Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego
March 1st, 2022
Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.
Protokół ten jest połączeniem różnych technik, które umożliwiłyby naukowcom określenie roli genu kandydującego w biologii melanocytów. Jest to holistyczne podejście do osiągnięcia logicznego wnioskowania. Łącząc różne metody, można uniknąć czynników zakłócających i może to pomóc naukowcom w uzyskaniu znaczącego wyniku.
Aby rozpocząć analizę, unieruchomij 48 zarodków HPF za pomocą 0,016% trikainy. Zamontuj zarodki za pomocą kilku mililitrów 1,5 do 2% metylocelulozy na szalce Petriego. Pobrać zarodki za pomocą pipety Pasteura i umieścić je w metylocelulozie, aby ograniczyć ruch podczas obrazowania.
Aby uzyskać optymalne obrazowanie boczne lub grzbietowe, dostosuj ich położenie z powiększeniem większym niż 5X. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Za pomocą manipulatora ustaw rybę tak, aby wszystkie pięć pasków embrionalnych melanocytów było widocznych jednocześnie.
Korzystając z oprogramowania do akwizycji, uchwyć obrazy. Jeśli ryba się obudzi, umieść ją w wodzie z tricainą, aż się ustabilizuje. Korzystając z narzędzia otwierającego w oprogramowaniu ImageJ, otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo.
Wybierz narzędzie Kształt odręczny, aby obrysować obszar do analizy. Wybierz opcję ustaw pomiary, kliknij średnią wartość szarości, a następnie obszar. Aby obliczyć średnią wartość szarości dla wybranego obszaru, kliknij M lub przejdź do analizy i wybierz miarę.
W zależności od interesującego stadium przenieś zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,6 miligrama na mililitr pronazy. Za pomocą pipety Pasteura przenieś zdekorionowane zarodki na szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków po pięciu do 10 minutach. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz i przenieś około 100 zarodków do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.
Odrzuć pożywkę i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego roztworu Ringera do usuwania żółtka. Umieść probówkę na lodzie i wymieszaj zawartość około 20 razy pipetą, aby rozpuścić jarzmo. Odwirować probówki o stężeniu 100 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza dwa razy i odrzucić supernatant.
Przenieść odżółkowane zarodki za pomocą jednomililitrowej pipety na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów roztworu trypsyny. Wymieszaj roztwór raz lub dwa razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby zmniejszyć agregację. Przepuść trypsynizowaną zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby zebrać zawiesinę jednokomórkową.
Umyj szalki Petriego trypsynizowaną zawiesiną, aby usunąć przylegające komórki z powierzchni. Aby zliczyć fluorescencyjnie znakowane komórki za pomocą cytometru przepływowego, po utworzeniu nowego folderu eksperymentu, narysuj wykres punktowy do przodu i z boku. Wykonaj histogram dla intensywności izotiocyjanianu fluoresceiny.
Najpierw załaduj komórki typu wild, aby ustawić przednie i boczne bramki rozproszenia oraz próg FITC. Następnie załaduj komórki wyizolowane z transgenicznych zarodków linii FTYRP GFP, aby policzyć melanocyty. Zamontuj zarodki w 1,5 do 2% metylocelulozie na szalce Petriego.
Umieść go pod mikroskopem i ustaw w żądanej orientacji za pomocą końcówki do pipety. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, uzyskaj obrazy. W przypadku zarodków mniejszych niż 24 HPF, przy użyciu 10-krotnego powiększenia, uchwyć cały obraz, natomiast w przypadku zarodków większych niż 24 HPF uzyskaj wiele pól skanowania, a następnie je zmontuj.
Po wykonaniu testu, obrazowanie Brightfield po 48 godzinach ujawniło obecność wszystkich pięciu pigmentowanych pasków melanoforu. W stadium 48 HPF obliczono liczbę melanoforów bocznych i stwierdzono, że morfanty h2afv w wariancie histonów wykazywały zmniejszoną liczbę melanoforów w porównaniu z kontrolą. Średnia wartość szarości została zmierzona dla morfantów CA14 i h2afv, co ujawniło, że wartości były wyższe dla wariantów niż dla morfantów kontrolnych.
Stosując metodę absorpcji spektrofotometrycznej opartej na wodorotlenku sodu, określono ilościowo zawartość melaniny tam, gdzie morfanty CA14 wykazywały mniejszą zawartość niż morfanty kontrolne. Obrazowanie fluorescencyjne przeprowadzono w celu oceny zmian opartych na morfolinie dla różnych etapów rozwoju melanoforu danio pręgowanego. Liczbę melanoforów w morfantach CA14 i h2afv analizowano za pomocą FACS.
Zaobserwowano, że liczba melanoforów w CA14 pozostała niezmieniona, natomiast w h2afv była ona istotnie zmniejszona w porównaniu z morfantem kontrolnym. Obliczono również średnią intensywność fluorescencji na obszar, wykazując, że morfanty h2afv wykazują znaczny spadek wartości w stosunku do morfantów kontrolnych. Dostosowując rybę przed obrazowaniem, upewnij się, że możesz zwizualizować wszystkie pięć pasków melanoforu.
Musisz trochę przechylić rybę, aby odróżnić dwa boczne paski. Po ustaleniu roli genu kandydującego w rozwoju melanocytów, możemy wyeliminować gen w sposób specyficzny tkankowo za pomocą technologii CRISPR. Będzie to bardziej ukierunkowane podejście.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada rolę kandydatów do genów pigmentacji w biologii melanocytów przy użyciu systemu modelowego na daniu rybki. Za pomocą różnych technik obrazowania i testów badania identyfikują kluczowe regulatorzy zawartości melaniny i liczby melanocytów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Rozwój melanocytów
- Genetyka pigmentacji
- Danio pręgowane jako organizm modelowy
Tło
- Zrozumienie funkcji molekularnych genów pigmentacji jest niezbędne do rozszyfrowania różnic w kolorze skóry.
- Czynniki zakłócające w badaniach mogą utrudniać dokładną ocenę funkcji genów.
- Zarodki danio pręgowanego zapewniają skuteczny model do badania wczesnych procesów rozwojowych w pigmentacji.
Stosowane metody
- Unieruchomienie zarodków i techniki obrazowania
- Danio pręgowane jako model biologiczny
- Cytometria przepływowa do liczenia melanocytów i testy spektrofotometryczne na zawartość melaniny
Główne wyniki
- Uważano, że liczba melanoforów jest zmniejszona w przypadku morphantów h2afv w porównaniu do kontroli.
- Morphanty CA14 wykazywały mniejszą zawartość melaniny niż morphanty kontrolne.
- Fluorescencyjne obrazowanie potwierdziło różnice rozwojowe w melanoforach.
Wnioski
- Wyniki ilustrują znaczenie określonych genów pigmentacji w rozwoju melanocytów.
- To badanie ma szersze implikacje dla zrozumienia wpływów genetycznych na pigmentację.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
