lub kilka warunków antykorelacji (równanie 11), co skutkuje "spadkiem" CCF FRET w niskich czasach korelacji zbiegających się ze wzrostem dwóch autokorelacji (ACFgp i ACFrd). Należy jednak pamiętać, że fotofizyka, taka jak mruganie trypletowe, może maskować termin antykorelacji poprzez tłumienie antykorelacji wywołanej przez FRET. Wspólna analiza uzupełniona o filtrowane metody FCS może pomóc w zdemaskowaniu terminu antykorelacji. Ponadto należy wykluczyć artefakty techniczne wynikające z martwych czasów w elektronice liczącej w zakresie nanosekund16. Bardziej szczegółowa procedura krok po kroku, jak przeprowadzić analizę w ChiSurf28 oraz szablony do obliczania objętości konfokalnej lub jasności molekularnej są dostępne w repozytorium Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) oraz jako pliki uzupełniające (uwaga uzupełniająca 4 i uwaga uzupełniająca 6). Dodatkowo można tam znaleźć skrypty Pythona do wsadowego eksportu danych pozyskanych za pomocą oprogramowania Symphotime w formacie .ptu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Spektroskopia fluorescencyjna jest jedną z głównych metod ilościowego określania dynamiki białek i interakcji białko-białko przy minimalnych zakłóceniach w kontekście komórkowym. Konfokalna spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) jest jedną z potężnych metod analizy dynamiki molekularnej, ponieważ jest wrażliwa na pojedyncze cząsteczki, wysoce selektywna i kompatybilna z żywymi komórkami1. W porównaniu z innymi podejściami zorientowanymi na dynamikę, FCS ma szerszy mierzalny zakres czasowy obejmujący od ~ ns do ~ s, co najważniejsze, obejmujący szybkie skale czasowe, które często są niedostępne dla metod opartych na obrazowaniu. Co więcej, zapewnia również selektywność przestrzenną, dzięki czemu można łatwo odróżnić dynamikę molekularną błony, cytoplazmy i jądra 2. W ten sposób mruganie molekularne, średnie stężenie lokalne i współczynnik dyfuzji można analizować ilościowo za pomocą FCS. Dynamika międzycząsteczkowa, taka jak wiązanie, staje się łatwo dostępna podczas badania kodyfuzji dwóch gatunków molekularnych w analizie spektroskopii fluorescencji krzyżowej korelacji krzyżowej (FCCS)3,4,5 w podejściu dwukolorowym.
Główną podstawową zasadą spektroskopii korelacji jest analiza statystyczna fluktuacji intensywności emitowanych przez fluorescencyjnie znakowane biomolekuły dyfundujące do i z ogniska laserowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wynikowe funkcje korelacji automatycznej lub krzyżowej mogą być następnie dalej analizowane przez dopasowanie krzywej, aby ostatecznie wyprowadzić interesujące stałe szybkości. Innymi słowy, metody statystyczne FCS i FCCS nie dostarczają śladów pojedynczych cząsteczek, jak w przypadku śledzenia pojedynczych cząstek, ale dynamiczny wzór lub "odcisk palca" badanej próbki o wysokiej rozdzielczości czasowej. W połączeniu z rezonansowym transferem energii Förstera (FRET), dynamika wewnątrzcząsteczkowa, taka jak zmiany konformacyjne, może być monitorowana w tym samym czasie we wspólnym układzie konfokalnym5,6. FRET sonduje odległość dwóch fluoroforów i jest często określany jako molekularny "nanolinijka". Transfer energii zachodzi tylko wtedy, gdy cząsteczki znajdują się w bliskim sąsiedztwie (< 10 nm), widmo emisyjne donora znacznie pokrywa się z widmem absorpcyjnym cząsteczki akceptora, a orientacja dipola donora i akceptora jest (wystarczająco) równoległa. W ten sposób połączenie FRET i FCCS zapewnia technikę o bardzo wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Gdy wymagana jest selektywność przestrzenna, czułość, a także kompatybilność z żywymi komórkami, FRET-FCCS ma oczywistą przewagę nad innymi metodami, takimi jak kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC)7, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)8, lub magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)9,10 do pomiaru dynamiki i interakcji białek.
