Name: Plaquing wirusów opryszczki pospolitej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj metodę plakowania wirusów opryszczki pospolitej w celu ilościowego oznaczania wirusa. Technika ta umożliwia ocenę skuteczności leków przeciwwirusowych w badaniach wirusologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy niezliczonym studentom w naszych laboratoriach (PJD i BJM), którzy pracowali z nami przez lata, doskonaląc te metody. Specjalne podziękowania dla Stana Persona, pod którego okiem ta metodologia została po raz pierwszy opracowana. Praca ta była częściowo wspierana przez fundusz wsparcia badań licencjackich Towson University Fisher College of Science and Math oraz grant NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Wyłączną odpowiedzialność za te treści ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych National Institutes of Health.

Wszystkie procedury z komórkami Vero i żywymi wirusami opryszczki zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Towson. Uogólniony schemat tych procedur jest przedstawiony w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
1. Zasiewanie komórek Vero
<ol>
	<li>Dzień przed rozpoczęciem testu płytki miażdżycowej trypsynizuj komórki Vero i ponownie zawieś je w zwykłym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) i uzupełnij zgodnie ze standardową metodologią hodowli komórek19. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w 10 ml DMEM na kolbę T-75 zlewających się komórek Vero (~107 komórek). 
	UWAGA: DMEM jest używany do testów płytek miażdżycowych zamiast alfa-MEM, ponieważ nieznacznie spowalnia tempo wzrostu komórek i sprzyja lepszym wynikom testów płytkowych.</li>
	<li>Policz komórki preferowaną metodą (np. standardowym hemocytometrem z wykluczeniem błękitu trypanowego)19.</li>
	<li>Wysiewaj komórki w 4 x 106 komórek/płytkę; w przypadku HSV-2 użyj 6-dołkowych płytek z 2,5 ml DMEM (z suplementami) na dołek; a w przypadku HSV-1 użyj 12-dołkowych płytek z 1,25 ml DMEM (z suplementami) na dołek. 
	UWAGA: Liczba komórek powinna być stała niezależnie od użytej płytki, chociaż rozmiar studzienek ma znaczenie dla dokładności testu płytki. Istotne jest, aby komórki były równomiernie rozmieszczone, co można najskuteczniej osiągnąć, przesuwając płytkę do przodu i do tyłu, a nie w sposób okrężny.</li>
	<li>Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. 
	UWAGA: Wilgotność utrzymuje się za pomocą garnka z wodą destylowaną zawierającą algicyd na dnie inkubatora.</li>
</ol>
2. Rozcieńczenie próbki
<ol>
	<li>Zakończ rozcieńczanie próbki i dodawanie wirusa do komórek podczas jednej sesji laboratoryjnej. 
	UWAGA: HSV-1 i -2 są zakaźne dla ludzi i muszą być traktowane w odpowiednim zabezpieczeniu biologicznym (BSL-2). Wszystkie materiały, które mają kontakt z wirusem, należy przechowywać oddzielnie i zdezynfekować czynnikiem czwartorzędowym o rozcieńczeniu 1/256 (patrz Tabela materiałów), jodoforem, wybielaczem lub silnym detergentem jonowym (np. SDS) przed wyjęciem ich z komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Dzień po wysiewie komórek Vero, seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę wirusa, która ma zostać umieszczona w 1x PBS; zazwyczaj stosuje się 10-krotne rozcieńczenia w celu najbardziej precyzyjnego śledzenia.</li>
	<li>Rozcieńczenia te należy przeprowadzić przez 10-4 (dla niskich stężeń wirusów) lub przez 10-9 (dla oczekiwanych próbek o wyższym mianie), pozostawiając co najmniej 1 ml każdej próbki do samego testu płytki.</li>
	<li>Przechowywać wszystkie rozcieńczenia wirusa na lodzie (nie dłużej niż 1 godzinę) do momentu, gdy będą gotowe do dodania tych rozcieńczonych próbek wirusa do komórek.</li>
</ol>
3. Dodanie wirusa do komórek
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z jednego lub dwóch dołków za pomocą pipety. 
	UWAGA: Nie używaj aspiratora, ponieważ usuwa on zbyt dużo płynu z monowarstwy komórek i wysusza komórki. Jedną z kluczowych kwestii jest zapewnienie, że monowarstwa komórkowa pozostaje nawodniona przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli komórki wyschną, w ostatnim kroku zmyją płytkę i wygenerują bezużyteczne dane. Dlatego przetwarzaj tylko jedną lub dwie studzienki na raz, aby zmniejszyć tę możliwość.</li>
	<li>Ostrożnie dodać rozcieńczoną próbkę wirusa (100-400 μl i 50-200 μl próbki wirusa stosuje się odpowiednio do płytek 6-dołkowych i 12-dołkowych) kroplami do każdej monowarstwy, dodając krople po boku każdej studzienki. Powtarzaj proces dla każdego jednego lub dwóch dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona próbkami wirusa, które są płytkowane. 
	UWAGA: Dodanie kropli do środka studzienki może nieumyślnie złuszczyć komórki z podłoża.</li>
	<li>Delikatnie kołysz ręcznie całą płytkę, aby upewnić się, że PBS zawierający wirusa pokrywa całą monowarstwę komórek w każdym dołku, a następnie umieść płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adsorpcję wirusa.</li>
	<li>Co 10 minut w ciągu 1 godziny wyjmować płytkę z inkubatora, delikatnie ją ponownie kołysać, aby wirus rozprzestrzeniał się bardziej równomiernie w każdym dołku, a następnie umieszczać ją z powrotem w inkubatorze. 
	UWAGA: Każdy eksperyment będzie dyktował liczbę powtórzeń i jakie rozcieńczenia są używane; Preferencje czytelnika dyktują tę decyzję.</li>
	<li>Aby zmniejszyć możliwość przypadkowego zliczenia niewchłoniętego inokulum, należy usunąć próbkę wirusa ze studzienek za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1000 μl i umieścić ją w zlewce na odpady. 
	UWAGA: Ponownie, ta procedura jest przeprowadzana tylko z jednym lub dwoma dołkami na raz, aby utrzymać nawodnienie monowarstwy komórkowej.</li>
	<li>Umieścić 2,5 ml nakładki metylocelulozowej (rozpuścić 5% metylocelulozy w/w w 100 ml PBS, autoklawować przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 15 psi w cyklu cieczowym, następnie dodać 375 ml DMEM plus 25 ml FBS).</li>
	<li>Gdy cała płytka zawiera nakładkę, umieść ją z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić wzrost przez dwa dni. 
	UWAGA: Jeśli wirus i komórki mogą rosnąć przez trzy dni, nawet w DMEM plus suplementy, może dojść do znacznej utraty komórek w monowarstwie, co zagrozi ostatecznym danym.</li>
	<li>Zdezynfekuj zlewkę na odpady, zwykle z dodatkiem wybielacza, jodoforu lub podobnego środka wirusobójczego, przed wyjęciem jej z szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
4. Barwienie blaszek miażdżycowych
<ol>
	<li>Po dwudniowej inkubacji usunąć nakładkę metylocelulozy za pomocą pipety, ponownie po jednym lub dwóch dołkach na raz i umieścić ją w zlewce na odpady.</li>
	<li>Dodaj ~ 2 ml 1% fioletu krystalicznego (patrz Tabela materiałów) w 50% etanolu do każdego dołka, aby zabarwić płytki. 
	UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie każdej ostatniej kropli nakładki.</li>
	<li>Inkubować płytkę ze wszystkimi studzienkami wypełnionymi plamą przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W tym momencie należy zdezynfekować zlewkę na odpady, jak opisano powyżej w kroku 3.8.</li>
	<li>Energicznie umyj talerze wodą z kranu, aż spływ będzie czysty. 
	UWAGA: Delikatny strumień wody nie jest wystarczająco energiczny; Wymagane jest pełne ciśnienie z uchwytu zlewozmywaka laboratoryjnego.</li>
	<li>W tym momencie należy upewnić się, że istnieją około 10-krotne różnice w liczbie blaszek w każdej serii rozcieńczeń.</li>
	<li>Pozostaw płytki do wyschnięcia przez noc do góry nogami, po czym można policzyć poszczególne płytki.</li>
</ol>
5. Liczenie blaszek i określanie miana wirusa
<ol>
	<li>Niezależnie od podejścia (patrz UWAGA poniżej), pomnóż liczbę blaszek przez współczynnik rozcieńczenia (np. jeśli płytki zostałyby policzone w studzience 10-4, liczba blaszek zostałaby pomnożona przez 104). 
	UWAGA: Chociaż liczenie w zakresie 10-100 płytek jest przydatne5, liczenie studzienek z 30-300 tabliczkami jest nieco bardziej wiarygodne i uwzględnia rozcieńczenia około 1/2 log zamiast rozcieńczeń pełnych log.</li>
	<li>Podziel tę liczbę przez objętość inokulum (jak powyżej w kroku 3.2) i uśrednij wszystkie studzienki, które mają blaszki w podanym zakresie, aby uzyskać najdokładniejsze miano HSV w oryginalnej próbce.</li>
	<li>Należy wykonać obliczenia w krokach od 5.3.1 do 5.3.5, biorąc pod uwagę wykorzystanie danych próbnych z tabeli 1.
	<ol>
		<li>Rozważ tylko studnie z 30-300 płytkami (krok 5.1). W związku z tym w tabeli 1 należy używać tylko kolumny 10–5 dla powtórzeń 1, 2 i 3.</li>
		<li>Weź liczbę blaszek w danym rozcieńczeniu i pomnóż przez odwrotność współczynnika rozcieńczenia. W związku z tym kolumna 10-5 próbki 1 przechodzi od 81 blaszek w rozcieńczeniu 10-5 do 81 blaszek razy 105.</li>
		<li>Następnie podziel tę liczbę przez objętość (w ml) rozcieńczenia wirusa dodanego do komórek w tej studzience. Zakładając, że dane dotyczące HSV-1 w Tabeli 1 pochodzą z płytki 12-dołkowej, 0,2 ml byłoby najbardziej odpowiednim pomiarem. Stąd obliczenie z kroku 5.3.2 staje się 81 x 105 podzielone przez 0,2 ml lub 4,0 x 107 PFU/ml HSV-1.</li>
		<li>Powtórz ten proces dla wszystkich przydatnych danych i średniej. W związku z tym należy przeprowadzić obliczenia w ppkt 5.3.2-5.3.3 na wszystkich próbkach w kolumnie 10-5, zakładając, że pochodzą one z tej samej próbki wirusa, a kontrpróby biologiczne przeprowadzono w celu uzyskania najdokładniejszego pomiaru miana. W przypadku podanym w tabeli 1 należy uzyskać średnią 4,0 x 107, 2,1 x 107 i 2,6 x 107 PFU/ml, aby uzyskać końcowe średnie miano 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml dla tej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimmock%2C+N+%22Introduction+to+Moden+Virology.+6th+end%22">Introduction to Moden Virology. 6th end</a>. , Wiley-Blackwell. (2007).</li>
<li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahy%2C+B+%22Topley+and+Wilson%27s+Microbiology+and+Microbial+Infections.+9th+edn%22">Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn</a>. 1, Arnold. (1998).</li>
<li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophage+particles%3A+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriophage%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li>
<li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro%3B+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li>
<li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathology+of+virus+infections%3A+particular+reference+to+tissue+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578(2020).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li>
<li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+%28Earle%29+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li>
<li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li>
<li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li>
<li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Kansenshogaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li>
<li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Jouranl+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li>
<li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li>
<li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-%28ethylene+co-vinyl+acetate%29+rings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391(2020).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications.+7th+edn%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63(2006).</li>
<li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+counter%3A+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201(2016).</li>
<li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen%3A+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li>
<li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li>
<li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li>
<li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+herpes+simplex+virus%3A+is+PCR+the+new+gold+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Jouranl+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Kärber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+for+Experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Method+of+%27Right+and+Wrong+Cases%27+%28Constant+Stimuli%29+without+Gauss%27s+formula%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li>
<li>Ryu, W. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyu%2C+W-S+%22Molecular+Virology+of+Human+Pathogenic+Viruses.+1st+edn%22">Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn</a>. , Academic Press. (2017).</li>
<li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus%3A+generation%2C+quantification%2C+propagation%2C+purification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).</li>
<li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li>
<li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+isolation%2C+purification%2C+and+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li>
<li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Chociaż testy płytek miażdżycowych są prawie tak stare, jak sama hodowla komórek ssaków, wydaje się, że każde laboratorium ma swój własny zestaw protokołów do wykonania tego podstawowego testu 5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <...

Początki testów płytek wirusowych sięgają pierwszych odkryć wirusów w latach 90. XIX wieku1. Wirus mozaiki tytoniu został najpierw wyizolowany i przekazany na liściach tytoniu, gdzie poszczególne miejsca infekcji można było rozpoznać i określić ilościowo jako pochodzące z pojedynczej, żywej jednostki wirusa2, później zidentyfikowanej jako virion2. Późniejsze badania nad bakteriami i bakteriofagami udoskonaliły techniki stosowane do plazelizacji tych wirusów, w tym bakterie w środkowej fazie wzrostu, seryjne rozcieńczanie próbek bakteriofagów i górny agar z późniejszą wizualizacją dosłownych (zwanych blaszkami) w bakteryjnym trawniku3.
Plaquing wirusów zwierzęcych opóźniał ekscytujące badania prowadzone na bakteriofagach, głównie dlatego, że metody wymagane do hodowli komórek ssaków w hodowli nie zostały opracowane aż do lat 40. XX wieku4. Jednak pojawienie się rosnących komórek mysich pod nieobecność całego organizmu gospodarza4 zapoczątkowało nową erę w zdolności do hodowli i liczenia wirusów. Prace te zostały rozszerzone o namnażanie i oznaczanie ilościowe wirusa zachodniego zapalenia mózgu i rdzenia koni w komórkach kurczaka oraz wirusa polio w komórkach ludzkich5,6. Wraz z rozwojem sfery komórek ssaków nadających się do hodowli, mnogość różnych komórek gospodarza dla różnych infekcji wirusowych dała światu róg obfitości możliwości badania wszelkiego rodzaju wirusów7. Obejmowało to namnażanie i kwantyfikację ludzkich herpeswirusów, w szczególności wirusa opryszczki pospolitej-1 (HSV-1) i -2 (HSV-2), które powodują zmiany śluzówkowo-skórne8. Co ważne, wszystkie testy płytek miażdżycowych są zależne od istnienia żywych wirionów, które mogą wnikać do komórek gospodarza w sposób zapośredniczony przez receptor w próbce9. Niezależnie od wszechobecności i mnogości publikacji na temat wykonywania testów płytki nazębnej5,10,11,12,13,14,15,16, te metody dla HSV-1/-2 są mieszanką zarówno sztuki, jak i nauki; Nie można przeprowadzić testu bez należytej dbałości o każdy szczegół w protokole, ani nie można wykonać udanego testu bez krytycznego oka do subtelności w procesie. Manuskrypt ten przedstawia jedną z najbardziej konsekwentnie odtwarzalnych metod oznaczania płytek HSV-1/-2, z precyzyjnymi szczegółami dotyczącymi sztuki testu, które są rzadko omawiane.
Ten obecny protokół niezawodnie uzyskuje liczbę żywych jednostek tworzących płytki nazębne (PFU) dla HSV-1 i -2. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu komórek Vero (przekształconych komórek nabłonka nerki afrykańskiej zielonej małpy) przy niskim pasażu (poniżej pasażu numer 155) i rutynowo hodowanych w alpha-MEM17 uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), L-alanylo-L-glutaminą i mieszaniną antybiotykowo-przeciwgrzybiczą18. Komórki Vero są standardowo rozmnażane w tym pożywce dwa do trzech razy w tygodniu w rozcieńczeniu 1/5 za każdym razem.

<table><tbody><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Lonza</td><td>12169F</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/przeciwgrzybicze</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet krystaliczny</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2193214</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (bez Mg++ lub Ca++)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Millipore-Sigma</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamina (Glutamax)</td><td></td>Hemacytometr <td>Gibco</td> GS07F161BA <td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher</td><td>02-671-54</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Millipore-Sigma</td><td>27-441-0</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik czwartorzędowy (Lizol I.C.)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9645698</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr></tbody></table>

plaquing wirusów opryszczki pospolitej

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Istnieje wiele opublikowanych protokołów do zwalczania wirusów, w tym odniesienia do metodologii w podstawowej literaturze. Jednak plakowanie wirusów może być trudne do wykonania, wymagając skupienia się na jego specyfikacjach i udoskonaleniu. Jest to niezwykle trudna metoda do opanowania dla nowych uczniów, głównie dlatego, że wymaga skrupulatnej dbałości o najdrobniejsze szczegóły. Ta demonstracja plakowania wirusów opryszczki pospolitej powinna pomóc tym, którzy przez lata zmagali się z wizualizacją metody, zwłaszcza jej niuansów. Chociaż manuskrypt ten opiera się na tych samych zasadach standardowej metodologii plaquingu, różni się tym, że zawiera szczegółowy opis (1) najlepszego obchodzenia się z komórkami gospodarza, aby uniknąć zakłóceń podczas procesu, (2) bardziej użytecznego lepkiego podłoża niż agaroza w celu ograniczenia dyfuzji wirionów oraz (3) prostej procedury utrwalania i barwienia, która daje wiarygodne, powtarzalne wyniki. Co więcej, dołączony film pomaga zademonstrować subtelne różnice w procesie, które często są pomijane podczas instruowania innych na temat przeprowadzania testów płytki nazębnej.

Tabela 1 przedstawia eksperyment, który przyniósł optymalne wyniki. Wszystkie rozcieńczenia 10-krotne wykazują w przybliżeniu 10-krotny spadek liczby placków. Tego rodzaju dane można zaobserwować również na Rysunku 2, który przedstawia rzeczywisty test plackowy, w którym policzalna liczba placków w trzech powtórzeniach mieściła się w zakresie 10-4. To samo można zauważyć na Rysunku 3, w górnym rzędzie, gdzie policzalna liczba placków ...

Plaquing to rutynowa metoda używana do ilościowego oznaczania żywych wirusów w populacji. Chociaż plaqueing jest często nauczany w różnych programach nauczania mikrobiologii z bakteriami i bakteriofagami, plaqueing wirusów ssaków jest bardziej złożony i czasochłonny. Protokół ten opisuje procedury, które działają niezawodnie w przypadku regularnej pracy z wirusami opryszczki pospolitej.

Plaquing wirusów opryszczki pospolitej

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Protokół pomaga uczniom wyraźnie zidentyfikować poszczególne infekcje i łatwo wykonać test, dzięki czemu ilościowe określenie miana wirusa jest bardziej efektywne. Protokół ten obejmuje prostą procedurę utrwalania i barwienia, która daje wiarygodne i powtarzalne wyniki. Metoda ta może zapewnić wgląd w dokładność i skuteczność leczenia przeciwwirusowego przeciwko chorobom.Trudniejszymi przeszkodami w tym protokole plakowania jest liczba komórek na płytkach wysiewających, upewniając się, że komórki nie są przepełnione, wysychają ani nie ulegają zarysowaniu podczas całego procesu. Trudności może również należeć do ogólnej skrupulatności tego protokołu. Jednak praktyka jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do sukcesu tego eksperymentu.Na początek zakończ rozcieńczanie próbki poprzez dodawanie wirusa do komórek podczas jednej sesji laboratoryjnej. Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę wirusa, która jest plaszkowana w PBS. Zazwyczaj używaj 10-krotnych rozcieńczeń, aby uzyskać najbardziej precyzyjne śledzenie.Trzymaj wszystkie rozcieńczenia wirusa na lodzie, aż będą gotowe do dodania tych rozcieńczonych próbek wirusa do komórek. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z jednego lub dwóch dołków za pomocą pipety. Ostrożnie dodawać rozcieńczoną próbkę wirusa kroplami do każdej monowarstwy komórek kroplami przez bok każdej studzienki.Powtarzaj proces dla każdego jednego lub dwóch dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona próbkami wirusa, które są platerowane. Delikatnie kołysz ręcznie całą płytkę. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby umożliwić adsorpcję wirusa.Po każdych 10 minutach wyjmuj płytkę z inkubatora, delikatnie kołysz nią ponownie, aby wirus rozprzestrzeniał się bardziej równomiernie w każdym dołku, a następnie umieść ją z powrotem w inkubatorze. Aby zmniejszyć możliwość przypadkowego zliczenia niewchłoniętego inokulum, należy usunąć próbkę wirusa ze studzienek za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i wyrzucić próbkę do zlewki na odpady. Umieść 2,5 mililitra nakładki metylocelulozowej na płytce i umieść ją z powrotem w inkubatorze.Zdezynfekuj zlewkę na odpady, zwykle z dodatkiem wybielacza, jodoforu lub podobnego środka wirusobójczego, przed wyjęciem jej z szafki bezpieczeństwa biologicznego. Po dwudniowej inkubacji usunąć nakładkę metylocelulozy z jednej lub dwóch studzienek naraz za pomocą pipety i umieścić ją w zlewce na odpady. Dodaj około dwóch mililitrów 1% fioletu krystalicznego w 50% etanolu do każdej studzienki.Inkubuj płytkę ze wszystkimi studzienkami wypełnionymi plamą przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W tym momencie zdezynfekować zlewkę na odpady, jak pokazano powyżej. Energicznie umyj talerze wodą z kranu, aż spływ będzie czysty.Upewnij się, że istnieją około 10-krotne różnice w liczbie blaszek w każdej serii rozcieńczeń. Rysunek przedstawia 10-krotny spadek liczby blaszek, w którym policzalna liczba blaszek spadła w zakresie od 10 do minus 4 dla wszystkich trzech powtórzeń. Pierwsze trzy obrazy na rysunku przedstawiają blaszki w rozcieńczeniu od 10 do minus trzy.Jednak dolny wiersz pokazuje wyniki, gdy test płytki nazębnej nie jest dobrze przeprowadzony. Jest bardzo niewiele blaszek widocznych po rozcieńczeniu w widocznych obszarach wokół góry, gdzie komórki Vero całkowicie uniosły się z podłoża. Podobnie, rysunek ten pokazuje problemy z wysychaniem komórek lub niewłaściwym obchodzeniem się z nimi podczas testu płytki nazębnej.Jednak liczba ta krytycznie pokazuje słabe wysiewanie komórek Vero. Każda studzienka ma ciemniejsze fioletowe plamy, co wskazuje na to, że komórki nie są dobrze rozmieszczone w studzience i ułożone jedna na drugiej w skupiskach. Aby uzyskać najlepsze wyniki, upewnij się, że wirus jest równomiernie rozprzestrzeniony na płytce, aby uniknąć zbrylania się blaszek miażdżycowych Testy płytki nazębnej są bardziej skuteczne niż inne metody ilościowe, ponieważ liczą tylko żywego wirusa.W ten sposób można ustalić prawdziwą skuteczność przeciwwirusową. Ponadto technika ta pozwoliła nam określić ilościowo obecność wirusa na ogniskach i zbadać skuteczność dostarczania leków z nowych urządzeń medycznych w naszym sektorze badań nad wirusem opryszczki.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym artykule wideo opisujemy zastosowanie nowego modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki wirusem prostego typu I.

Ex Vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu I

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Ten film opisuje test płytki wirusowej zakaźnego wirusa opryszczki pospolitej lub HSV. Rozcieńczone cząsteczki wirusa są inokulowane do monowarstwy komórek nabłonka. Podczas inkubacji wirus tworzy blaszki i jest liczony wizualnie w celu określenia miana wirusa zakaźnego.

Test płytki wirusowej: technika pomiaru zakaźnego wirusa opryszczki pospolitej poprzez ilościowe oznaczanie blaszek utworzonych w jednej warstwie komórek zakażonych wirusem

Ten film demonstruje metodę przeprowadzania testu płytki nazębnej przy użyciu wirusa uzyskanego z zakażonej rogówki świni. Rogówka świni służy do testowania skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych.

Określanie skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych za pomocą testu płytki nazębnej

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Opisujemy użycie rogówki świni do testowania skuteczności przeciwwirusowej eksperymentalnych leków.

Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

W tym manuskrypcie opisujemy prostą metodę wzrostu, oczyszczania i miareczkowania onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej do użytku przedklinicznego.

Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej

Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.

Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Poznaj metodę plakowania wirusów opryszczki pospolitej w celu ilościowego oznaczania wirusa. Technika ta umożliwia ocenę skuteczności leków przeciwwirusowych w badaniach wirusologicznych.

Plaquing wirusów opryszczki pospolitej

Przeglądaj więcej filmów