Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji jest metodą statystyczną, która wykorzystuje fluorescencję w czasie do określenia dynamicznej sygnatury receptorów sprzężonych z białkiem G w żywych komórkach. Tutaj szczególnie interesują nas receptory beta-2 adrenergiczne. Receptory sfingolipidowe dostarczają głównie informacji o dynamice dyfuzji translacyjnej, a za pomocą anizotropii fluorescencji również dyfuzji rotacyjnej.

Wprowadzając dodatkową etykietę, możemy również pro-wiążące, a nawet konformacyjne zmiany, jeśli sprzyjają transferowi energii rezonansowej między badanymi etykietami. Ilościowa fluorescencja czasowo-rozdzielcza wymaga starannego wyrównania ustawień i pomiarów kalibracyjnych. W następnych minutach przedstawimy eksperymentalny przewodnik po spektroskopii korelacji fluorescencji komórek życia, spektroskopii korelacji krzyżowej i transferze energii rezonansu Forstera receptorów sprzężonych z białkiem G, przy użyciu znaczników zdolnych do klonowania i syntetycznej siły przepływu.

Osadzanie komórek i przetasowanie musi być wykonywane w sterylnych warunkach. Umieścić czystą sztangę nakrywkową na sześciodołkowej płytce hodowlanej i przepłukać ją sterylnym buforem fosforanowym z solą fizjologiczną, dodać dwa ml pożywki do hodowli komórkowych z czerwienią fenolową uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 mikrogramów na penicylinę aminową i 100 mikrogramów na ml streptomycyny do każdej studzienki i odłożyć na bok. Weź komórki CHO, które są hodowane w tym samym podłożu z czerwienią fenolową w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach CO2 i umyj je pięcioma ml PBS, aby usunąć martwe komórki.

Dodaj dwa ml trypsyny i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć komórki danych ośmioma ml pożywki z czerwienią fenolową i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Policz komórki w komorze Neubauera i umieść komórki w gęstości 150 000 komórek na basenik na sześciodołkowej płytce hodowlanej zawierającej szkiełko nakrywkowe.

Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze przez 24 godziny, aby osiągnąć około 80% zgryźliwości. Rozcieńczyć dwa mikrogramy pożądanego wektora DNA. Na przykład CT SNAP lub NT SNAP i sześć mikrolitrów tego odczynnika do transfekcji do dwóch oddzielnych probówek.

Każdy z nich zawiera 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy dla każdej studzienki i inkubować je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać oba roztwory razem, aby otrzymać mieszaninę transfekcji i inkubować ją przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie umyj osadzone komórki CHO sterylnym PBS.

Zastąp PBS jednym ml na studzienkę pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i bez antybiotyków. Dodaj całą mieszaninę konstrukcyjną składającą się z jednej kropli ml do każdej studzienki i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni w pięciu procentach CO2. W celu oznakowania należy rozcieńczyć odpowiedni substrat SNAP w jednym ml pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowca.

Przemyć transfekowane komórki raz PBS i dodać jeden ml na studzienkę jednego mikromolowego roztworu substratu SNAP. Inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni w pięciu procentach CO2. Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od czerwieni fenolowej i dodaj dwa ml na dołek pożywki wolnej od czerwieni fenolowej.

Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach CO2. Następnie przenieść szkiełko nakrywkowe wszystkich próbek do komory obrazowania i przemyć buforem do obrazowania o pojemności 500 mikrolitrów. Dodaj bufor obrazowania o pojemności 500 mikrolitrów przed przejściem do konfiguracji FRED FCS.

Konfiguracja FRED FCS jest wyposażona w obiektyw wodny do mikroskopii konfokalnej, dwie linie laserowe, pojedynczy system zliczania obcokrajowców z pikowaniem czasowym, dwa hybrydowe BMT oraz dwa instrumenty do zbierania fotonów i oprogramowania do zbierania danych. Bardzo ważne jest, aby wyrównać konfigurację za każdym razem przed pomiarem w żywych komórkach. Aby dostosować ostrość, otworek i pozycję kolorowania, umieść dwa nanomolowe zielone roztwory kalibracyjne na szklanym szkiełku nakrywkowym i włącz laser 485 nanometrowy i 560 nanometrowy pracujący w stosach, wzbudzenie z przeplotem lub tryb PI.

Skoncentruj się na roztworze i dostosuj położenie pierścienia otworkowego i kołnierza tak, aby uzyskać najwyższą szybkość zliczania i najmniejszą objętość konfokalną, aby uzyskać maksymalną jasność molekularną. Powtórz ten proces dla kanałów czerwonych z 10 nanomolowym roztworem kalibracyjnym czerwieni i mieszaniną obu. Umieść 10 nanomolowych roztworów DNA na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj ostrość otworu i pozycji pierścienia kołnierza tak, aby kolory krzyżowe między zielonym i czerwonym kanałem wykrywania były najwyższe.

To jest źródło o największej amplitudzie. W przypadku pomiarów w żywych komórkach znajdź odpowiednią komórkę, ograniczając za pomocą lampy znacznikowej i obserwując przez okular. Włącz oba lasery w trybie PI i skup się na membranie, szukając maksymalnych zliczeń na sekundę.

Należy pamiętać, że może być konieczne zmniejszenie mocy lasera w przypadku próbek komórek. Najlepiej mniej niż pięć mikrowatów w obiektywie. Zależy to w dużej mierze od użytego kwiatu i konfiguracji.

Obserwuj krzywe automatyczne i krzyżowe krzywych beta-2 AR powiązanych z sondami EGP i snap tag w podglądzie online oprogramowania do zbierania danych i zbierz kilka pomiarów sortowania z czasem akwizycji od 60 do 180 sekund. Eksportuj przebieg korelacji i kontrast ze wszystkich pomiarów. Proszę tutaj zadbać o poprawne zdefiniowanie okien czasowych monitu i opóźnienia oraz skorzystanie z opcji pobierania mikro czasu w oprogramowaniu do korelacji danych.

W sumie wymagane są trzy różne korelacje. Automatyczna korelacja okna czasowego monitu kanału zielonego. Automatyczna korelacja kanałów czerwonych i okna czasowego opóźnienia.

I wreszcie korelacja krzyżowa sygnału kanału zielonego i okna czasowego monitu była sygnałem kanału czerwonego w oknie czasowym opóźnienia. Oto funkcje automatycznej korelacji zielonego i czerwonego FRED dla roztworów i dopasuj je do modelu dyfuzji 3 DT z dodatkowym potrójnym terminem wymaganym do kalibracji kształtu i wielkości objętości detekcji konfokalnej dla dwóch używanych kanałów kolorów, gdzie B jest linią bazową krzywej oraz liczbą cząsteczek i ogniskiem, TD oznacza czas dyfuzji i S, zero nad omega zero współczynnik kształtu konfokalnego elementu objętościowego. Mruganie trypletów i fizyka zdjęć są opisywane jako amplituda AR i czas relaksacji TR. Użyj znanego współczynnika dyfuzji dla zielonych i czerwonych wyróżnień kalibracyjnych i uzyskaj współczynniki kształtu, aby określić wymiary i objętość zakaźnego konfokalnego elementu objętościowego.

Oblicz widmo w poprzek, podobnie jak IFR, zielony sygnał fluorescencyjny zebrany na kanałach zero i dwa do prawego kanału detekcji, kanału pierwszego i trzeciego, jako stosunek zebranych sygnałów tła. Określ bezpośrednie oczekiwanie przepływu danych akceptora przez długości fal wzbudzenia dawcy na podstawie stosunku zebranego tła kontrastu pomiarów kalibracji czerwieni i szybkiego wzbudzenia okna czasowego przez zielony laser do tła prawidłowe konto bezpośrednio w wzbudzeniu okna czasu opóźnienia przez czerwony laser. Oblicz jasność molekularną B, zarówno zieloną, jak i czerwoną siłę przepływu, na podstawie kontrastu zebranego tła, a następnie uzyskaj liczbę cząsteczek i skup się na dopasowaniu dyfuzyjnym 3 DT.

Dopasuj zarówno ultrakorelacje z kanału zielonego i czerwonego, jak i korelację z zielonego monitu i czerwonego opóźnienia dwupoziomowego DNA do modelu dyfuzji 3 DT, utrzymując uzyskane czynniki kształtu na stałym poziomie dla funkcji automatycznej korelacji. Współczynnik kształtu dla funkcji korelacji krzyżowej znajduje się zwykle między tymi dwiema wartościami. Określ amplitudę przy zerowym czasie korelacji na podstawie wartości czcionki pozornej liczby cząsteczek i ostrości.

Oblicz stosunek amplitudy dla próbki był 100% współdyfuzją siły zielonej i czerwonej podłogi. Dopasuj próbki komórek do odpowiedniego modelu. Sposób, w jaki pokazano im dyfuzję receptorów błonowych, nie był ciekawy w sposób bimodalny, był krótkim, niedługim czasem dyfuzji.

Dodatkowo należy wziąć pod uwagę fizykę zdjęć i siłę mrugania podłogi. Tutaj do TD1 i TD2 są dwa wymagane czasy dyfuzji. A jedynka to ułamek czasu pierwszej dyfuzji W przeciwieństwie do pomiaru kalibracyjnego, w którym dyfuzja wolnych kostek i nici DNA, we wszystkich kierunkach, receptory błonowe wykazują tylko dyfuzję 2D wzdłuż błon komórkowych, obliczają stężenie białek z zieloną lub czerwoną etykietą pod względem liczby cząsteczek i ogniska.

I objętość konfokalnego elementu objętościowego przy użyciu masy polaryzacyjnej. Dopasuj dwie korelacje altowe podwójnie znakowanej próbki przy użyciu tego samego modelu, co dla konstrukcji jednopoziomowej i funkcji korelacji krzyżowej przy użyciu dwumodalnego modelu dyfuzji, Uwaga dla globalnego opisu systemu. Wszystkie trzy uprawy muszą być dopasowane do siebie.

Termin dyfuzji jest identyczny dla wszystkich trzech upraw. A jedyna różnica polega na tym, że czas reputacji spada, funkcja korelacji krzyżowej. Oblicz stężenie zielonych lub czerwonych białek pracy na podstawie odpowiedniej liczby cząsteczek i skupienia oraz objętości konfokalnego elementu objętościowego.

Oszacować frakcję lub stężenie oddziałujących ze sobą białek znakowanych zieloną i czerwoną etykietą w próbkach komórkowych przy użyciu współczynników korekcyjnych uzyskanych z próbek DNA, stosunków amplitudy próbki komórkowej i odpowiednich otrzymanych stężeń. Dopasuj dwie korelacje alter próbki FRED jako pojedyncze znakowane próbki i frontową korelację krzyżową do bimodalnego modelu dyfuzji zawierającego składnik antykorelacji, gdzie AF odzwierciedla amplitudę całkowitej antykorelacji, a AR i TR odpowiednią amplitudę i czas relaksacji. W przypadku antyskorelowanych zmian fluorescencji spowodowanych FRED może być wymagany jeden lub kilka warunków antykorelacji, co spowodowało spadek funkcji korelacji krzyżowej Freda w niskich czasach korelacji, co zbiegło się ze wzrostem dwóch funkcji automatycznej korelacji.

Pomiary kalibracyjne zielonych i czerwonych roztworów kwiatowych w celu zmniejszenia współczynników 6,5 i kanałów zielonych oraz 6,8 w kanałach czerwonych. Tak więc objętość konfokalna ma rozmiar 1,4 i 1,9 femto później w tym dniu pomiaru, jasność cząsteczki wynosi 12,5 kiloherca na cząsteczkę i 2,6 kiloherca na cząsteczkę. Mamy 15% przesłuchów od zielonego kwiatu do czerwonych kanałów po wzbudzeniu dawcy i 38% bezpośredniego, z wyjątkiem wzbudzenia czerwonej formy kwiatowej przez zieloną, z naszego pomiaru DNA, określamy współczynniki korekcyjne dla objętości konfokalnego nakładania się na 0,6 i 0,7, komórki transfekowane konstruktem z pojedynczą etykietą wykazują dwumodalną dwuwymiarową dyfuzję na błonie komórkowej, gdzie mniej więcej połowa cząsteczek dyfunduje powoli Skala czasu od 50 do stu milisekund, a druga połowa stosunkowo szybka, około dwóch milisekund w obu konstrukcjach.

Dodatkowo obecne jest mruganie trypletowe. Jednak w konstrukcji przyciągania poziomu czerwonego uzyskuje się kolejny czas relaksacji wynoszący 180 mikrosekund, który może wynikać z prostego przyciągania bez ograniczeń. Z samej podwójnej etykiety, przeciętej konstrukcją zapobiegającą zatrzaskiwaniu, w której dwie etykiety znajdują się po dwóch różnych stronach błony komórkowej, zebrano dwa pomiary mniej: szum i czerwoną powłokę na korelację.

A korelacja krzyżowa PI jest tutaj dość wysoka. Tutaj 70% cząsteczek, jeśli powoli poniżej stu milisekund i tylko 30% szybko około jednej milisekundy, frakcja podwójnie uwolnionych cząsteczek jest niska i wynosi od 15 do 25%Dane do zatrzasku CT wyglądają lepiej i są mniej hałaśliwe. Jednak oczekiwana najgłębsza antykorelacja frontu nie może być widoczna i najprawdopodobniej jest to masa spowodowana dużą ilością przesłuchów, bezpośrednim wzbudzeniem akceptacji i trypletowym mruganiem zarówno siły kwiatowej, jak i raz schematy analizy danych wykorzystujące zebraną intensywność fluorescencji DKS mogą pomóc to uratować, jak pokazano dla symulowanego zestawu danych.

Zaletą techniki Fred FCS jest to, że wraz z mobilnością możemy badać dynamikę konferencji GPCR. Jednak wykonywanie FRED FC w laboratoriach jest trudne i wymaga dobrych transfekowanych komórek, wydajnego etykietowania i doskonale skalibrowanej konfiguracji. Bardzo ważna jest również siła FRED pair pro force.

Krytyczne etapy eksperymentalne obejmują optymalizację transfekcji, minimalizację tła i autofluorescencję. Dodatkowo, analiza atomów pomoże zrozumieć różną dynamikę receptorów w żywych komórkach. Mamy nadzieję, że ten protokół będzie przydatny w przeprowadzaniu podejścia FRED FCS w eksperymentach na żywych komórkach.