Pomimo możliwości i obietnicy dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (dc-FCCS), wykonywanie DC-FCCS w żywych komórkach jest technicznie trudne ze względu na widmowe przesłuchy lub przesłuchy między kanałami3,4, różnica w objętościach konfokalnych wynikająca z widmowo odrębnych linii laserowych3,4,11, sygnał tła i szum lub ograniczona fotostabilność próbek12,13,14,15. Wprowadzenie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE) do FCCS było ważną modyfikacją mającą na celu czasowe rozprzęgnięcie różnych wzbudzeń laserowych w celu zmniejszenia przesłuchów spektralnych między kanałami16. Inne metody korekcji przeciwdziałające przebijaniu widma17,18,19 i poprawki tła również zostały dobrze zaakceptowane17,18,19. Aby uzyskać szczegółowe informacje i podstawy dotyczące FCS, PIE lub FRET, czytelnik jest odsyłany do następujących odniesień2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Tutaj przedstawiono wszystkie niezbędne eksperymenty kalibracyjne i analizy wraz z wynikami eksperymentalnymi prototypowego receptora sprzężonego z białkiem G, receptora 2-adrenergicznego (β2AR), β dla trzech różnych scenariuszy: (1) jednoznakowane cząsteczki posiadające "zielony" (eGFP) lub "czerwony" (etykietowanie oparte na znacznikach SNAP)25 fluorofor; (2) podwójnie znakowany konstrukt, który zawiera N-końcowy znacznik SNAP i wewnątrzkomórkowy eGFP (NT-SNAP) [w tym przypadku obie etykiety znajdują się przy tym samym białku. W związku z tym oczekuje się 100% kodyfuzji]; oraz (3) podwójnie znakowaną próbkę, w której oba fluorofory znajdują się po tej samej stronie błony komórkowej (CT-SNAP). Zawiera C-końcowy znacznik SNAP i wewnątrzkomórkowy eGFP. W tym przypadku obie etykiety są na tym samym białku z oczekiwaną 100% kodyfuzją. Ponieważ obie etykiety znajdują się bardzo blisko siebie, po tej samej stronie błony komórkowej, wykazuje to potencjał do obserwowania FRET i zachowania antyskorelowanego. Wszystkie konstrukty zostały transfekowane w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO), a następnie znakowane czerwonym substratem fluorescencyjnym, który jest nieprzepuszczalny dla konstrukcji NT-SNAP i przepuszczalny dla membrany dla konstruktu CT-SNAP. Wreszcie, symulowane dane ilustrują wpływ parametrów eksperymentalnych na antykorelację indukowaną przez FRET oraz wpływ oddziaływań białko-białko na amplitudę kodyfuzji.
Tak więc, ten protokół dostarcza kompletnego przewodnika do przeprowadzania połączonego FRET-FCCS w żywych komórkach, aby zrozumieć dynamikę białek i interakcje białko-białko, jednocześnie uświadamiając techniczne/fizyczne artefakty, wyzwania i możliwe rozwiązania.

<table><tbody><tr><td>1x Teleskop w konfiguracji 4f z pięcioma obiektywami</td><td>Qioptiq, Rhyl, UK</td><td>G063126000</td><td>Optics</td></tr><tr><td>2x Filtry pasmowo-przepustowe Brightline</td><td>AHF, T&uuml; bingen, Niemcy</td><td>HC 525/50 i HC 600/52</td><td>Filtr</td></tr><tr><td>2x Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>AHF, T&uuml; bingen, Niemcy</td><td>HC BS F38-573</td><td>Filtr</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka hodowlana Nunc</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>140675</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (zielony wzorzec kalibracji)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>Odczynnik A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (czerwony wzorzec kalibracji)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>Odczynnik A20003</td><td></td></tr><tr><td>Stolik ASI PZ-2000 XYZ</td><td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Niemcy</td><td>WK-XYB-PZ-IX71</td><td>Części mikroskopu</td></tr><tr><td>Komora celowa Attofluor, średnica 35 mm do&nbsp; 25 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A7816</td><td>Szklany uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td><td>Laser Components GmbH, Olching, Niemcy</td><td>SPCM-AQR-14</td><td>Detektor zliczający pojedyncze fotony</td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Newport, Darmstadt, Niemcy</td><td>10FC16PB.3</td><td>Filter</td></tr><tr><td>Biorender (oprogramowanie)</td><td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Kanada)</td><td>---</td><td>Oprogramowanie