Name: Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Odkryj odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji w melanocytach przy użyciu danio pręgowanego. Metoda łączy cytometrię przepływową i spektrofotometrię do analizy zawartości melaniny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Rady ds. Badań Naukowych i Przemysłowych vide projekt MLP2008 oraz Departamentu Nauki i Technologii dla projektu GAP165 za wsparcie pracy przedstawionej w tym manuskrypcie. Dziękujemy Jeyashri Rengaraju i Chetanowi Mishrze za pomoc w eksperymentach.

Eksperymenty z danio pręgowanym zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z instytucjonalnym zatwierdzeniem etyki zwierząt (IAEC) przez CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Indie (Propozycja nr 45a). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
1. Wstrzykiwanie morfoliny do zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Za pomocą standardowego ściągacza do igieł narysuj bardzo ostre pipety z zamkniętą końcówką.</li>
	<li>Załadować roztwór zawierający morfolinę do mikropipet za pomocą końcówki do mikropobierania i wprowadzić go do aparatu do mikrowstrzykiwaczy. Dokładnie dokręć, aby zablokować mikropipetę. 
	UWAGA: Konieczna jest standaryzacja dawkowania morfolinosów. Odpowiednia dawka ma wskaźnik przeżycia >70% i określony fenotyp na poziomie 24 hpf.</li>
	<li>Odetnij końcówkę mikropipety za pomocą cienkich kleszczyków i skalibruj ją11.</li>
	<li>Aby skalibrować, wstrzyknąć 1 objętość roztworu morfolino do rurki kapilarnej z mikropipety, utrzymując czas wstrzykiwania na poziomie 1 s. Powtórz tę czynność pięć razy. Używając wzorca, 1 mm = objętość 30 nL, znajdź objętość wstrzykniętą w ciągu 5 sekund, przykładając rurkę kapilarną do skali pomiarowej. Korzystając z powyższych informacji, oblicz czas (w sekundach) wymagany do wstrzyknięcia 1-3 nL na wstrzyknięcie12. 
	UWAGA: Wzorzec, 1 mm = 30 nL, jest specyficzny dla ustawień ciśnienia mikrowtryskiwacza i średnicy kapilary używanej do kalibracji. Idealnie byłoby, gdyby wstrzyknięcie zostało wykonane na granicy faz żółtkowo-komórkowa, która powstaje w ciągu 15-20 minut po zapłodnieniu. Aby ułatwić wielokrotne wstrzyknięcia, rozwój zarodków można nieznacznie opóźnić, utrzymując je w niższej temperaturze (18 °C). Należy jednak ograniczyć to do minimum i nie wydłużać dłużej niż 30 minut ze względu na skumulowany wpływ niższej temperatury na zmiany ekspresji genów.</li>
	<li>Zamontuj zarodki na odlanej z agarozy szalce Petriego (60 mm). Ułóż zarodki ciasno w grzbietach. Używając pipet z polerowanego szkła, ustawić je we właściwej orientacji do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Pod mikroskopem za pomocą manipulatorów zbliżyć mikropipetę do zarodka i wstrzyknąć do wnętrza interfejsu żółtka-komórka, naciskając przełącznik nożny.</li>
	<li>Wstrzyknąć wszystkie zarodki w podobny sposób; zebrać je na szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę wodną dla zarodków i inkubować w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Zbadaj wstrzyknięte zarodki po 6-8 godzinach. Usuń wszystkie martwe zarodki, które można zidentyfikować ze względu na ich duże zmętnienie i zmieniaj wodę w zarodku co najmniej raz dziennie, aby uniknąć infekcji.</li>
</ol>
2. Analiza pigmentacji
<ol>
	<li>Preparat do liczenia melanoforów bocznej linii środkowej w zarodkach danio pręgowanego 3 dpf
	<ol>
		<li>Traktuj zarodki 0,016% środkiem znieczulającym nerwowo-mięśniowym, aby je unieruchomić.</li>
		<li>Aby zamontować zarodki do obrazowania, dodaj kilka mililitrów 1,5-2% metylocelulozy do szalki Petriego (60 mm), aby utworzyła cienką warstwę. Za pomocą pipety Pasteura wybierz zarodki i delikatnie umieść je w metylocelulozie, aby ograniczyć dalszy ruch podczas obrazowania.</li>
		<li>Dostosuj ich położenie w celu optymalnego obrazowania bocznego (pasek grzbietowy, pręga brzuszna, pasek żółtka i melanofory w linii środkowej) lub grzbietowego (melanofory na grzbietowej części głowy). Dla lepszej rozdzielczości sąsiednich melanoforów obraz w większym powiększeniu (>5x)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie w jasnym polu 
	UWAGA: Obrazowanie w jasnym polu odbywa się za pomocą mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 8-10x.
	<ol>
		<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą zarodki danio pręgowanego pod mikroskopem. Za pomocą manipulatora ustaw rybę w takiej orientacji, aby wszystkie pięć pasków embrionalnych melanocytów było widocznych jednocześnie (grzbietowe, brzuszne, dwa boczne, żółtko) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Szybko przechwytuj obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji. W przypadku, gdy zwierzę odzyskuje ruch przed wykonaniem obrazu, należy je ponownie zanurzyć w znieczuleniu i kontynuować obrazowanie, gdy jest wystarczająco unieruchomione.</li>
		<li>Powtórz to ze wszystkimi rybami i upewnij się, że powiększenie pozostaje takie samo dla każdego obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie średniej wartości szarości za pomocą oprogramowania ImageJ
	<ol>
		<li>Wykonaj zdjęcia grzbietowe i boczne zarodków danio pręgowanego z 2 dpf.</li>
		<li>Otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo w ImageJ, za pomocą narzędzia Otwórz. Użyj narzędzia Kształt odręczny, aby obrysować obszar do analizy. Przejdź do opcji Ustaw pomiary i wybierz Średnia wartość szarości | obszar. Naciśnij M (lub Analizuj | Pomiar), aby obliczyć średnią wartość szarości dla wybranego obszaru.</li>
		<li>Utrzymując stałą powierzchnię do analizy, należy obliczyć średnią szarą strefę dla każdego zwierzęcia z osobna.</li>
		<li>Narysuj wykres słupkowy z uzyskanymi danymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczenie zawartości melaniny
	<ol>
		<li>Przy 2 dpf użyj szklanej pipety Pasteura, aby zebrać ~25 zarodków danio pręgowanego.</li>
		<li>Wykonaj manualną dechorionację za pomocą igieł insulinowych o pojemności 1 ml i dodaj je do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić pożywkę zarodkową i dodać 1 ml lodowatego buforu do lizy (20 mM fosforanu sodu (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) z koktajlem inhibitorów proteazy i przygotować lizaty białkowe metodą sonikacji.</li>
		<li>Rozpuścić lizaty w 1 ml 1 N NaOH i inkubować próbki w temperaturze 100 °C przez 50 minut w łaźni wodnej. Wiruj go z przerwami, aby całkowicie ujednorodnić lizaty.</li>
		<li>Odczyty absorbancji próbek przy długości fali 490 nm należy wykonać za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Oblicz zawartość melaniny, porównując absorbancję próbki ze standardową krzywą znanych stężeń syntetycznej melaniny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Liczba melanoforów
UWAGA: Analiza fluorescencji w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego może być przeprowadzona dwiema metodami: 1) zliczanie komórek GFP-dodatnich; 2) pomiar intensywności fluorescencji.
<ol>
	<li>Przygotowanie do liczenia komórek GFP dodatnich metodą GFP we wczesnych zarodkach danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Zbierz 200-250 zarodków GFP i umyj je w sitku przy użyciu zwykłej wody z zarodków. Jako kontrolę ujemną GFP, zarodki typu dzikiego (Assam Wildtype) z ujemnym wynikiem GFP, w którym dopasowują się do stadium zarodka12.</li>
		<li>W zależności od interesującego stadium przenieść zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,6 mg/ml pronazy. Po 5-10 minutach, za pomocą pipety Pasteura, przenieś zdekorionowane zarodki na świeżą szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz ~100 zarodków i przenieś je do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Ostrożnie odrzucić pożywkę i dodać 200 μl lodowatego roztworu Ringera (buforu do usuwania żółtka). Trzymając probówkę na lodzie, pipetuj zawartość w górę iw dół ~20 razy, aż żółtko się rozpuści. Odwirować probówki o stężeniu 100 × g przez 1 minutę w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Ponownie odwirować i ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieść pozbawione żółtka zarodki na szalkę Petriego zawierającą 10 ml roztworu trypsyny (bufor dysocjacyjny komórek). Wykonuj go na wielu szalkach Petriego, aby uniknąć przepełnienia zarodków i nieefektywnej trypsynizacji. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml wymieszać roztwór zawierający ciała zarodków raz lub dwa razy, aby zmniejszyć agregację.</li>
		<li>Inkubować szalki Petriego w temperaturze pokojowej przez 15 minut (zarodki <24 hpf) lub 30 minut (zarodki 24-30 hpf). Od czasu do czasu odsysać i dozować zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby wspomóc rozpad komórek.</li>
		<li>W okresie inkubacji zainicjuj cytometr przepływowy do zliczania komórek.</li>
		<li>Umieść sitko o wielkości 70 μm nad stożkową probówką o pojemności 50 ml i przepuść przez sitko zawiesinę trypsynizowaną w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Umyj szalki Petriego tą samą zawiesiną kilka razy, aby usunąć komórki przyklejone do powierzchni.</li>
		<li>Wirować próbki w temperaturze 450 × g, 4 °C przez 5 minut w obracającym się wirniku kubełkowym.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 1 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Wirować ponownie w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Na koniec ponownie zawieś osad w PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej i trzymaj go na lodzie do momentu uruchomienia FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie cytometru przepływowego
	<ol>
		<li>Włączyć cytometr przepływowy i rozpocząć uruchamianie. 
		UWAGA: Przed włączeniem maszyny opróżnij kosz na śmieci i napełnij zbiornik płynu w osłonie.</li>
		<li>Znormalizuj przepływ strumienia dla dyszy 70 μm (lub 85 μm). Pozostaw go w spokoju na 10-15 minut, jeśli jest niestabilny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie komórek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą cytometru przepływowego
	<ol>
		<li>Zainicjuj nowy folder eksperymentu i utwórz wykres punktowy rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego oraz histogram intensywności izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).</li>
		<li>Najpierw załaduj komórki typu dzikiego, aby ustawić przednie i boczne bramki rozproszenia (aby wykluczyć dublety i zanieczyszczenia) oraz próg FITC.</li>
		<li>Po ustawieniu bramek wyjmij próbkę i załaduj komórki wyizolowane z zarodków Tg(ftyrp1:GFP) w celu policzenia melanocytów. 
		UWAGA: Tutaj, ponieważ ftyrp1: GFP specyficznie oznacza dojrzałe melanocyty, liczba komórek GFP-dodatnich pod bramką FITC będzie odpowiadać liczbie melanocytów.</li>
		<li>Powtórz powyższy krok z próbkami wstrzykniętymi morfolino, aby oszacować i porównać liczbę melanocytów z kontrolą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar intensywności fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz 100-120 zarodków i przenieś je na szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków.</li>
		<li>Przy ~ 10-12 hpf przenieś zarodki do 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika, aby zahamować pigmentację.</li>
		<li>Wykonaj manualną dechorionację za pomocą igieł insulinowych do obrazowania zarodków <48 hpf.</li>
		<li>Aby unieruchomić zarodki, należy je potraktować 0,016% tricainą.</li>
		<li>Aby zamontować zarodki do obrazowania, umieść kilka ml 1,5-2% metylocelulozy na szalce Petriego (60 mm), tak aby utworzyła cienką warstwę. Dodaj zarodki do metylocelulozy, aby ograniczyć dalszy ruch podczas obrazowania. Umieścić szalkę Petriego zawierającą próbki pod mikroskopem. Za pomocą końcówki do pipety ustaw zwierzę w żądanej orientacji.</li>
		<li>Pobieraj obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji. W przypadku zarodków <24 hpf należy uchwycić cały zarodek na raz pod 10-krotnym powiększeniem. W przypadku >24 etapów hpf należy pobrać wiele pól skanowania, a następnie zmontować je (zszyć) ze sobą.</li>
		<li>Powtórz to ze wszystkimi rybami i upewnij się, że ustawienie akwizycji pozostaje stałe przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacji
	<ol>
		<li>Analizuj obraz dalej za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
		<li>Otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo w ImageJ, za pomocą narzędzia Otwórz.</li>
		<li>Użyj narzędzia do kształtowania odręcznego, aby obrysować obszar do analizy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
		<li>Naciśnij M (lub Analizuj | Pomiar), aby uzyskać wybrany pomiar intensywności obszaru.</li>
		<li>Utrzymując stałą powierzchnię przeznaczoną do analizy, należy obliczyć średnią intensywność na obszar dla każdego zwierzęcia z osobna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+evolution+of+pigment+patterns+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and evolution of pigment patterns in fish.</a> Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).</li>
<li>Jablonski, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+human+skin+and+skin+color%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Anthropology%22%5BJournal%5D)">The evolution of human skin and skin color.</a> Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).</li>
<li>Hoekstra, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+development+and+evolution+of+adaptive+pigmentation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates.</a> Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).</li>
<li>Quigley, I. K., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+pattern+formation+in+zebrafish%3A+a+model+for+developmental+genetics+and+the+evolution+of+form%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form.</a> Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).</li>
<li>Meyers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+development+of+a+vertebrate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: development of a vertebrate model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+melanophore+development+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).</li>
<li>Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development%3A+insights+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest development: insights from the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).</li>
<li>Carney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+Sox10+in+specification+of+neural+crest-derived+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons.</a> Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).</li>
<li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neural+crest+by+regulation+of+Mitf%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf.</a> Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).</li>
<li>Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fugu+tyrp1+promoter+directs+specific+GFP+expression+in+zebrafish%3A+tools+to+study+the+RPE+and+the+neural+crest-derived+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores.</a> Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li>
<li>Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon+for+efficient+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery.</a> Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).</li>
<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+generating+mouse%2Fzebrafish+models+of+human+skeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).</li>
<li>Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+eumelanin+and+pheomelanin+markers+in+diverse+biological+samples+by+HPLC-UV-MS+following+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction.</a> PLoS One. 14 (10), 0223552(2019).</li>
<li>Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+quantification+of+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent quantification of melanin.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).</li>
<li>Hultman, K. A., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+direct-developing+and+stem+cell-derived+melanocytes+to+the+zebrafish+larval+pigment+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern.</a> Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).</li>
<li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142 (4), 620-632 (2015).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Fenotyp pigmentacji często objawia się zmianami w zawartości melaniny lub liczbie melanocytów zawierających pigment. Opisana tu metoda pozwala na rozbiór tej dychotomii i pozwala na jakościową, jak i ilościową ocenę zawartości melaniny i liczby melanoforów na zarodek, niezależnie od zawartości melaniny. Wysoka płodność danio pręgowanego, widoczny charakter barwnikowych melanocytów i brak transferu melanosomów umożliwiają analizę biologii melanocytów przy użyciu tego odwróconego podejścia genetycznego, które jest podatne ...

Podczas gdy użycie melaniny do fotoprotekcji ewoluowało kilkakrotnie w całym królestwie zwierząt, kręgowce najwyraźniej udoskonaliły ten proces. Dedykowane komórki produkujące pigment ze skomplikowaną maszynerią do syntezy i przechowywania melaniny są zachowane od ryb do ludzi1. Jednak wynik pigmentacji jest dramatycznie zróżnicowany, od koloru do odbioru i prezentuje się jako żywe wzory na powłokach, skórze i włosach2. Pomimo różnorodności, repertuar genów zaangażowanych w odpowiedź pigmentacyjną jest uderzająco konserwatywny. Podstawowe składniki maszynerii syntetyzującej melaninę, takie jak kluczowe enzymy syntetyzujące melaninę, składniki melanosomów i łączność ze szlakiem sygnałowym, pozostają zasadniczo identyczne we wszystkich organizmach. Subtelne różnice genetyczne powodują dramatyczne zmiany we wzorcach pigmentacji obserwowanych u różnych gatunków3. W związku z tym, odwrotne podejście genetyczne w organizmie niższych kręgowców, danio pręgowanym (Danio rerio), stanowi doskonałą okazję do rozszyfrowania udziału genów w renderowaniu stanu pigmentowego4.
Zarodki danio pręgowanego rozwijają się z jednokomórkowego zapłodnionego zygoty w larwę w ciągu ~24 godzin po zapłodnieniu (hpf)5. Uderzające jest to, że komórki równoważne melanocytom - melanofory - są dużymi komórkami, które są obecne w skórze właściwej i rzucają się w oczy ze względu na zawartość ciemnej melaniny6. Te komórki pochodzące z grzebienia nerwowego emitują ~11 hpf i zaczynają pigmentować ~24 hpf6,7. Konserwatywne moduły ekspresji genów umożliwiły identyfikację kluczowych czynników, które koordynują funkcje melanocytów i doprowadziły do opracowania transgenicznych fluorescencyjnych linii reporterowych Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) i Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 które oznaczają selektywne etapy rozwoju melanocytów. Wykorzystanie tych transgenicznych linii rybnych umożliwia badanie biologii komórkowej melanocytów na poziomie organizmu w kontekście tkankowym z odpowiednimi wskazówkami zgodnie z liniami czasowymi rozwoju. Te reportery uzupełniają kwantyfikację melanocytów na podstawie pigmentu i umożliwiają wyraźną ocenę liczby melanocytów niezależnie od zawartości melaniny.
Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół do rozszyfrowania biologii melanocytów poprzez ocenę dwóch krytycznych parametrów, a mianowicie zawartości melaniny i liczby melanocytów. Podczas gdy pierwszy z nich jest powszechnym odczytem funkcjonalnym wynikającym z reakcji hipopigmentacji, drugi wiąże się ze zmniejszeniem specyfikacji lub przeżycia melanocytów i często jest związany z genetycznymi lub nabytymi stanami depigmentacyjnymi. Ogólna strategia tego odwróconego genetycznego badania przesiewowego polega na wyciszeniu wybranych genów za pomocą morfoliny i zbadaniu wyników specyficznych dla melanocytów. Zawartość melaniny jest analizowana za pomocą obrazowej kwantyfikacji średnich wartości szarości, a następnie potwierdza się za pomocą testu zawartości melaniny. Liczba melanocytów na różnych etapach dojrzewania jest analizowana za pomocą oceny ilościowej opartej na obrazie, a następnie potwierdzana za pomocą analizy FACS. W tym przypadku protokół badań przesiewowych przedstawiono przy użyciu dwóch genów kandydujących, a mianowicie anhydrazy węglanowej 14, zaangażowanej w melanogenezę, oraz wariantu histonu H2AFZ.2 zaangażowanego w specyfikację melanocytów z populacji prekursorów grzebienia nerwowego. Podczas gdy pierwsza z nich zmienia zawartość melaniny, a nie liczbę melanocytów, druga zmienia liczbę określonych melanocytów, a co za tym idzie, zawartość melaniny w zarodku. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zapewnia szczegółowy protokół identyfikacji roli genu kandydującego w pigmentacji i rozróżnienia jego roli w kontrolowaniu liczby melanocytów w porównaniu z zawartością melaniny.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Mikroprobówki</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td>Do przygotowania roztworu MO</td></tr><tr><td>2 ml Mikroprobówki</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>Do mycia etapów w protokole FACS</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9539-500G</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td>Do sortowania komórek</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek Corning</td><td>CLS431751 Do</td><td></td><td>wytwarzania zawiesiny pojedynczej komórki</td></tr><tr><td>Pożywka DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Protokół FACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td></tr><tr><td>Metanosulfonian etylu (Trikaina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>do unieruchamiania ZF do obrazowania</td></tr><tr><td>Dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Do probówek FACS buforu do lizy na zimno</td></tr><tr><td></td><td>Protokół BD-Biosciences</td><td>342065</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Protokół Invitrogen</td><td>10270</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Oprogramowanie pryzmat</td><td>Graphpad Graphstats Technologies</td><td>NA</td><td>Do reprezentacji danych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>NA</td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe (1 ml)</td><td>DispoVan</td><td>NA</td><td>Do manualnej dechorionacji</td></tr><tr><td>Melanina, syntetyczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8631</td><td>Do oznaczania zawartości melaniny</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027-250G</td><td>do unieruchamiania ZF do obrazowania</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gene-tools</td><td>NA</td><td>Do eksperymentów knock-down</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>w celu zahamowania tworzenia melaniny</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Protokół FACS</td></tr><tr><td>Petridish (60 mm)</td><td>Tarsons</td><td>460090</td><td>Dla płytki zarodkowe Fluorek</td></tr><tr><td>fenylometylosulfonylu</td><td>Sigma-Aldrich 10837091001</td><td></td><td>Do buforu do lizy na zimno</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TL1099-500mL</td><td>Do mycia komórek</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53702</td><td>Do dechorionacji</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Do buforu do lizy na zimno</td></tr><tr><td>Osłona płyn</td><td>BD FACSFlowTM</td><td>342003</td><td>Protokół FACS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td>Bufor do lizy na zimno</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td> Do buforu do <td>lizy na zimno</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>1677119</td><td>Do trypsynizacji</td></tr></tbody></table>

odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanocyty to wyspecjalizowane komórki pochodzące z grzebienia nerwowego obecne w skórze naskórka. Komórki te syntetyzują pigment melaniny, który chroni genom przed szkodliwym promieniowaniem ultrafioletowym. Zaburzenia w funkcjonowaniu melanocytów prowadzą do zaburzeń barwnikowych, takich jak piebaldyzm, bielactwo, bielactwo, melasma i czerniak. Danio pręgowany to doskonały system modelowy do zrozumienia funkcji melanocytów. Obecność widocznych pigmentowanych melanocytów, łatwość manipulacji genetycznej i dostępność transgenicznych linii fluorescencyjnych ułatwiają badanie pigmentacji. W badaniu tym wykorzystano linie danio pręgowanego typu dzikiego i transgenicznego, które napędzają ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) pod promotorami mitfa i tyrp1, które oznaczają różne stadia melanocytów. 
Wyciszanie genów kandydujących oparte na morfolinie jest osiągane w celu oceny fenotypowego wyniku pigmentacji larw i ma zastosowanie do badań przesiewowych regulatorów pigmentacji. Protokół ten demonstruje metodę od mikroiniekcji do obrazowania i selekcji fenotypów opartej na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu dwóch genów kandydujących, anhydrazy węglanowej 14 (Ca14) i wariantu histonu (H2afv), w celu kompleksowej oceny wyniku pigmentacji. Co więcej, protokół ten demonstruje segregację genów kandydujących na specyfikatory melanocytów i dyferencjały, które selektywnie zmieniają odpowiednio liczbę melanocytów i zawartość melaniny na komórkę.

Schemat pracy przedstawiony na Rysunku 1 został wykorzystany do przeprowadzenia zaburzeń genetycznych z użyciem morfolino na etapie jednej komórki u danio pręgowanego. Analizę pigmentacji przeprowadzono za pomocą różnych metod, opisanych poniżej. Aby zilustrować reprezentatywne wyniki, zstandardyzowane objętości antysensownych morfolino celujących w geny h2afv oraz ca14 wstrzyknięto do żółtka lub na etapie jednej komórki zarodka danio pręgowanego. Wstępne fenotypowanie w op...

Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.

Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Protokół ten jest połączeniem różnych technik, które umożliwiłyby naukowcom określenie roli genu kandydującego w biologii melanocytów. Jest to holistyczne podejście do osiągnięcia logicznego wnioskowania. Łącząc różne metody, można uniknąć czynników zakłócających i może to pomóc naukowcom w uzyskaniu znaczącego wyniku.Aby rozpocząć analizę, unieruchomij 48 zarodków HPF za pomocą 0,016% trikainy. Zamontuj zarodki za pomocą kilku mililitrów 1,5 do 2% metylocelulozy na szalce Petriego. Pobrać zarodki za pomocą pipety Pasteura i umieścić je w metylocelulozie, aby ograniczyć ruch podczas obrazowania.Aby uzyskać optymalne obrazowanie boczne lub grzbietowe, dostosuj ich położenie z powiększeniem większym niż 5X. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Za pomocą manipulatora ustaw rybę tak, aby wszystkie pięć pasków embrionalnych melanocytów było widocznych jednocześnie.Korzystając z oprogramowania do akwizycji, uchwyć obrazy. Jeśli ryba się obudzi, umieść ją w wodzie z tricainą, aż się ustabilizuje. Korzystając z narzędzia otwierającego w oprogramowaniu ImageJ, otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo.Wybierz narzędzie Kształt odręczny, aby obrysować obszar do analizy. Wybierz opcję ustaw pomiary, kliknij średnią wartość szarości, a następnie obszar. Aby obliczyć średnią wartość szarości dla wybranego obszaru, kliknij M lub przejdź do analizy i wybierz miarę.W zależności od interesującego stadium przenieś zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,6 miligrama na mililitr pronazy. Za pomocą pipety Pasteura przenieś zdekorionowane zarodki na szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków po pięciu do 10 minutach. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz i przenieś około 100 zarodków do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.Odrzuć pożywkę i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego roztworu Ringera do usuwania żółtka. Umieść probówkę na lodzie i wymieszaj zawartość około 20 razy pipetą, aby rozpuścić jarzmo. Odwirować probówki o stężeniu 100 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza dwa razy i odrzucić supernatant.Przenieść odżółkowane zarodki za pomocą jednomililitrowej pipety na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów roztworu trypsyny. Wymieszaj roztwór raz lub dwa razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby zmniejszyć agregację. Przepuść trypsynizowaną zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby zebrać zawiesinę jednokomórkową.Umyj szalki Petriego trypsynizowaną zawiesiną, aby usunąć przylegające komórki z powierzchni. Aby zliczyć fluorescencyjnie znakowane komórki za pomocą cytometru przepływowego, po utworzeniu nowego folderu eksperymentu, narysuj wykres punktowy do przodu i z boku. Wykonaj histogram dla intensywności izotiocyjanianu fluoresceiny.Najpierw załaduj komórki typu wild, aby ustawić przednie i boczne bramki rozproszenia oraz próg FITC. Następnie załaduj komórki wyizolowane z transgenicznych zarodków linii FTYRP GFP, aby policzyć melanocyty. Zamontuj zarodki w 1,5 do 2% metylocelulozie na szalce Petriego.Umieść go pod mikroskopem i ustaw w żądanej orientacji za pomocą końcówki do pipety. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, uzyskaj obrazy. W przypadku zarodków mniejszych niż 24 HPF, przy użyciu 10-krotnego powiększenia, uchwyć cały obraz, natomiast w przypadku zarodków większych niż 24 HPF uzyskaj wiele pól skanowania, a następnie je zmontuj.Po wykonaniu testu, obrazowanie Brightfield po 48 godzinach ujawniło obecność wszystkich pięciu pigmentowanych pasków melanoforu. W stadium 48 HPF obliczono liczbę melanoforów bocznych i stwierdzono, że morfanty h2afv w wariancie histonów wykazywały zmniejszoną liczbę melanoforów w porównaniu z kontrolą. Średnia wartość szarości została zmierzona dla morfantów CA14 i h2afv, co ujawniło, że wartości były wyższe dla wariantów niż dla morfantów kontrolnych.Stosując metodę absorpcji spektrofotometrycznej opartej na wodorotlenku sodu, określono ilościowo zawartość melaniny tam, gdzie morfanty CA14 wykazywały mniejszą zawartość niż morfanty kontrolne. Obrazowanie fluorescencyjne przeprowadzono w celu oceny zmian opartych na morfolinie dla różnych etapów rozwoju melanoforu danio pręgowanego. Liczbę melanoforów w morfantach CA14 i h2afv analizowano za pomocą FACS.Zaobserwowano, że liczba melanoforów w CA14 pozostała niezmieniona, natomiast w h2afv była ona istotnie zmniejszona w porównaniu z morfantem kontrolnym. Obliczono również średnią intensywność fluorescencji na obszar, wykazując, że morfanty h2afv wykazują znaczny spadek wartości w stosunku do morfantów kontrolnych. Dostosowując rybę przed obrazowaniem, upewnij się, że możesz zwizualizować wszystkie pięć pasków melanoforu.Musisz trochę przechylić rybę, aby odróżnić dwa boczne paski. Po ustaleniu roli genu kandydującego w rozwoju melanocytów, możemy wyeliminować gen w sposób specyficzny tkankowo za pomocą technologii CRISPR. Będzie to bardziej ukierunkowane podejście.

reverse-genetic-approach-to-identify-regulators-pigmentation-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy nasze podejście do wyszukiwania potencjalnych elementów enhansera w genach regulowanych rozwojowo oraz ocenę ich funkcji za pomocą mozaikowej transgenezy u rybek danio pręgowanych.

Mozaikowa transgeneza u danio pręgowanego do oceny sekwencji enhancerów

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Odkryj odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji w melanocytach przy użyciu danio pręgowanego. Metoda łączy cytometrię przepływową i spektrofotometrię do analizy zawartości melaniny.

Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów