Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego
1 marca 2022
Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.
Protokół ten jest połączeniem różnych technik, które umożliwiłyby naukowcom określenie roli genu kandydującego w biologii melanocytów. Jest to holistyczne podejście do osiągnięcia logicznego wnioskowania. Łącząc różne metody, można uniknąć czynników zakłócających i może to pomóc naukowcom w uzyskaniu znaczącego wyniku.
Aby rozpocząć analizę, unieruchomij 48 zarodków HPF za pomocą 0,016% trikainy. Zamontuj zarodki za pomocą kilku mililitrów 1,5 do 2% metylocelulozy na szalce Petriego. Pobrać zarodki za pomocą pipety Pasteura i umieścić je w metylocelulozie, aby ograniczyć ruch podczas obrazowania.
Aby uzyskać optymalne obrazowanie boczne lub grzbietowe, dostosuj ich położenie z powiększeniem większym niż 5X. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Za pomocą manipulatora ustaw rybę tak, aby wszystkie pięć pasków embrionalnych melanocytów było widocznych jednocześnie.
Korzystając z oprogramowania do akwizycji, uchwyć obrazy. Jeśli ryba się obudzi, umieść ją w wodzie z tricainą, aż się ustabilizuje. Korzystając z narzędzia otwierającego w oprogramowaniu ImageJ, otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo.
Wybierz narzędzie Kształt odręczny, aby obrysować obszar do analizy. Wybierz opcję ustaw pomiary, kliknij średnią wartość szarości, a następnie obszar. Aby obliczyć średnią wartość szarości dla wybranego obszaru, kliknij M lub przejdź do analizy i wybierz miarę.
W zależności od interesującego stadium przenieś zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,6 miligrama na mililitr pronazy. Za pomocą pipety Pasteura przenieś zdekorionowane zarodki na szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków po pięciu do 10 minutach. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz i przenieś około 100 zarodków do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.
Odrzuć pożywkę i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego roztworu Ringera do usuwania żółtka. Umieść probówkę na lodzie i wymieszaj zawartość około 20 razy pipetą, aby rozpuścić jarzmo. Odwirować probówki o stężeniu 100 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza dwa razy i odrzucić supernatant.
Przenieść odżółkowane zarodki za pomocą jednomililitrowej pipety na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów roztworu trypsyny. Wymieszaj roztwór raz lub dwa razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby zmniejszyć agregację. Przepuść trypsynizowaną zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby zebrać zawiesinę jednokomórkową.
Umyj szalki Petriego trypsynizowaną zawiesiną, aby usunąć przylegające komórki z powierzchni. Aby zliczyć fluorescencyjnie znakowane komórki za pomocą cytometru przepływowego, po utworzeniu nowego folderu eksperymentu, narysuj wykres punktowy do przodu i z boku. Wykonaj histogram dla intensywności izotiocyjanianu fluoresceiny.
Najpierw załaduj komórki typu wild, aby ustawić przednie i boczne bramki rozproszenia oraz próg FITC. Następnie załaduj komórki wyizolowane z transgenicznych zarodków linii FTYRP GFP, aby policzyć melanocyty. Zamontuj zarodki w 1,5 do 2% metylocelulozie na szalce Petriego.
Umieść go pod mikroskopem i ustaw w żądanej orientacji za pomocą końcówki do pipety. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, uzyskaj obrazy. W przypadku zarodków mniejszych niż 24 HPF, przy użyciu 10-krotnego powiększenia, uchwyć cały obraz, natomiast w przypadku zarodków większych niż 24 HPF uzyskaj wiele pól skanowania, a następnie je zmontuj.
Po wykonaniu testu, obrazowanie Brightfield po 48 godzinach ujawniło obecność wszystkich pięciu pigmentowanych pasków melanoforu. W stadium 48 HPF obliczono liczbę melanoforów bocznych i stwierdzono, że morfanty h2afv w wariancie histonów wykazywały zmniejszoną liczbę melanoforów w porównaniu z kontrolą. Średnia wartość szarości została zmierzona dla morfantów CA14 i h2afv, co ujawniło, że wartości były wyższe dla wariantów niż dla morfantów kontrolnych.
Stosując metodę absorpcji spektrofotometrycznej opartej na wodorotlenku sodu, określono ilościowo zawartość melaniny tam, gdzie morfanty CA14 wykazywały mniejszą zawartość niż morfanty kontrolne. Obrazowanie fluorescencyjne przeprowadzono w celu oceny zmian opartych na morfolinie dla różnych etapów rozwoju melanoforu danio pręgowanego. Liczbę melanoforów w morfantach CA14 i h2afv analizowano za pomocą FACS.
Zaobserwowano, że liczba melanoforów w CA14 pozostała niezmieniona, natomiast w h2afv była ona istotnie zmniejszona w porównaniu z morfantem kontrolnym. Obliczono również średnią intensywność fluorescencji na obszar, wykazując, że morfanty h2afv wykazują znaczny spadek wartości w stosunku do morfantów kontrolnych. Dostosowując rybę przed obrazowaniem, upewnij się, że możesz zwizualizować wszystkie pięć pasków melanoforu.
Musisz trochę przechylić rybę, aby odróżnić dwa boczne paski. Po ustaleniu roli genu kandydującego w rozwoju melanocytów, możemy wyeliminować gen w sposób specyficzny tkankowo za pomocą technologii CRISPR. Będzie to bardziej ukierunkowane podejście.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę kandydackich genów pigmentacji w biologii melanocytów z wykorzystaniem modelu danio pręgowanego. Dzięki zastosowaniu różnych technik obrazowania i testów, praca identyfikuje kluczowe regulatory zawartości melaniny oraz liczby melanocytów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Rozwój melanocytów
- Genetyka pigmentacji
- Danio pręgowany jako organizm modelowy
Wstęp
- Zrozumienie funkcji molekularnych genów pigmentacji jest niezbędne do rozszyfrowania zmienności koloru skóry.
- Czynniki zakłócające w badaniach mogą utrudniać dokładną ocenę funkcji genów.
- Zarodki ryby danio stanowią skuteczny model do badania wczesnych procesów rozwojowych w pigmentacji.
Zastosowane metody
- Imobilizacja embrionów i techniki obrazowania
- Danio pręgowany jako model biologiczny
- Cytometria przepływowa do zliczania melanocytów i analizy spektrofotometryczne zawartości melaniny
Główne wyniki
- U morfantów h2afv zaobserwowano zmniejszoną liczbę melanoforów w porównaniu z grupą kontrolną.
- Morfanty CA14 wykazały niższą zawartość melaniny niż morfanty kontrolne.
- Obrazowanie fluorescencyjne potwierdziło różnice rozwojowe w melanoforach.
Wnioski
- Wyniki te ilustrują znaczenie konkretnych genów pigmentacji w rozwoju melanocytów.
- Badania te mają szersze implikacje dla zrozumienia wpływów genetycznych na pigmentację.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia systematyczną analizę regulatorów genetycznych w rozwoju melanocytów, wspierając walidację celów w schorzeniach związanych z pigmentacją. Poprzez połączenie obrazowania fenotypowego, cytometrii przepływowej oraz testów biochemicznych, zapewnia on ilościowe wyniki pozwalające na wczesne ograniczenie ryzyka związanego z hipotezami mechanistycznymi w fazie odkrywania. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w rozróżnianiu genów wpływających na liczbę melanocytów od tych wpływających na zawartość melaniny w komórce, co pozwala na optymalizację priorytetów w zakresie doboru miejscowych lub systemowych modulatorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalny podział genów kandydackich na specyfikatory i dyferencjatory melanocytów w oparciu o wpływ na liczbę komórek w stosunku do syntezy pigmentu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje wyciszanie za pomocą morpholino u larw zebrafish do szybkiej oceny skutków fenotypowych w szlakach pigmentacji.
- Wartość naukowa: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie perturbacji genów z mierzalnymi zmianami w liczbie melanoforów i zawartości melaniny.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ustandaryzowane wyniki ilościowe, w tym średnią wartość szarości z obrazowania w polu jasnym oraz stężenie melaniny za pomocą spektrofotometrii.
- Wartość operacyjna: Integruje liczenie melanocytów metodą FACS z obrazowaniem, co umożliwia wysokoprzepustowy screening fenotypowy modulatorów genetycznych.
- Wartość naukowa: Ułatwia odtwarzalność testu dzięki zdefiniowanemu etapowi rozwoju (48 HPF), immobilizacji i parametrom obrazowania dla porównań podłużnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystuje transgeniczne reportery GFP (mitfa, tyrp1) do śledzenia etapów specyfikacji i różnicowania melanocytów istotnych dla biologii pigmentacji u ludzi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podział wyników na klasy mechanistyczne (specyfikatory i różnicowniki), co pozwala ukierunkować późniejszą walidację w modelach ssaków.
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny z punktu widzenia chorób do oceny genów zaangażowanych w szlaki powstawania piebaldyzmu, albinizmu lub bielactwa.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie w fazie od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących kandydatów, w której trafienia genetyczne są walidowane pod kątem ich wpływu na biologię melanocytów przed przeprowadzeniem przesiewu związków lub badaniami mechanistycznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację celu poprzez izolację efektów specyficznych dla genów w rozwoju melanocytów za pomocą fenokopii morfolinowej i obrazowania ilościowego.
- Screening: Umożliwia stworzenie gotowych do analizy modeli ryb zebrafish z reporterami fluorescencyjnymi w celu skalowalnej oceny modulatorów genetycznych lub małocząsteczkowych.
- Analityka: Dostarcza wieloparametryczne wyniki — liczbę melanoforów (FACS), zawartość melaniny (spektrofotometria) oraz rozkład przestrzenny (obrazowanie) — w celu wsparcia selekcji hitów w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje konserwatywne markery melanocytów (mitfa, tyrp1), aby powiązać odkrycia u ryb zebrafish z mechanizmami pigmentacji u ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do screeningu genetyki pigmentu, którą można ponownie wykorzystać w różnych rodzinach celów i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez odróżnienie genów modyfikujących specyfikację melanocytów od tych, które wpływają na produkcję pigmentu w pojedynczej komórce.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły manipulacji zarodkami, obrazowania i dysocjacji w celu zapewnienia powtarzalności w różnych laboratoriach i kampaniach przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), zapewniając wczesną pewność fenotypową dotyczącą mechanizmu celu przed zainwestowaniem w chemię medyczną.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o genetyczną walidację fenotypów specyficznych dla melanocytów.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Do dokładnej oceny fenotypowej wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu embriologii danio pręgowanego, mikroiniekcji oraz projektowania morfolino.
- Wykorzystywane instrumentarium obejmuje mikroskopy fluorescencyjne, cytometry przepływowe i spektrofotometry do wieloparametrycznego odczytu.
- Standaryzacja między zespołami wymaga zsynchronizowanego określania stadiów rozwoju (HPF), protokołów unieruchamiania oraz ustawień obrazowania w celu zminimalizowania zmienności.
- Adaptacja do innych modeli może wymagać walidacji konserwowanych reporterów sterowanych promotorami oraz punktów końcowych fenotypowych.
- Ograniczenia obejmują efekty poza celem morfolino oraz przejściowy knockdown, co necessitates potwierdzenie celu za pomocą CRISPR lub linii mutantów.