używane do tworzenia szkicu GPCR, https://app.biorender.com/</td></tr> <tr><td>Linia komórkowa jajnika chomika chińskiego (CHO)</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>Linie komórkowe</td></tr><tr><td>ChiSurf (oprogramowanie do analizy danych)</td><td>Thomas-Otavio Peulen, Wydział Bioinżynierii i Nauk Terapeutycznych, Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco, USAoprogramowanie</td><td></td> <td>oparte na ---tttrlib do analizy danych korelacji fluorescencji i histogramów zaniku fluorescencji, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Samouczek: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>472476-2.5L</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Niemcy)</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik DNA (odległość fluoroforu 40 pz)</td><td>IBA Lifesciences GmbH (G&ouml; ttingen, Niemcy)</td><td>---</td><td>Odczynnik, 5' CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3', 3' GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5'</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle: Mieszanina składników odżywczych F12 (z czerwienią fenolową i bez)</td> <td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td> <td>P04-41250, P04-41650</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Etanol (absolutny)</td> <td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td> <td>34852-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Erytrozyna B, Zawartość barwnika >=95 %</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td> Odczynnik <td>200964-5G</td><td>, funkcja odpowiedzi instrumentu, rozpuść w EtOH do 10 mg / ml</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biochrom&nbsp; (Berlin, Niemcy)</td><td>S 0615</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne źródło światła X-Cite 120 Q</td><td>Excelitas Technologies, Ontario, Kanada</td><td>XI120-Q-5060</td><td>Części mikroskopu</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne podłoże SNAP komórka: Komórka SNAP TMR-STAR</td><td>New England BioLabs (Frankfurt nad Menem, Niemcy)</td><td>Odczynnik S9105S</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjna powierzchnia podłoża SNAP: DY-549</td><td>New England BioLabs (Frankfurt nad Menem, Niemcy)</td><td>S9112S</td><td>Szkiełka nakrywkowe z odczynnikiem</td></tr><tr><td>(Wymiary: średnica 24 mm, grubość 0,13 - 0,16 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy)</td><td>111640</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Laser Controller</td><td>Picoquant, Berlin, Niemcy</td><td>910020 (PDL 828-S "SEPIA II")</td><td>optyka</td></tr><tr><td>Linie laserowe (480 nm i 560 nm)</td><td>Picoquant, Berlin, Niemcy</td><td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>Odczynnik</td><td></td></tr> <tr>11668-019<td>Pakiet MFD (oprogramowanie)</td><td>AG Seidel, Uniwersytet Heinricha Heinego w Düsseldorfie, Niemcy</td><td>---</td><td>Pakiet oprogramowania do analizy eksperymentów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek, w tym np. Kristine (korelacja danych tttr), Burbulator (symulacja eksperymentu z pojedynczą cząsteczką), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td></tr><tr><td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25,4 mm</td><td>Thorlabs, Bergkirchen, Niemcy</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>Druga część ekspandera wiązki</td></tr><tr><td>Komora Neubauera (głębokość 0,1 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy)</td><td>640110</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Olympus IX 71 stoisko</td><td>Olympus, Hamburg, Niemcy</td><td>IX2-ILL100</td><td>Części mikroskopu</td></tr><tr><td>Opti-MEM (pożywka o obniżonej surowicy)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>31985-047</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>049M4857V</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Karlowe Wary, USA)</td><td>14190144</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>otworkowy (50 &mikro; M)</td> <td>Newport, Darmstadt, Niemcy</td><td>PNH-50</td><td>Pinhole</td></tr><tr><td>PMT Hybrid-40</td><td>Picoquant, Berlin, Niemcy</td><td>932200 (PMA Hybrid 40)</td><td>Detektor zliczający pojedyncze fotony</td></tr><tr><td>Skrypty Python (oprogramowanie)</td><td>Katherina Hemmen, Centrum Obrazowania Integracyjnego i Translacyjnego im. Rudolfa-Virchowa, Uniwersytet w Wuerzburgu, Niemcy</td><td>---</td><td>Zbiór samodzielnie napisanych skryptów Pythona opartych na tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) służących do (1) określania średnich szybkości zliczania, (2) korelacji danych i (3) budowania histogramów zaniku fluorescencji, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td></tr><tr><td>Czterozakresowy rozdzielacz wiązki (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td><td>AHF, T&uuml; bingen, Niemcy</td><td>Filtr F73-421PH</td><td>Utrzymywanie</td></tr><tr><td>polaryzacji światłowodu jednomodowego, NA = 0,08 z kolimatorem</td><td>Picoquant, Berlin, Niemcy</td><td>02126</td><td>Optyka</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Carl Roth (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>6771.1</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SymPhotime x64 (Oprogramowanie do zbierania i eksportu danych)</td><td>Picoquant, Berlin, Niemcy</td><td>931073 (SPT64-1+2 dla jednego użytkownika)</td><td>Gromadzenie danych z rozdzielczością czasową (tttr) w samodzielnie zbudowanej konfiguracji FCCS, eksport danych</td></tr><tr><td>System zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC) Hydraharp 400</td><td>Picoquant, Berlin, Niemcy</td><td>930010 (Hydraharp 400)</td><td>Optyka</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>T4299-100ml</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Niezamontowane dublety achromatyczne, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td><td>Thorlabs, Bergkirchen, Niemcy</td><td>ACN127-020-A</td><td>Pierwsza część ekspandera wiązki</td></tr><tr><td>Obiektyw do zanurzenia w wodzie (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td><td>Olympus, Hamburg, Niemcy</td><td>UPLSAPO60XW</td><td>Obiektyw</td></tr></tbody></table>

dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Prezentujemy protokół i przepływ pracy do wykonywania dwukolorowej spektroskopii krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansu Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji. W dwukolorowym FCCS, gdzie fluktuacje intensywności fluorescencji reprezentują dynamiczny "odcisk palca" danej biomolekuły fluorescencyjnej, możemy badać kodyfuzję lub wiązanie receptorów. FRET, ze względu na wysoką czułość na odległości molekularne, służy jako dobrze znany "nanolinijka" do monitorowania zmian wewnątrzcząsteczkowych. Podsumowując, zmiany konformacyjne i kluczowe parametry, takie jak lokalne stężenia receptorów i stałe ruchliwości, stają się dostępne w warunkach komórkowych.
Ilościowe metody fluorescencji są trudne w komórkach ze względu na wysoki poziom hałasu i wrażliwość próbki. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić ten eksperyment, w tym etapy kalibracji przy użyciu dwukolorowego oznaczenia β receptor 2-adrenergiczny (β2AR) oznaczony eGFP i SNAP-tag-TAMRA. Procedura analizy danych krok po kroku jest dostępna przy użyciu oprogramowania typu open source i szablonów, które można łatwo dostosować.
Nasze wytyczne umożliwiają badaczom rozwikłanie molekularnych oddziaływań biomolekuł w żywych komórkach in situ z wysoką niezawodnością, pomimo ograniczonego poziomu sygnału do szumu w eksperymentach z żywymi komórkami. Okno operacyjne FRET, a w szczególności FCCS przy niskich stężeniach, umożliwia analizę ilościową w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji jest metodą statystyczną, która wykorzystuje fluorescencję w czasie do określenia dynamicznej sygnatury receptorów sprzężonych z białkiem G w żywych komórkach. Tutaj szczególnie interesują nas receptory beta-2 adrenergiczne. Receptory sfingolipidowe dostarczają głównie informacji o dynamice dyfuzji translacyjnej, a za pomocą anizotropii fluorescencji również dyfuzji rotacyjnej.Wprowadzając dodatkową etykietę, możemy również pro-wiążące, a nawet konformacyjne zmiany, jeśli sprzyjają transferowi energii rezonansowej między badanymi etykietami. Ilościowa fluorescencja czasowo-rozdzielcza wymaga starannego wyrównania ustawień i pomiarów kalibracyjnych. W następnych minutach przedstawimy eksperymentalny przewodnik po spektroskopii korelacji fluorescencji komórek życia, spektroskopii korelacji krzyżowej i transferze energii rezonansu Forstera receptorów sprzężonych z białkiem G, przy użyciu znaczników zdolnych do klonowania i syntetycznej siły przepływu.Osadzanie komórek i przetasowanie musi być wykonywane w sterylnych warunkach. Umieścić czystą sztangę nakrywkową na sześciodołkowej płytce hodowlanej i przepłukać ją sterylnym buforem fosforanowym z solą fizjologiczną, dodać dwa ml pożywki do hodowli komórkowych z czerwienią fenolową uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 mikrogramów na penicylinę aminową i 100 mikrogramów na ml streptomycyny do każdej studzienki i odłożyć na bok. Weź komórki CHO, które są hodowane w tym samym podłożu z czerwienią fenolową w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach CO2 i umyj je pięcioma ml PBS, aby usunąć martwe komórki.Dodaj dwa ml trypsyny i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć komórki danych ośmioma ml pożywki z czerwienią fenolową i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Policz komórki w komorze Neubauera i umieść komórki w gęstości 150 000 komórek na basenik na sześciodołkowej płytce hodowlanej zawierającej szkiełko nakrywkowe.Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze przez 24 godziny, aby osiągnąć około 80% zgryźliwości. Rozcieńczyć dwa mikrogramy pożądanego wektora DNA. Na przykład CT SNAP lub NT SNAP i sześć mikrolitrów tego odczynnika do transfekcji do dwóch oddzielnych probówek.Każdy z nich zawiera 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy dla każdej studzienki i inkubować je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać oba roztwory razem, aby otrzymać mieszaninę transfekcji i inkubować ją przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie umyj osadzone komórki CHO sterylnym PBS.Zastąp PBS jednym ml na studzienkę pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i bez antybiotyków. Dodaj całą mieszaninę konstrukcyjną składającą się z jednej kropli ml do każdej studzienki i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni w pięciu procentach CO2. W celu oznakowania należy rozcieńczyć odpowiedni substrat SNAP w jednym ml pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowca.Przemyć transfekowane komórki raz PBS i dodać jeden ml na studzienkę jednego mikromolowego roztworu substratu SNAP. Inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni w pięciu procentach CO2. Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od czerwieni fenolowej i dodaj dwa ml na dołek pożywki wolnej od czerwieni fenolowej.Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach CO2. Następnie przenieść szkiełko nakrywkowe wszystkich próbek do komory obrazowania i przemyć buforem do obrazowania o pojemności 500 mikrolitrów. Dodaj bufor obrazowania o pojemności 500 mikrolitrów przed przejściem do konfiguracji FRED FCS.Konfiguracja FRED FCS jest wyposażona w obiektyw wodny do mikroskopii konfokalnej, dwie linie laserowe, pojedynczy system zliczania obcokrajowców z pikowaniem czasowym, dwa hybrydowe BMT oraz dwa instrumenty do zbierania fotonów i oprogramowania do zbierania danych. Bardzo ważne jest, aby wyrównać konfigurację za każdym razem przed pomiarem w żywych komórkach. Aby dostosować ostrość, otworek i pozycję kolorowania, umieść dwa nanomolowe zielone roztwory kalibracyjne na szklanym szkiełku nakrywkowym i włącz laser 485 nanometrowy i 560 nanometrowy pracujący w stosach, wzbudzenie z przeplotem lub tryb PI.Skoncentruj się na roztworze i dostosuj położenie pierścienia otworkowego i kołnierza tak, aby uzyskać najwyższą szybkość zliczania i najmniejszą objętość konfokalną, aby uzyskać maksymalną jasność molekularną. Powtórz ten proces dla kanałów czerwonych z 10 nanomolowym roztworem kalibracyjnym czerwieni i mieszaniną obu. Umieść 10 nanomolowych roztworów DNA na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj ostrość otworu i pozycji pierścienia kołnierza tak, aby kolory krzyżowe między zielonym i czerwonym kanałem wykrywania były najwyższe.To jest źródło o największej amplitudzie. W przypadku pomiarów w żywych komórkach znajdź odpowiednią komórkę, ograniczając za pomocą lampy znacznikowej i obserwując przez okular. Włącz oba lasery w trybie PI i skup się na membranie, szukając maksymalnych zliczeń na sekundę.Należy pamiętać, że może być konieczne zmniejszenie mocy lasera w przypadku próbek komórek. Najlepiej mniej niż pięć mikrowatów w obiektywie. Zależy to w dużej mierze od użytego kwiatu i konfiguracji.Obserwuj krzywe automatyczne i krzyżowe krzywych beta-2 AR powiązanych z sondami EGP i snap tag w podglądzie online oprogramowania do zbierania danych i zbierz kilka pomiarów sortowania z czasem akwizycji od 60 do 180 sekund. Eksportuj przebieg korelacji i kontrast ze wszystkich pomiarów. Proszę tutaj zadbać o poprawne zdefiniowanie okien czasowych monitu i opóźnienia oraz skorzystanie z opcji pobierania mikro czasu w oprogramowaniu do korelacji danych.W sumie wymagane są trzy różne korelacje. Automatyczna korelacja okna czasowego monitu kanału zielonego. Automatyczna korelacja kanałów czerwonych i okna czasowego opóźnienia.I wreszcie korelacja krzyżowa sygnału kanału zielonego i okna czasowego monitu była sygnałem kanału czerwonego w oknie czasowym opóźnienia. Oto funkcje automatycznej korelacji zielonego i czerwonego FRED dla roztworów i dopasuj je do modelu dyfuzji 3 DT z dodatkowym potrójnym terminem wymaganym do kalibracji kształtu i wielkości objętości detekcji konfokalnej dla dwóch używanych kanałów kolorów, gdzie B jest linią bazową krzywej oraz liczbą cząsteczek i ogniskiem, TD oznacza czas dyfuzji i S, zero nad omega zero współczynnik kształtu konfokalnego elementu objętościowego. Mruganie trypletów i fizyka zdjęć są opisywane jako amplituda AR i czas relaksacji TR. Użyj znanego współczynnika dyfuzji dla zielonych i czerwonych wyróżnień kalibracyjnych i uzyskaj współczynniki kształtu, aby określić wymiary i objętość zakaźnego konfokalnego elementu objętościowego.Oblicz widmo w poprzek, podobnie jak IFR, zielony sygnał fluorescencyjny zebrany na kanałach zero i dwa do prawego kanału detekcji, kanału pierwszego i trzeciego, jako stosunek zebranych sygnałów tła. Określ bezpośrednie oczekiwanie przepływu danych akceptora przez długości fal wzbudzenia dawcy na podstawie stosunku zebranego tła kontrastu pomiarów kalibracji czerwieni i szybkiego wzbudzenia okna czasowego przez zielony laser do tła prawidłowe konto bezpośrednio w wzbudzeniu okna czasu opóźnienia przez czerwony laser. Oblicz jasność molekularną B, zarówno zieloną, jak i czerwoną siłę przepływu, na podstawie kontrastu zebranego tła, a następnie uzyskaj liczbę cząsteczek i skup się na dopasowaniu dyfuzyjnym 3 DT.Dopasuj zarówno ultrakorelacje z kanału zielonego i czerwonego, jak i korelację z zielonego monitu i czerwonego opóźnienia dwupoziomowego DNA do modelu dyfuzji 3 DT, utrzymując uzyskane czynniki kształtu na stałym poziomie dla funkcji automatycznej korelacji. Współczynnik kształtu dla funkcji korelacji krzyżowej znajduje się zwykle między tymi dwiema wartościami. Określ amplitudę przy zerowym czasie korelacji na podstawie wartości czcionki pozornej liczby cząsteczek i ostrości.Oblicz stosunek amplitudy dla próbki był 100% współdyfuzją siły zielonej i czerwonej podłogi. Dopasuj próbki komórek do odpowiedniego modelu. Sposób, w jaki pokazano im dyfuzję receptorów błonowych, nie był ciekawy w sposób bimodalny, był krótkim, niedługim czasem dyfuzji.Dodatkowo należy wziąć pod uwagę fizykę zdjęć i siłę mrugania podłogi. Tutaj do TD1 i TD2 są dwa wymagane czasy dyfuzji. A jedynka to ułamek czasu pierwszej dyfuzji W przeciwieństwie do pomiaru kalibracyjnego, w którym dyfuzja wolnych kostek i nici DNA, we wszystkich kierunkach, receptory błonowe wykazują tylko dyfuzję 2D wzdłuż błon komórkowych, obliczają stężenie białek z zieloną lub czerwoną etykietą pod względem liczby cząsteczek i ogniska.I objętość konfokalnego elementu objętościowego przy użyciu masy polaryzacyjnej. Dopasuj dwie korelacje altowe podwójnie znakowanej próbki przy użyciu tego samego modelu, co dla konstrukcji jednopoziomowej i funkcji korelacji krzyżowej przy użyciu dwumodalnego modelu dyfuzji, Uwaga dla globalnego opisu systemu. Wszystkie trzy uprawy muszą być dopasowane do siebie.Termin dyfuzji jest identyczny dla wszystkich trzech upraw. A jedyna różnica polega na tym, że czas reputacji spada, funkcja korelacji krzyżowej. Oblicz stężenie zielonych lub czerwonych białek pracy na podstawie odpowiedniej liczby cząsteczek i skupienia oraz objętości konfokalnego elementu objętościowego.Oszacować frakcję lub stężenie oddziałujących ze sobą białek znakowanych zieloną i czerwoną etykietą w próbkach komórkowych przy użyciu współczynników korekcyjnych uzyskanych z próbek DNA, stosunków amplitudy próbki komórkowej i odpowiednich otrzymanych stężeń. Dopasuj dwie korelacje alter próbki FRED jako pojedyncze znakowane próbki i frontową korelację krzyżową do bimodalnego modelu dyfuzji zawierającego składnik antykorelacji, gdzie AF odzwierciedla amplitudę całkowitej antykorelacji, a AR i TR odpowiednią amplitudę i czas relaksacji. W przypadku antyskorelowanych zmian fluorescencji spowodowanych FRED może być wymagany jeden lub kilka warunków antykorelacji, co spowodowało spadek funkcji korelacji krzyżowej Freda w niskich czasach korelacji, co zbiegło się ze wzrostem dwóch funkcji automatycznej korelacji.Pomiary kalibracyjne zielonych i czerwonych roztworów kwiatowych w celu zmniejszenia współczynników 6,5 i kanałów zielonych oraz 6,8 w kanałach czerwonych. Tak więc objętość konfokalna ma rozmiar 1,4 i 1,9 femto później w tym dniu pomiaru, jasność cząsteczki wynosi 12,5 kiloherca na cząsteczkę i 2,6 kiloherca na cząsteczkę. Mamy 15% przesłuchów od zielonego kwiatu do czerwonych kanałów po wzbudzeniu dawcy i 38% bezpośredniego, z wyjątkiem wzbudzenia czerwonej formy kwiatowej przez zieloną, z naszego pomiaru DNA, określamy współczynniki korekcyjne dla objętości konfokalnego nakładania się na 0,6 i 0,7, komórki transfekowane konstruktem z pojedynczą etykietą wykazują dwumodalną dwuwymiarową dyfuzję na błonie komórkowej, gdzie mniej więcej połowa cząsteczek dyfunduje powoli Skala czasu od 50 do stu milisekund, a druga połowa stosunkowo szybka, około dwóch milisekund w obu konstrukcjach.Dodatkowo obecne jest mruganie trypletowe. Jednak w konstrukcji przyciągania poziomu czerwonego uzyskuje się kolejny czas relaksacji wynoszący 180 mikrosekund, który może wynikać z prostego przyciągania bez ograniczeń. Z samej podwójnej etykiety, przeciętej konstrukcją zapobiegającą zatrzaskiwaniu, w której dwie etykiety znajdują się po dwóch różnych stronach błony komórkowej, zebrano dwa pomiary mniej: szum i czerwoną powłokę na korelację.A korelacja krzyżowa PI jest tutaj dość wysoka. Tutaj 70% cząsteczek, jeśli powoli poniżej stu milisekund i tylko 30% szybko około jednej milisekundy, frakcja podwójnie uwolnionych cząsteczek jest niska i wynosi od 15 do 25%Dane do zatrzasku CT wyglądają lepiej i są mniej hałaśliwe. Jednak oczekiwana najgłębsza antykorelacja frontu nie może być widoczna i najprawdopodobniej jest to masa spowodowana dużą ilością przesłuchów, bezpośrednim wzbudzeniem akceptacji i trypletowym mruganiem zarówno siły kwiatowej, jak i raz schematy analizy danych wykorzystujące zebraną intensywność fluorescencji DKS mogą pomóc to uratować, jak pokazano dla symulowanego zestawu danych.Zaletą techniki Fred FCS jest to, że wraz z mobilnością możemy badać dynamikę konferencji GPCR. Jednak wykonywanie FRED FC w laboratoriach jest trudne i wymaga dobrych transfekowanych komórek, wydajnego etykietowania i doskonale skalibrowanej konfiguracji. Bardzo ważna jest również siła FRED pair pro force.Krytyczne etapy eksperymentalne obejmują optymalizację transfekcji, minimalizację tła i autofluorescencję. Dodatkowo, analiza atomów pomoże zrozumieć różną dynamikę receptorów w żywych komórkach. Mamy nadzieję, że ten protokół będzie przydatny w przeprowadzaniu podejścia FRED FCS w eksperymentach na żywych komórkach.

dual-color-fluorescence-cross-correlation-spectroscopy-to-study

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Poznaj dwukolorową spektroskopię korelacji krzyżowej FCCS z FRET do badania dynamiki receptorów GPCR w żywych komórkach CHO. Ta metoda umożliwia analizę interakcji białkowych i zmian konformacyjnych.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów