Name: Ustandaryzowana procedura monitorowania szkodliwych zakwitów glonów w Chile za pomocą analizy metabarcoding (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę metabarcodingu do monitorowania szkodliwych zakwitów glonów w próbkach wody morskiej. Protokół obejmuje pobieranie próbek, ekstrakcję DNA, PCR i sekwencjonowanie genów 16S i 18S rRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez grant (JPMJSA1705) na badanie na temat Partnerstwa Badawczego Nauki i Technologii na rzecz Zrównoważonego Rozwoju - Monitorowanie Glonów w Chile (SATREPS-MACH). Dziękujemy dr Sandrze Rios (Universidad de Los Lagos) za zgodę na wykorzystanie klipu filmowego. Dziękujemy Nealowi Andrew Hollandowi za staranną korektę manuskryptu. Wyrażamy szczerą wdzięczność członkom grupy laboratoryjnej CREAN-IFOP w Puerto Montt w Chile za doradztwo w zakresie identyfikacji fitoplanktonu.

1. Pobieranie i przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Pobrać około 3 L próbki wody z docelowego miejsca.</li>
	<li>Przefiltrować 1 L próbki wody do analizy 16S rRNA poprzez filtrację tandemową (membrany o rozmiarze porów 1 µm i 0,2 µm), aby oddzielić bakterie wolnożyjące i przytwierdzone.</li>
	<li>Kolejny 1 L próbki wody do analizy 18S-rRNA (wykrywanie fitoplanktonu) przefiltrować za pomocą pojedynczej filtracji przez membranę 0,2 µm. 
	UWAGA: Filtracja próbki wody musi zostać zakończona w ciągu 12 h od momentu pobrania próbek.</li>
	<li>Przeciąć przefiltrowaną membranę na pół za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i zawinąć w folię aluminiową. Przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca lub przejść do następnego kroku.</li>
	<li>Wyekstrahować DNA metodą Chelex, zgodnie z opisem9. Przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca.</li>
</ol>
2. Analiza mikroskopowa
<ol>
	<li>Przenieś 1 mL próbki wody za pomocą pipety na szkiełko z siatką o pojemności 1 mL.</li>
	<li>Zaobserwuj próbkę pod mikroskopem.</li>
	<li>Zapisz nazwy i liczbę gatunków fitoplanktonu.</li>
</ol>
3. Analiza metabarkodowania 16S rRNA i 18S rRNA
UWAGA: Proces ten składa się z siedmiu etapów: przygotowania, generowania pierwszego amplikonu PCR, oczyszczania pierwszego amplikonu, indeksowania poprzez drugi PCR, weryfikacji i oczyszczania amplikonu drugiego PCR, dostosowania stężenia DNA oraz denaturacji i sekwencjonowania DNA. Cały proces zajmuje minimum 5 dni (40 h) przy wykonaniu przez doświadczony personel laboratoryjny. Numery produktów i producentów znajdują się w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Regularnie czyścić pipety oraz komorę laminarną 70% etanolem, a następnie naświetlać promieniami UV przez 30 min. Sterylizować materiały przeznaczone do użycia.</li>
		<li>Rozmrozić próbki DNA w temperaturze pokojowej, wirować przy 100 x g przez 2 min i przenieść 100 µL supernatantu z każdej próbki do pasków 8-probówkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie pierwszego amplikonu PCR 
	UWAGA: Poniższe procedury należy wykonywać w komorze laminarnej. Aby uniknąć kontaminacji starterami, zawsze rozcieńczać startery z roztworu stokowego 1 µM do stężenia docelowego za pomocą wody klasy PCR.
	<ol>
		<li>Przygotować pierwszą mieszaninę master mix PCR w sterylnej probówce 1,5 mL do reakcji (Tabela 1, Tabela 2).</li>
		<li>Odmierzyć 22,5 µL mieszaniny master mix do paska 8-probówkowego i dodać 2,5 µL próbki DNA. W przypadku kontroli negatywnej użyć 2,5 µL wody klasy PCR.</li>
		<li>Przeprowadzić pierwszy cykl PCR (Tabela 3).</li>
		<li>Przygotować 100 mL 2% żelu agarozy-TBE zawierającego 10 µL 1x barwnika do żeli kwasów nukleinowych.</li>
		<li>Nanieść na żel agarozowy mieszaninę 1,5 µL 1x barwnika do ładowania DNA i 4 µL produktu PCR. Nanieść również marker DNA 100 bp.</li>
		<li>Przeprowadzić elektroforezę przy 100 V przez 30 min.</li>
		<li>Podczas obrazowania w świetle UV upewnić się, że występuje prążek w zakresie 500-600 bp. Prążek dimerów starterów znajduje się w okolicach 80 bp. 
		UWAGA: Próbki wody morskiej zawierają inhibitory PCR. Brak amplikonów można czasem rozwiązać poprzez rozcieńczenie próbek 1:100 lub 1:1000 wodą klasy PCR.</li>
		<li>Przechowywać produkty pierwszej reakcji PCR w temperaturze -20 °C do kolejnego etapu. 
		OSTRZEŻENIE: Czas przechowywania nie może przekroczyć jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie pierwszego amplikonu PCR 
	UWAGA: Tę sekcję można wykonać poza komorą laminarną.
	<ol>
		<li>Użyć systemu oczyszczania DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych w celu usunięcia pozostałości reakcji PCR, w tym produktów dimerów starterów.</li>
		<li>Przenieść 20 µL każdego oczyszczonego produktu pierwszej reakcji PCR do nowej płytki 96-dołkowej. Uszczelnić płytkę folią mikro-uszczelniającą. Przechowywać w -20 °C do czasu przejścia do kolejnego etapu. 
		OSTRZEŻENIE: Czas przechowywania nie może przekroczyć jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indeksowanie poprzez drugą reakcję PCR 
	UWAGA: W tej sekcji oczyszczone produkty pierwszej reakcji PCR zostaną namnożone z różnymi kombinacjami starterów indeksujących.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć wszystkie startery Index 1 i Index 2 (Tabela 4) do stężenia 1 µM wodą klasy PCR w paskach PCR 8-probówkowych umieszczonych w komorze laminarnej. 
		UWAGA: Dalsze kroki w tej sekcji można wykonywać poza komorą laminarną, ponieważ startery indeksujące są specyficzne dla adaptera nawisowego z pierwszej reakcji PCR.</li>
		<li>Rozmieścić startery Index 1 w rzędzie poziomym, a startery Index 2 w rzędzie pionowym (Tabela 5).</li>
		<li>Do każdego dołka w nowej płytce 96-dołkowej dodać 12,5 µL formulacji hot-start-ready.</li>
		<li>Używając pipety wielokanałowej, dodać do każdego dołka 2,5 µL każdego startera indeksującego (1 µM) zgodnie z Tabelą 4.</li>
		<li>Dodać 7,5 µL oczyszczonego produktu pierwszej reakcji PCR.</li>
		<li>Wymieszać delikatnie, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przykryć płytkę folią mikro-uszczelniającą.</li>
		<li>Przeprowadzić drugi cykl PCR (Tabela 3).</li>
		<li>Przechowywać płytkę w -20 °C. 
		OSTRZEŻENIE: Czas przechowywania nie może przekroczyć jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weryfikacja i oczyszczanie drugiego amplikonu PCR
	<ol>
		<li>Użyć analizatora fragmentów i odpowiedniego odczynnika. Przed użyciem wymieszać odczynnik w wirówce (vortex) i odwirować.</li>
		<li>Pozostawić bufor do próbek i taśmę do ekranowania DNA do wyrównania temperatury pokojowej przez 30 min. Następnie umieścić taśmę do ekranowania DNA w analizatorze fragmentów.</li>
		<li>W nowych paskach 8-probówkowych wymieszać 2 µL buforu do próbek i 3 µL drugiego amplikonu PCR. Włożyć paski 8-probówkowe do analizatora fragmentów. Nacisnąć Run , aby rozpocząć. 
		OSTRZEŻENIE: Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Upewnić się, że drugie amplikony PCR mają długość około 613 bp (600 - 630 bp) dla genów 16S i 18S rRNA.</li>
		<li>Oczyścić produkty drugiej reakcji PCR za pomocą systemu oczyszczania DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosowanie stężenia DNA
	<ol>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA w oczyszczonych produktach drugiej reakcji PCR przy użyciu spektrofotometru do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych.</li>
		<li>Obliczyć stężenie docelowego genu w nM, przyjmując średnią końcową wielkość biblioteki jako 613 bp dla genów 16S i 18S rRNA: 
		<img alt="Wzór na stężenie genu 16S/18S, obliczanie stężenia DNA, analiza ilościowa." src="/files/ftp_upload/62967/62967eq01v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Rozcieńczyć każdy oczyszczony produkt drugiej reakcji PCR sterylną wodą do PCR do stężenia 4 nM w nowej płytce 96-dołkowej 0,2 mL. 
		UWAGA: Płytkę można tutaj przechowywać w -20 °C. W przeciwnym razie pozostałe procedury muszą być wykonane bez przerwy.</li>
		<li>Odmierzyć 3 µL każdego produktu drugiej reakcji PCR o stężeniu 4 nM i wymieszać wszystko w nowej sterylnej probówce 1,5 mL jako połączoną bibliotekę (pooled library). Probówkę należy przez cały czas trzymać w temperaturze 4 °C lub w łaźni lodowej.</li>
		<li>Dla potwierdzenia zmierzyć stężenie połączonej biblioteki za pomocą spektrofotometru do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych. Jeśli stężenie jest wyższe niż 4 nM, dostosować je do poziomu 4 nM. 
		UWAGA: Zbyt wysokie stężenie DNA prowadzi do zawyżonej liczby odczytów, co utrudnia analizę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Denaturacja DNA i sekwencjonowanie 
	UWAGA: W tej sekcji wykorzystuje się system Illumina MiSeq ze specyficznymi odczynnikami. Numery produktów znajdują się w Tabeli materiałów. 
	UWAGA: Ściśle przestrzegać czasu. Wszystkie odczynniki, z wyjątkiem kartridży, rozmrozić w dniu sekwencjonowania.
	<ol>
		<li>Dzień przed sekwencjonowaniem wyjąć napełniony, gotowy do użycia kartridż z odczynnikami z -20 °C i przechowywać w 4 °C w celu rozmrożenia.</li>
		<li>Ustawić blok grzejny odpowiedni dla probówek wirówkowych 1,5 mL na 96 °C.</li>
		<li>Umieścić bufor hybrydyzacyjny w lodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć NaOH klasy molekularnej z 1 N do 0,2 N w nowej probówce wodą klasy PCR.</li>
		<li>Rozcieńczyć gotową do użycia bibliotekę kontrolną buforem TE (pH 8,0) z roztworu stokowego 10 nM do 4 nM w nowej probówce (tj. 2 µL biblioteki kontrolnej + 3 µL buforu TE).</li>
		<li>Wymieszać 16 µL połączonej biblioteki próbek 4 nM z 4 µL biblioteki kontrolnej 4 nM w nowej probówce oznaczonej jako „1”.</li>
		<li>Wymieszać 10 µL próbki z probówki „1” z 10 µL 0,2 N NaOH w nowej probówce oznaczonej jako „2”.</li>
		<li>Wymieszać probówkę 2 w wirówce (vortex) przez 5 s, krótko odwirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Dodać 980 µL buforu hybrydyzacyjnego do probówki 2.</li>
		<li>W nowej probówce oznaczonej jako „3” wymieszać 260 µL próbki z probówki 2 z 390 µL buforu hybrydyzacyjnego. Wymieszać poprzez odwracanie probówki.</li>
		<li>Inkubować probówkę 3 w 96 °C przez 2 min, a następnie natychmiast umieścić ją w lodzie na maksymalnie 2 min.</li>
		<li>Wyjąć kartridż z lodówki 4 °C.</li>
		<li>Przygotować arkusz próbek (sample-sheet) do sekwencjonowania z odpowiadającymi im adapterami indeksu 1 i indeksu 2 zgodnie z Tabelą 6.</li>
		<li>Wyjąć ogniwo przepływowe (flowcell) z zestawu MiSeq v3. Delikatnie oczyścić ogniwo przepływowe sterylną wodą PCR klasy molekularnej. 
		UWAGA: Nie wlewać wody na punkty kapilarne ogniwa przepływowego. Delikatnie wytrzeć wodę z ogniwa przepływowego papierem beztkaninowym.</li>
		<li>Wprowadzić pełną objętość probówki 3 (650 µL) do kartridża.</li>
		<li>W oprogramowaniu sterującym instrumentem wybrać sekwencjonowanie i postępować zgodnie z instrukcjami. Włożyć ogniwo przepływowe, bufor inkorporacji i kartridż. Wczytać arkusz próbek. Nacisnąć Run , aby rozpocząć reakcję. 
		UWAGA: Ten przebieg sekwencjonowania potrwa od 3 do 5 dni. Dane zostaną automatycznie przesłane na platformę Basespace. Surowe dane zostaną zapisane w dwóch folderach na komputerze: folderze Analysis zawierającym pliki fastq oraz folderze Output zawierającym pliki bcl i zdjęcia jpeg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przypisanie taksonomiczne danych sekwencjonowania
<ol>
	<li>Przetwarzanie plików FASTQ 
	UWAGA: Pakiet DADA223 środowiska R24 jest jedną z rekomendowanych baz do przetwarzania plików FASTQ. Wytyczne są dostępne pod adresem [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Niniejsze wytyczne zostały opracowane na podstawie aktualnej wersji samouczka potoku DADA2 [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].
	<ol>
		<li>Przetworzyć surowe sekwencje FASTQ typu paired-end w celu przycięcia, filtrowania jakościowego, dereplikacji i zliczania unikalnych sekwencji, wnioskowania próbek, łączenia w kontigi oraz usuwania sekwencji chimerycznych.</li>
		<li>Dla fragmentów genów 16S rRNA i 18S rRNA zastosować następujące parametry określone w DADA2: trimLefts=0, 0, truncLens=[Należy sprawdzić jakość sekwencji i ustawić odpowiednią długość]. 
		UWAGA: Domyślne wartości dla pozostałych parametrów to maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przypisywanie taksonomii 
	UWAGA: Do przypisywania taksonomii w DADA2 zalecana jest baza danych SILVA rRNA [domyślnie ustawiono silva_nr_v132_train_set.fa.gz].
	<ol>
		<li>Usunąć OTU chloroplastów i mitochondriów dla analizy fragmentu genu 16S rRNA. Usunąć singletony z analizy 16S rRNA i 18S rRNA.</li>
		<li>Przeprowadzić raryfikację wszystkich próbek do równej głębokości sekwencjonowania, bazując na próbce o najniższej głębokości sekwencjonowania.</li>
		<li>Zarejestrować liczbę odczytów, przypisane OTU oraz poziom ich przypisania, odczyty odfiltrowane oraz liczbę wykluczonych singletonów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Przeprowadzić analizę statystyczną danych mikrobiologicznych przy użyciu pakietów R: phyloseq25 oraz vegan26.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+harmful+algal+bloom+status+reporting%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Global harmful algal bloom status reporting.</a> Harmful Algae. 102, 101992(2021).</li>
<li>Anderson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+Tides%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+American%22%5BJournal%5D)">Red Tides.</a> Scientific American. 271 (2), 52-58 (1994).</li>
<li>Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanseverino%2C+I+%22Algal+Bloom+and+its+Economic+Impact%22">Algal Bloom and its Economic Impact</a>. , Publications Office of the European Union. (2016).</li>
<li>Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+of+natural+accumulation+and+detoxification+of+paralytic+shellfish+poison+in+two+bivalves+from+the+Norwest+Patagonian+inland+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Biologia+Marina+Y+Oceanografia%22%5BJournal%5D)">Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea.</a> Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).</li>
<li>Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexandrium+catenella+during+2009+in+Chilean+waters%2C+and+recent+expansion+to+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae+News%22%5BJournal%5D)">Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean.</a> Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).</li>
<li>Alvarez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+shellfish+toxins+in+surf+clams+Mesodesma+donacium+during+a+large+bloom+of+Alexandrium+catenella+dinoflagellates+associated+to+an+intense+shellfish+mass+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality.</a> Toxins (Basel). 11 (4), (2019).</li>
<li>Clément, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptional+summer+conditions+and+HABs+of+Pseudochattonella+in+Southern+Chile+create+record+impacts+on+salmon+farms%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae+News%22%5BJournal%5D)">Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms.</a> Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).</li>
<li>Trainer, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pelagic+harmful+algal+blooms+and+climate+change%3A+Lessons+from+nature%27s+experiments+with+extremes%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes.</a> Harmful Algae. 91, 101591(2020).</li>
<li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+monitoring+harmful+algal+blooms+for+sustainable+aquaculture+and+coastal+fisheries+in+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).</li>
<li>Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wind-induced+plume+and+bloom+intrusions+into+Willapa+Bay%2C+Washington%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington.</a> Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).</li>
<li>Tweddle, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+upwelling%2C+phytoplankton+blooms%2C+and+phycotoxins+in+coastal+Oregon+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish.</a> Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).</li>
<li>Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+complex+phenomena+of+harmful+algae+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">The global complex phenomena of harmful algae blooms.</a> Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).</li>
<li>Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+performance+of+Alexandrium+catenella+from+the+Chilean+fjords+under+different+environmental+drivers%3A+Plasticity+as+a+response+to+a+highly+variable+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment.</a> Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).</li>
<li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Amin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+signaling+between+a+cosmopolitan+phytoplankton+and+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria.</a> Nature. 522, 98-101 (2015).</li>
<li>Berdalet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+harmful+algal+blooms%2C+human+health%2C+and+wellbeing%3A+Challenges+and+opportunities+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Marine+Biology+Association%22%5BJournal%5D)">Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century.</a> Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).</li>
<li>Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algae-bacteria+interactions%3A+Evolution%2C+ecology%2C+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications.</a> Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).</li>
<li>Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in+on+the+phycosphere%3A+The+ecological+interface+for+phytoplankton-bacteria+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 17065(2017).</li>
<li>Maruyama, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+and+18S+Metabarcoding+analysis+for+Chilean+coastal+waters+harmful+algal+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22protocol.io%22%5BJournal%5D)">16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms.</a> protocol.io. , (2020).</li>
<li>Tanabe, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+validity+of+three+regions+of+the+18S-rRNA+gene+for+massively+parallel+sequencing-based+monitoring+of+the+planktonic+eukaryote+community%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community.</a> Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).</li>
<li>Nishitani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+plastids+collected+by+the+Dinoflagellate+Dinophysis+mitra+through+Kleptoplastidy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).</li>
<li>Klindworth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+general+16S+ribosomal+RNA+gene+PCR+primers+for+classical+and+next-generation+sequencing-based+diversity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 1(2013).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.R-project.org">http://www.R-project.org</a> (2007).</li>
<li>McMurdie, P. J., Holmes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phyloseq%3A+An+R+Package+for+Reproducible+Interactive+Analysis+and+Graphics+of+Microbiome+Census+Data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data.</a> PLoS One. 8 (4), 61217(2013).</li>
<li>Dixon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGAN%2C+a+package+of+R+functions+for+community+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vegetation+Science%22%5BJournal%5D)">VEGAN, a package of R functions for community ecology.</a> Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).</li>
<li>Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+probes+for+the+detection+and+identification+of+ichthyotoxic+marine+microalgae+of+the+genus+Pseudochattonella+%28Dictyochophyceae%2C+Ochrophyta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta).</a> Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).</li>
<li>Mardones, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salinity-growth+response+and+ichthyotoxic+potency+of+the+Chilean+Pseudochattonella+verruculosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa.</a> Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).</li>
<li>Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+DNA+metabarcoding+and+microscopy+methodologies+for+the+study+of+aquatic+microbial+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Diversity%22%5BJournal%5D)">A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes.</a> Diversity. 13 (5), 180(2021).</li>
<li>Lamb, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+quantitative+is+metabarcoding%3A+A+meta-analytical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach.</a> Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).</li>
<li>Mascareño, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controversies+in+social-ecological+systems%3A+lessons+from+a+major+red+tide+crisis+on+Chiloe+Island%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Society%22%5BJournal%5D)">Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile.</a> Ecology and Society. 23, (2018).</li>
<li>Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+red+tide+crisis+in+southern+Chile%3A+Possible+influence+of+the+mass+oceanic+dumping+of+dead+salmons%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Pollution+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons.</a> Marine Pollution Bulletin. 150, 110603(2020).</li>
<li>Swanson, H. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Caught+in+Comparisons%3A+Japanese+Salmon+in+an+Uneven+World%22">Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World</a>. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).</li>
<li>Sakai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+an+unrecorded+population+of+Yamato+salamander+%28Hynobius+vandenburghi%29+by+GIS+and+eDNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis.</a> Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, w gromadzeniu, analizowaniu lub interpretacji danych; w pisaniu manuskryptu lub w decyzji o publikacji wyników.

W ramach tego protokołu z powodzeniem przeprowadzono analizę metabarkodowania genów 18S rRNA i 16S rRNA w celu identyfikacji gatunków glonów i bakterii w próbkach wody morskiej w celu monitorowania chilijskich HAB. Dominujące glony i niektóre drobne glony wykryte przez ten protokół były zgodne z tymi uzyskanymi za pomocą mikroskopii, potwierdzając wiarygodność protokołu. Najważniejszym elementem protokołu jest to, że analiza wykryła Alexandrium spp. i Pseudochattonella spp., dwa najbardziej problematyczne gatunki powodujące HAB w południowym Chile, w wodzie morskiej Metri nawet w niskiej obfitości. Zwłaszcza Pseudochattonella spp. są gatunkami trudnymi do zidentyfikowania pod mikroskopem, ponieważ komórki są małe i łatwo pękają pod wpływem światła lub użycia utrwalaczy27,28. Metabarcoding może dostarczyć informacji o gatunkach glonów, które są prawie nieobecne w próbkach wody morskiej, których mikroskopia nie jest w stanie zidentyfikować. W protokole wykryto również ponad 30 gatunków bakterii. Chociaż w tym momencie nie wiadomo, w jaki sposób te bakterie są powiązane ze wzrostem glonów, masowe gromadzenie danych o gatunkach glonów w analizie szeregów czasowych prawdopodobnie dostarczy tak ważnych odkryć. W związku z tym dodanie analizy metabarcoding do konwencjonalnych chilijskich programów monitorowania HAB niewątpliwie wzmocni obecną skuteczność monitorowania HAB. W rzeczywistości ten wizualny protokół analizy metabarcodingu może być korzystny nie tylko dla monitorowania glonów i bakterii w chilijskiej wodzie, ale także dla programów monitorowania wybrzeży na innych obszarach dotkniętych HAB na całym świecie.
Chociaż protokół ten zapewniał wyżej wymienione zalety, należy omówić wady tej metody. Jak widać w protokole wizualnym, metoda metabarcodingu jest czasochłonna i złożona, wymaga drogich maszyn i odczynników. Personel laboratorium musi być specjalnie przeszkolony, w przeciwnym razie będzie to marnować materiał, pracę i czas. Ponadto wykrywanie glonów za pomocą metabarcodingu musi być połączone z mikroskopią w celu sprawdzenia, czy te same dominujące gatunki są identyfikowane za pomocą dwóch metod ortogonalnych29. Mikroskopia jest nieinwazyjnym narzędziem w większości przypadków do identyfikacji gatunków glonów, co oznacza, że trudniej jest popełnić błędy, gdy gatunki glonów mają unikalne i widoczne kształty. Oczywiście błąd ludzki może wystąpić, jeśli gatunki mają bardzo podobne kształty do siebie. Z drugiej strony, ponieważ analiza metabarcodingu wymaga wielu kroków, w naturalny sposób zwiększa liczbę błędów. Może to być pomieszana próbka, niewłaściwe dodanie odczynnika lub pominięcie niektórych procedur. Dlatego tak ważne jest porównanie wyników metabarcodingu z wynikami uzyskanymi za pomocą mikroskopii. Wreszcie, protokół ma zastosowanie tylko jakościowo, a wyniki muszą być obliczane dla względnej obfitości. Jak stwierdzili Lamb i in. w 2019 r., obecne metabarcoding jako wydajność ilościowa jest nadal ograniczony i potrzebne są dodatkowe badania, zanim metabarcoding będzie mógł być śmiało wykorzystany do zastosowań ilościowych30.
Protokół ten został zoptymalizowany dla 140 - 170 próbek na serię z podręcznika przygotowania biblioteki sekwencjonowania metagenomicznego 16S wydanego przez Illumina Inc. Zoptymalizowany protokół był wielokrotnie testowany i dalej modyfikowany, aby wydać tę ostateczną wersję. Dlatego zdecydowanie zaleca się dokładne przestrzeganie każdego kroku. Najważniejszą częścią protokołu jest to, że wymagana jest dodatkowa ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki. Pipety i kaptur o przepływie laminarnym muszą być zawsze czyszczone 70% alkoholem i promieniowaniem UV, a materiały sterylizowalne należy sterylizować w autoklawie. Startery i odczynniki powinny być rozcieńczane bezpośrednio z podkładu przy każdym nowym przebiegu, w przeciwnym razie ponowne użycie odczynników i narażenie na kilka rozcieńczeń może być przyczyną zanieczyszczenia próbki. Protokół określa, kiedy operację można wykonać poza okapem z przepływem laminarnym. O ile nie jest inaczej, próbki należy poddać obróbce w oczyszczonym okapie z przepływem laminarnym. W przypadku jednoczesnego korzystania z wielu pasków 8-rurowych zaleca się pracę na pierwszym pasku 8-rurowym i zakrycie go przed przejściem do następnego paska 8-rurowego. Pozostawienie pokrywy otwartej przez długi czas może spowodować zanieczyszczenie próbki, ponieważ geny 16S i 18S rRNA są bardzo wszechobecne w otoczeniu. Podany czas, taki jak czas mieszania i czas inkubacji, powinien być przestrzegany zgodnie z dokładnym opisem, ponieważ najlepszy czas trwania dla każdego etapu został wybrany na podstawie wielu przebiegów testowych. Zbyt długi lub niewystarczający czas może na przykład zmniejszyć wydajność próbki. Proces powinien zostać zatrzymany tylko w tej części, w której protokół mówi, że może się zatrzymać. Bardzo ważne jest, aby mieć kontrolę negatywną, ponieważ potwierdza ona, że pozytywne wyniki nie są sztucznymi fałszywie dodatnimi. Na koniec zdecydowanie zaleca się zaplanowanie dni, ponieważ przetworzenie wszystkich kroków wymaga co najmniej pięciu dni, a niektórych części nie można zatrzymać do następnego znaku stopu.
W tym miejscu pokrótce omówiono ograniczenia przypisania taksonomicznego dla danych sekwencjonowanych. Nowo odkryte sekwencje nukleotydowe dla gatunków bakterii i glonów są codziennie aktualizowane w banku danych. Podczas gdy dobrze zbadane gatunki glonów i bakterii są wiarygodnie rejestrowane, w banku danych zaktualizowano również wiele sekwencji dla nieznanych gatunków. Wskazuje to, że rozdzielczość zarejestrowanych sekwencji nukleotydowych nie zawsze jest wystarczająca do identyfikacji gatunku, a jedynie do identyfikacji rodzaju. W związku z tym mikroskopowa identyfikacja gatunków musi być przeprowadzona ortogonalnie. Ustanowienie potoku otwartego dostępu dla tej pracy ma znaczącą zaletę w radzeniu sobie z dużym zestawem sekwencjonowanych danych jednocześnie i skutecznym badaniu wystąpienia błędu. Dodatkowo dane wyjściowe DADA2 znajdują się w pliku tekstowym lub csv, co ułatwia dalszą analizę statystyczną. Z drugiej strony duży serwer jest wymagany do wykonywania przypisań taksonomicznych, zwłaszcza gdy zestaw danych jest duży. Aby skonfigurować rurociąg, potrzebni są inżynierowie do skonfigurowania rurociągu, a specjaliści muszą rozumieć parametry, działanie, Linuksa i bioinformatykę.
Oprócz zakresu jako narzędzia monitorowania HAB, zastosowanie tego protokołu może zostać rozszerzone do celów badań śledczych. Na przykład toczą się debaty między chilijskim rządem a lokalnymi rybakami oraz stowarzyszeniami na rzecz ochrony środowiska i pokoju na temat zwiększonej liczby lokalnych HAB31,32. Rząd twierdzi, że jest to spowodowane zjawiskami naturalnymi, takimi jak globalne ocieplenie i El Niño, podczas gdy późniejsze strony twierdzą, że przyczyną jest akwakultura łososia. Łosoś nie jest rodzimym gatunkiem Chile i nie było go w chilijskich wodach pół wieku temu. Ówczesny rząd chilijski miał na celu rozwój gospodarki i tworzenie miejsc pracy na obszarach ubogich poprzez rozwój działalności związanej z łososiem33. Dzięki interwencji zza oceanu w celu uzyskania zysku kapitałowego, Chile odniosło wielki sukces w rozwoju akwakultury w stylu zagrodowym, a liczba łososia znacznie wzrosła w ciągu ostatnich kilku dekad 31,32,33. W związku z tym duża ilość pokarmu dla łososia została wyrzucona do morza, co skłoniło miejscową ludność do podejrzeń, że przyczyną częstych lokalnych HABjest akwakultura łososia. Prawda jest obecnie nieznana, ale w końcu musi zostać zrozumiana, aby można było opracować strategie ochrony lokalnego środowiska morskiego, gospodarki i zdrowia ludzkiego przed HAB. Analiza molekularna lokalnego związku glon-bakteria może przyczynić się do kroku naprzód w wyjaśnieniu tego tematu. Na przykład, technika ta może przeszukiwać gatunki glonów i bakterii, które wcześniej nie występowały w docelowym obszarze oceanicznym, ale dramatycznie wzrosły w ostatnich latach, co jest nieco podobne do badania przeprowadzonego przez Sakai i in. w celu odkrycia niezarejestrowanej populacji salamandry Yamato (Hynobius vandenburghi) za pomocą GIS i analizy eDNA34. W związku z tym, poza narzędziem do monitorowania HAB, ten protokół metabarcodingu ma potencjalne zastosowanie dla innych potencjalnych klientów.

Wiele gatunków fitoplanktonu morskiego jest znanych z produkcji endogennych toksyn, a gdy te gatunki gromadzą się w wystarczającej liczbie, są szkodliwe dla środowiska morskiego. Takie szkodliwe zakwity glonów (HAB) obserwuje się obecnie na wybrzeżach większości kontynentów świata1. Toksyczny fitoplankton najpierw gromadzi się w tkankach małży, prowadząc do chorób i śmierci w wyższych poziomach troficznych organizmów, w tym ludzi, po strawieniu. W konsekwencji wydarzenia te mają poważne konsekwencje dla lokalnej gospodarki, socjoekonomii i zdrowia publicznego2. Szacuje się, że szkody wyrządzone gospodarce światowej przez HAB wynoszą od milionów do miliardów dolarów rocznie3. Chile jest jednym z wielu krajów cierpiących na częste HAB.
Chile to kraj o długim lądzie, rozciągający się na ponad 4 300 km na północ i południe. Wydłużony zachodni ląd wychodzi na Ocean Spokojny, co w naturalny sposób zwiększa szanse na wystąpienie w Chile HAB. Szczególnie w południowym Chile znajduje się wiele znanych na całym świecie akwakultur łososia, a za każdym razem, gdy w regionie występuje HAB, toksyny glonów powodują zachorowania i śmierć ogromnych populacji łososi hodowlanych4,5,6. W Chile rokiem, w którym HAB najmocniej uderzył w gospodarkę, był rok 2016, z szacowaną roczną stratą w wysokości 800 milionów dolarów7,8. Przyczyny toksycznych gatunków glonów różnią się w zależności od roku i lokalizacji. W przypadku z 2016 r. kompleks Alexandrium catanella i Pseudochattonella verruclosa spowodował rozpowszechnienie HAB w większości południowego wybrzeża Chile7,8. Ostatni HAB w Chile miał miejsce w marcu 2021 r. w Camanchaca, położonym w południowym Chile, gdzie na tym obszarze znajduje się duża farma łososia.
Chile od wielu lat prowadzi monitoring wybrzeży przy użyciu dwóch głównych metod; obserwacji wody morskiej za pomocą mikroskopów w celu regularnego identyfikowania toksycznych gatunków glonów oraz mierzenia poziomu toksyn w skorupiakach za pomocą testów biochemicznych9. Wczesne wykrycie toksycznych glonów i poziomów toksyn w skorupiakach nie zapobiega HAB; Analizy te mogą jednak uruchomić natychmiastowe środki zaradcze i zmniejszyć szkody ponoszone przez lokalne społeczności. Aby jeszcze bardziej wzmocnić skuteczność tej strategii, do naszego konwencjonalnego chilijskiego programu monitorowania HAB dodano niedawno molekularną metodę analityczną w celu wykrywania glonów i pokrewnych społeczności bakteryjnych w próbkach wody morskiej. W szczególności wybrano metodę masowego sekwencjonowania równoległego z wykorzystaniem metabarkodowania, która jest ukierunkowana na geny 16S rRNA i 18S rRNA. Chociaż technika ta wymaga skomplikowanych procedur oraz drogich maszyn i odczynników, jest to zaawansowana technologia, która może wykryć tysiące rodzajów/gatunków glonów i bakterii obecnych jednocześnie w próbce wody morskiej.
Przypuszcza się, że przyczyny HAB są różne, takie jak temperatura i pora roku, ale nie można ich uogólniać. Dzieje się tak dlatego, że gatunki i częstotliwości HAB zależą od regionu i warunków czasoprzestrzennych, obejmujących zjawiska naturalne, takie jak unikalność geograficzna, mieszanie składników odżywczych w górę i spływ pierwiastków z lądu w wyniku erozji2,10,11,12. Dodatkowo sztuczne czynniki, takie jak eutrofizacja, wpływają na lokalne HABs12,13. Ze względu na złożoną wieloczynnikowość nie jest łatwo dokonać dokładnej prognozy HAB. W ostatnich latach istnieje pogląd, że określone populacje bakterii mogą być związane z rozwojem HAB jako jednym z czynników, a badania potwierdzające tę hipotezę są coraz bardziej widoczne14,15,16,17,18. Techniki biologii molekularnej są powszechnie stosowane do badania zbiorowisk bakteryjnych; jednak taka ustandaryzowana metoda nie została jeszcze ustalona w chilijskim monitorowaniu HAB9. Aby zbadać związek glonów i bakterii z HAB, konieczne jest jednoczesne przeprowadzenie analizy metabarcodingu dla obecnych chilijskich programów monitorowania wybrzeży. W ten sposób protokół ten wizualnie przedstawia nasz chilijski program monitorowania HAB, koncentrując się na krokowej procedurze analizy wykrywania glonów i gatunków bakterii w próbkach wody morskiej za pomocą analizy metabarcodingu.
Pełny protokół opisujący nasz chilijski program monitorowania HAB jest dostępny w Yarimizu et al.9. Obejmuje procedury pobierania próbek wody morskiej, mikroskopijne wykrywanie gatunków glonów, wykrywanie genów glonów bakteryjnych, analizę pigmentów, gromadzenie danych meteorologicznych oraz fizyczne i chemiczne testy właściwości wody. Krokowy protokół analizy metabarcodingu 16S rRNA i 18S rRNA do wykrywania gatunków glonów i bakterii jest dostępny jako preprint19. Protokół ten demonstruje szczególnie etapy analizy metabarcodingu, ponieważ jest to najbardziej skomplikowana część i główna atrakcja naszego programu monitorowania HAB. Protokół ten obejmuje również wprowadzenie programu i wykrywanie gatunków glonów za pomocą mikroskopii. Podczas analizy gatunków glonów za pomocą metabarcodingu kluczowe jest jednoczesne wykonanie mikroskopii w celu weryfikacji wyników obu metod. Protokół ten nie zawiera informacji o tym, jak używać oprogramowania do przypisywania taksonomii, ale zalecenia dotyczące bazy danych są krótko podane na końcu następnej sekcji.

<table><tbody><tr><td>Pojedyncza probówka 1,5 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>probówki 1,5 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>2150N</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>8-paskowe probówki do PCR 0,2 ml i płaska nasadka</td><td>ThermoFisher</td><td>AB0451 & 4323032</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do PCR 0,2 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>AccuRuler 100 bp Drabinka DNA</td><td>MaestroGen</td><td>02001-500</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Żywica chelatująca</td><td>Bio-Rad</td><td>1432832</td><td></td></tr><tr><td>Chemiczna pompa próżniowo-ciśnieniowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>WP6122050</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Odczynniki</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 bufor do próbek</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5602</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący DNA (niebiesko-pomarańczowy barwnik ładujący 6X)</td> <td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Biologia molekularna klasy</td><td>E7023</td><td>Merck KGaA</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie filtrujące</td><td>ThermoFisher</td><td>09-740-36H, 09-740-23E</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pomiaru stężenia fluorescencyjnego DNA (zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS)</td><td>Fluorometr Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>(fluorometr Qubit4)</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Macierz weryfikacyjna analizy fragmentów (D1000 ScreenTape)</td><td>Analizator fragmentów Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>(Agilent Tapestation 4150)</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Barwnik w żelu z kwasami nukleinowymi</td><td>Biotium</td><td>41002</td><td></td></tr><tr><td>Ogólny wirownik stołowy (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td> <td>grzewczy</td></tr><tr><td>Wysokowydajna polimeraza DNA klasy sekwencjonowania (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X</td><td>Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>HT1 Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Illumina</td><td>20015892</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Nextera XT v2 Zestaw indeksów A, B, C i D</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001, -2002, -2003, -2004</td><td></td></tr><tr><td>Szafka z kapturem laminarnym</td><td>Biobase Co.</td><td>Biobase PCR-800 Końcówki do ładowania szafki</td><td></td>PCR</tr><tr><td>(specyficzne dla systemów Agilent TapeStation)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>System czyszczenia DNA z kulkami magnetycznymi (ProNex&reg; System selektywnego oczyszczania)</td><td>Promega</td><td>NG2002</td><td></td></tr><tr><td>Podstawka magnetyczna na 96 dołków (Magnetic Stand-96)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Folia Micro-seal do płytki 96-dołkowej</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>zestaw odczynników MiSeq v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td>zawiera wstępnie napełnione, gotowe do użycia wkłady z odczynnikami.</td></tr><tr><td>System MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>zawiera preinstalowane oprogramowanie</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz klasy molekularnej</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>11-05-01-04</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH) klasy cząsteczkowej 1M</td><td>Merck KGaA</td><td>1091371000</td><td></td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe</td><td>Nie określono</td><td>Nie określono</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td> <td>wielofunkcyjnaCleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>Ow D2 Szerokożelowy system elektroforetyczny</td><td>ThermoFisher</td><td>D2</td><td></td></tr><tr><td>Ow EC-105 Kompaktowy zasilacz</td><td>ThermoFisher</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do pelletu&mdash; Silnik bezprzewodowy</td><td>ThermoFisher</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sterujący PhiX v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-300</td><td>gotowa do użycia biblioteka sterowania do sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Nie określono</td> Nie <td>określono</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Nie określono</td><td>Nie określono</td><td>2, 10, 20, 100, 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>SterivexTM GP 0,22&nbsp; &mu; m jednostka filtrująca</td><td>MilliporeSigma</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>stołowa Eppendorf 5427R Wirówka</td><td>Eppendorf AG</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE</td><td>Bufor ThermoFisher</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>TE (pH 8,0)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>Terr PCR Direct FFPE Kit</td><td>Takara Bio USA</td><td>639284</td><td>zawiera 2X Terra PCR Direct Buffer</td></tr><tr><td>Bezpośrednia mieszanina polimerazy Terra PCR, 1,25 u/&mu; L</td><td>Takara Bio USA</td><td>639271</td><td>Wysokowydajna, odporna na inhibitory polimeraza DNA</td></tr><tr><td>ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler)</td> <td>ThermoFisher</td><td>A37835</td><td></td></tr><tr><td>TransIlluminator i system przechwytywania obrazu</td><td>Analytik Jena, AG</td><td>GelDoc-ItTS2 Imager</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 1.0&nbsp; m membrana o wielkości porów</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA111110</td><td></td></tr></tbody></table>

ustandaryzowana procedura monitorowania szkodliwych zakwitów glonów w chile za pomocą analizy metabarcoding

A Standardized Procedure for Monitoring Harmful Algal Blooms in Chile by Metabarcoding Analysis

Monitorowanie szkodliwych zakwitów glonów (HABs) zostało wdrożone na całym świecie, a Chile, kraj słynący z rybołówstwa i akwakultury, od dziesięcioleci intensywnie wykorzystuje do tego celu analizy mikroskopowe i toksyczne. Metody biologii molekularnej, takie jak wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA i podejścia oparte na zbiorach bakterii, dopiero zaczynają być wprowadzane do chilijskiego monitoringu HAB, a procedury nie zostały jeszcze ustandaryzowane. Tutaj stopniowo wprowadzane są analizy metabarkodowania 16S rRNA i 18S rRNA do monitorowania chilijskich HAB. Zgodnie z niedawną hipotezą, wzajemne powiązanie glonów i bakterii odgrywa krytyczną synergiczną lub antagonistyczną zależność, odpowiadając za inicjację, utrzymanie i regresję zakwitu. W związku z tym monitorowanie HAB z perspektywy glonów i bakterii może zapewnić szersze zrozumienie mechanizmów HAB i podstawę wczesnego ostrzegania. Analiza metabarcoding jest jednym z najlepiej nadających się narzędzi molekularnych do tego celu, ponieważ może wykryć ogromne informacje taksonomiczne dotyczące glonów i bakterii w próbce. Przedstawione tu wizualne procedury pobierania próbek do analizy metabarcoding zawierają szczegółowe instrukcje, mające na celu zmniejszenie liczby błędów i zebranie wiarygodnych danych.

Niniejszy protokół wykorzystuje analizę metabarkodowania genu 18S rRNA do identyfikacji gatunków glonów w próbkach wody morskiej. Reprezentatywny wynik przedstawiono w Rysunek 1w której wodę morską pobraną w miejscowości Metri, Puerto Montt, Chile (−41,597; −72,7056) w dniu 19 lutego 2019 r. przeanalizowano zgodnie z tym protokołem. Wynik wykazał łącznie 13 750 odczytów z ponad 30 gatunkami glonów w próbce wody morskiej. Dominującym glonem w tej próbce był Navicula spp.z względną obfitością wynoszącą 70,77%. Ponadto zaobserwowano wystarczającą obfitość w przypadku Micromonas (6.40%), Chaetoceros spp. (4.44%), Scripsiella spp. (2,44%), i Prorocentrum spp.. (1.28%). Pseudochattonella spp.wykryto w tej próbce wody morskiej w ilości 0,52% gatunek, który jest jednym z głównych toksycznych glonów wywołujących zakwity HAB w Chile.
Aby zweryfikować wiarygodność danych, gatunki alg zidentyfikowane na podstawie analizy genu 18S rRNA porównano z tymi uzyskanymi za pomocą mikroskopii w tej samej próbce wody morskiej (Rysunek 2). Zgodnie z analizą genu 18S rRNA, mikroskopia wykazała, że gatunkiem dominującym był Navicula spp z względną obfitością 74,1%, a Prorocentrum spp. (0,60%) stanowił gatunek rzadki. Z kolei Heterocapsa spp. (9,04%), odnotowane podczas obserwacji mikroskopowych, nie zostały zidentyfikowane w tej próbce za pomocą analizy genu 18S rRNA. Mikroskopia wykazała obecność 12,6% małych, niemal nieidentyfikowalnych komórek fitoplanktonu. Zgodnie z wynikami analizy 18S rRNA, mogły to być Micromonas.
Protokół wykorzystuje analizę metabarcodingu genu 16S rRNA do identyfikacji gatunków bakterii w próbkach wody morskiej. Reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 3, na którym przeanalizowano tę samą wodę morską, która służyła do analizy genu 18S rRNA, tym razem z zastosowaniem analizy genu 16S rRNA. Wynik wykazał łącznie 31 758 odczytów z ponad 30 gatunkami bakterii w próbce wody morskiej. Należy zaznaczyć, że próbka wody morskiej została przepuszczona przez tandemowe membrany filtracyjne (o rozmiarach porów 1 µm i 0,2 µm), aby oddzielić bakterie wolnożyjące od bakterii przytwierdznych. Następnie komórki wychwycone przez każdą z membran filtracyjnych poddano ekstrakcji DNA, a następnie analizie genu 16S rRNA. Reprezentatywny wynik na Rysunku 3 przedstawia gatunki bakterii zidentyfikowane z membrany o rozmiarze porów 0,2 µm, które zdefiniowano jako bakterie wolnożyjące. Dominującym gatunkiem bakterii wolnożyjących był Amylibacter spp. z względną obfitością 20,02%, a następnie Clade Ia (13,53%) i Aligiphilus spp. (7,06%). Pozostałe gatunki bakterii wykryte w tej próbce wody morskiej były rozłożone stosunkowo równomiernie. Taka sama analiza może zostać przeprowadzona dla komórek wychwyconych przez membranę o rozmiarze porów 1 µm w celu wykrycia gatunków bakterii przytwierdznych.
Gdy te testy metabarkodowania są przeprowadzane w zaplanowanych odstępach czasu w określonym okresie badania, wyniki można zestawić w formie analizy szeregów czasowych. Jednym ze sposobów jest przedstawienie względnej liczebności konkretnych gatunków glonów i bakterii w funkcji czasu, aby zidentyfikować unikalny wzorzec wzrostu. Rycina 4 przedstawia reprezentatywny wykres szeregów czasowych dla Alexandrium i Pseudochattonella w Metri w Chile. Innym sposobem podsumowania analizy metabarkodowania szeregów czasowych jest przedstawienie wszystkich zidentyfikowanych glonów i bakterii w funkcji czasu, co obrazuje zmiany populacyjne określonych grup organizmów. Rycina 5 oraz Rycina 6 przedstawiają odpowiednio względną liczebność wszystkich wykrytych z wody morskiej w Metri rodzajów i rzędów bakterii w okresie pięciu miesięcy.
Tabela 1: Skład pierwszej mieszaniny reakcyjnej (master mix) PCR: Tabela przedstawia skład mieszaniny reakcyjnej na jedną reakcję dla analiz 16S rRNA i 18S rRNA. Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Sekwencje starterów: Wymieniono startery do pierwszej reakcji PCR dla analiz 16S rRNA oraz 18S rRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Cykle PCR: Wykazano cykle termiczne dla pierwszej i drugiej reakcji PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Sekwencje indeksów: Wymieniono primery Index 1 (i7) i Index 2 (i5) do zastosowania w drugiej reakcji PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Table%204.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Przykład rozmieszczenia Indeksu 1 i Indeksu 2: Aby zmniejszyć ryzyko błędu, primery indeksujące muszą zostać umieszczone w odpowiedniej pozycji, a następnie każda ich porcja zostaje przeniesiona do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Table%205.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Przykład arkusza próbek: Przed sekwencjonowaniem należy utworzyć arkusz próbek odpowiadający adapterom indeks 1 oraz indeks 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Table%206.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Wykres kołowy różnorodności fitoplanktonu przedstawiający rozkład gatunków; Navicula dominuje z wartością 70,73%." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62967/62967fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywny wynik analizy metabarkodowania 18S rRNA: Gatunki alg obecne w próbce wody morskiej pobranej w Metri, Los Lagos, Chile w dniu 19 lutego 2019 r. zostały zidentyfikowane za pomocą testu metabarkodowania 18S rRNA. Sekwencje oznaczone jako „nieznane” zostały usunięte, a następnie wykreślono względną liczebność każdego zidentyfikowanego gatunku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/62967fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres kołowy rozmieszczenia morskiego fitoplanktonu; przedstawia procentowy udział gatunków w całkowitej liczbie 166." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62967/62967fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywny wynik analizy mikroskopowej: Gatunki glonów zostały zidentyfikowane za pomocą mikroskopii w próbce wody pobranej z Metri, Los Lagos, Chile w dniu 19 lutego 2019 r. Liczebność każdego gatunku została policzona ręcznie i przedstawiona na wykresie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/62967fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres kołowy różnorodności bakterii; taksonomia drobnoustrojów; wyniki analizy danych ekologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62967/62967fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywny wynik analizy metabarcodingu 16S rRNA: Gatunki bakterii obecne w próbce wody z Metri, Los Lagos, Chile pobranej 19 lutego 2019 r., zidentyfikowano za pomocą testu metabarcodingu 16S rRNA. Przedstawiono względną obfitość każdego zidentyfikowanego gatunku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/62967fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Względna liczebność, Alexandrium vs. Pseudochattonella; wykres słupkowy; badanie morskich populacji drobnoustrojów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62967/62967fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywny wykres szeregów czasowych dla Alexandrium spp. i Pseudochattonella spp. uzyskany za pomocą metabarkodowania 18S rRNA w Metri, Chile: Rycina przedrukowana z pracy Yarimizu i wsp.9. Dwa toksyczne gatunki glonów, Alexandrium i Pseudochattonella, były selektywnie monitorowane za pomocą analizy 18S rRNA w czasie, a ich względna liczebność została przedstawiona jako funkcja punktów czasowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/62967fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych genomowych; wykres słupkowy; wizualizacja różnorodności genetycznej; badanie genomiki porównawczej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62967/62967fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywny wykres szeregów czasowych rodzajów uzyskany z metabarcodingu 16S rRNA i 18S rRNA: Wszystkie zidentyfikowane rodzaje bakterii i eukariotów w wodzie z Metri w Chile, monitorowane przez pięć miesięcy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/62967fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza różnorodności genetycznej, skumulowany wykres słupkowy, struktura populacji, częstość alleli, bioinformatyka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62967/62967fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Reprezentatywny wykres szeregów czasowych dla rzędów uzyskany z metabarkodowania 16S rRNA i 18S rRNA: Wszystkie rzędy bakterii i eukariotów zidentyfikowane w wodzie w Metri, Chile, monitorowane przez pięć miesięcy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/62967fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela S1 i Tabela S2: 
Tabela S1: Surowe dane dla Rysunku 5 i Rysunku 6. Tabela S2: Wynik kontroli jakości (QC) surowych danych dla Rysunku 5 i Rysunku 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62967/Tables%20S.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać te tabele.</a>

Ten protokół wprowadza etapy analizy metabarcodingu, ukierunkowane na geny 16S rRNA i 18S rRNA, do monitorowania szkodliwych zakwitów glonów i związanego z nimi mikrobiomu w próbkach wody morskiej. Jest to potężne narzędzie oparte na molekularności, ale wymaga kilku procedur, które są tutaj wizualnie wyjaśnione krok po kroku.

Ustandaryzowana procedura monitorowania szkodliwych zakwitów glonów w Chile za pomocą analizy metabarcoding

Harmful algae blooms (HABs) monitoring has been implemented worldwide, and Chile, a country famous for its fisheries and aquaculture, has intensively used ...

Protokół ten przedstawia wgląd w zakwity glonów i sposoby skutecznego monitorowania toksycznych gatunków glonów. Procedura pomaga zapewnić wczesne ostrzeganie przed zakwitami glonów, aby chronić społeczność przed związanymi z tym szkodami. Analiza metabarcoding może wykryć wiele gatunków w próbce jednocześnie, ale wymaga skomplikowanych procedur.Ten protokół wizualnie wyjaśnia każdy krok, aby zminimalizować błędy ludzkie podczas analizy. Procedury mikroskopowe zostaną zademonstrowane przez Henry'ego Camerona z Uniwersytetu w Antofagaście, pobranie próbek przez Jonathana Vilugrona z Instituto de Fomento Pesquero, wstępna obróbka próbek przez Karen Vergara z Uniwersytetu Los Lagos oraz analiza metabarcodingu przez Ignacio Rillinga i Marco Camposa z Uniwersytetu La Frontera. Zacznij od pobrania trzech litrów próbki wody z miejsca docelowego.Przefiltruj jeden litr wody do analizy 16S rRNA przez filtrację tandemową, aby oddzielić wolno żyjące i przyłączone bakterie. Następnie przefiltruj kolejny litr wody do analizy 18S rRNA przez pojedynczą filtrację z membraną o grubości 0,2 mikrona. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych przeciąć przefiltrowaną membranę na pół, jedną połowę owinąć folią aluminiową do przechowywania, a drugą połową przystąpić do ekstrakcji DNA metodą Chevel.W celu analizy mikroskopowej przenieś jeden mililitr próbki wody na jednomililitrowe szkiełko siatkowe za pomocą pipety. Badać próbkę pod mikroskopem i zanotować nazwy oraz ilość gatunków fitoplanktonu. Wyczyść pipety w szafce z kapturem laminarnym 70% etanolem, a następnie poddaj je ekspozycji na promieniowanie UV przez 30 minut.W przypadku pierwszej generacji amplikonów PCR należy podać 22,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej w ośmioprobówkowym pasku, a następnie 2,5 mikrolitra próbki DNA, a następnie przeprowadzić pierwszy cykl PCR. Następnie przygotuj 100 mililitrów 2% żelu do gazowania GAROZY TBE zawierającego 10 mikrolitrów barwnika w żelu z kwasem nukleinowym. Gdy żel jest gotowy, załaduj mieszaninę zawierającą 1,5 mikrolitra barwnika ładującego DNA i cztery mikrolitry produktu PCR i wykonuj elektroforezę przy napięciu 100 woltów przez 30 minut.Następnie zobrazuj żel w świetle UV i potwierdź obecność pasma od 500 do 600 par zasad. Brakujące amplikony można czasami rozwiązać, rozcieńczając próbkę wodą do 1000 razy. Następnie użyj systemu oczyszczania DNA opartego na kulkach magnetycznych, aby oczyścić pierwsze produkty PCR, a następnie przenieś 20 mikrolitrów każdego oczyszczonego pierwszego produktu PCR na nową 96-dołkową płytkę i uszczelnij płytkę folią Microseal.Przechowuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do następnego kroku. W przypadku indeksacji przez drugi PCR, po rozcieńczeniu wszystkich starterów indeksu pierwszego i indeksu dwa do stężenia jednego mikromola wodą klasy PCR w ośmiu probówkach PCR, należy umieścić startery indeksu pierwszego w rzędzie poziomym i indeksować dwa startery w rzędzie pionowym. Następnie, używając pipety wielokanałowej o pojemności 2,5 mikrolitra, indeksuj, jeden starter do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki.Następnie dodaj 12,5 mikrolitra preparatu gotowego do gorącego startu do każdego dołka. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra indeksu dwa startery i 7,5 mikrolitra oczyszczonego pierwszego produktu PCR do każdej studzienki. Po wymieszaniu przez 10-krotne pipetowanie w górę i w dół, przykryj płytkę folią Microseal i uruchom drugi cykl PCR.Po zakończeniu PCR umieść taśmę przesiewową DNA w analizatorze fragmentów. Wymieszać dwa mikrolitry buforu próbki w trzech mikrolitrach drugiego amplikonu PCR w nowych ośmiu paskach probówek i włożyć paski do analizatora fragmentów, aby rozpocząć analizę. Upewnij się, że drugie amplikony PCR mają około 613 par zasad zarówno dla genów 16S, jak i 18S rRNA.Oczyść drugie produkty PCR za pomocą systemu oczyszczania DNA z kulkami magnetycznymi, jak pokazano wcześniej. Następnie zmierz stężenie ich DNA za pomocą spektrofotometru do kwantyfikacji kwasów nukleinowych. Na nowej 200-mikrolitrowej 96-dołkowej płytce rozcieńczyć każdy oczyszczony drugi produkt PCR sterylną wodą PCR do czterech nanomoli.Następnym krokiem jest to, że protokół musi zostać wykonany bez zatrzymywania się. Podaniec trzy mikrolitry każdego rozcieńczonego drugiego produktu PCR w nowej sterylnej probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby utworzyć zbiorczą bibliotekę. Zawsze utrzymuj rurkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dzień przed sekwencjonowaniem wyjmij wstępnie napełniony, gotowy do użycia wkład z odczynnikiem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i umieść go w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu rozmrożenia. W dniu sekwencjonowania ustaw blok grzewczy odpowiedni dla 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych na 96 stopni Celsjusza i umieść bufor hybrydyzacyjny na lodzie. Następnie rozcieńczyć wodorotlenek sodu klasy cząsteczkowej wodą i rozcieńczyć gotową do użycia bibliotekę kontrolną buforem TE.Wymieszaj 16 mikrolitrów z czterech nanomoli lub zbiorczej biblioteki próbek z czterema mikrolitrami z biblioteki kontrolnej w nowej probówce oznaczonej jako jeden. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów próbki z pierwszej probówki z 10 mikrolitrami wodorotlenku sodu w nowej probówce oznaczonej jako dwa. Po wirowaniu i krótkim wirowaniu inkubować probówkę drugą w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie dodać 980 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego.Następnie, w nowej probówce oznaczonej jako trzy, wymieszaj 260 mikrolitrów próbki z drugiej probówki z 390 mikrolitrami buforu hybrydyzacyjnego. Po wymieszaniu zawartości przez odwrócenie probówki, inkubować ją w temperaturze 96 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie inkubować na lodzie przez dwie minuty. Następnie wyjmij wkład z lodówki i ustaw arkusz próbki do sekwencjonowania z każdym odpowiednim adapterem o indeksie jeden i indeksie drugim.Po wyjęciu celi przepływowej z zestawu MiSeq V3, delikatnie wyczyść celę przepływową sterylną wodą do PCR klasy molekularnej. Załaduj całą objętość rurki trzeciej do wkładu. Następnie w oprogramowaniu do obsługi przyrządu wybierz sekwencjonowanie i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby włożyć celę przepływową, bufor inkorporacyjny i wkład.Na koniec załaduj arkusz próbki i naciśnij Uruchom, aby rozpocząć reakcję. Ten przebieg sekwencji trwa od trzech do pięciu dni. Analiza metabarkodowania 18S rRNA w celu identyfikacji gatunków glonów obecnych w wodzie morskiej pobranej z Metri Puerto Montt w Chile 19 lutego 2019 r. przyniosła 13 750 odczytów, z ponad 30 gatunkami glonów.Gatunek Navicula był dominującym algorytmem ze względną liczebnością 70,73%Wystarczającą liczebność zaobserwowano również dla gatunków Micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella i Prorocentrum. Gatunek Pseudochattonella, jeden z głównych czynników wywołujących szkodliwe zakwity glonów w Chile, ma 0,52% obfitości. Zgodnie z analizą genu 18S rRNA, obserwacja mikroskopowa wykazała, że Navicula jest gatunkiem dominującym, a Prorocentrum gatunkiem drugorzędnym.12,6% małych, niezidentyfikowanych komórek fitoplanktonu zarejestrowanych pod mikroskopem może być Micromonas, zgodnie z wynikami 18S rRNA. Analiza metabarcodingu 16S rRNA w celu identyfikacji gatunków bakterii w tej samej próbce wody wykazała 31 758 odczytów z ponad 30 gatunkami bakterii. Dominującym wolno żyjącym gatunkiem bakterii był Amylibacter, ze względną liczebnością 20,02%, następnie Cladella (13,53%) i Algiphilus (7,06%Względna liczebność dwóch toksycznych gatunków glonów, Alexandrium i Pseudochattonella, jest wykreślana w czasie, aby znaleźć unikalny wzorzec wzrostu.Wykreślono względną liczebność wszystkich rodzajów bakterii w rzędach wykrytych w wodzie morskiej w ciągu pięciu miesięcy i wykorzystano czas na analizę zmian populacji niektórych organizmów. Bardzo ważne jest, aby być wyjątkowo czystym. Należy unikać zanieczyszczenia próbki chusteczką nasączoną alkoholem, światłem UV lub autoklawowaniem materiału.Rozcieńczonych roztworów nie należy używać ponownie, a probówki powinny być zawsze zakryte. Wykrywanie glonów za pomocą metabarcodingu musi być połączone z mikroskopią. Dominujące gatunki można potwierdzić za pomocą mikroskopii, co zapewnia brak błędu ludzkiego podczas procesów metabarcodingu.Szkodliwe zakwity glonów szkodzą ekosystemowi morskiemu i gospodarce przybrzeżnej. W Chile zakwity glonów zabijają łososie hodowlane, niszcząc uprawy ryb. Ta analiza metabarcodingu zwiększy skuteczność ostrzeżeń o zakwitach w Chile.

a-standardized-procedure-for-monitoring-harmful-algal-blooms-chile

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Celem tej procedury jest wykazanie powtarzalności i zdolności adaptacyjnych stosowania formatu płytki do mikroglonów do badań przesiewowych. Ten szybki ekran łączy fluorometrię WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) w celu pomiaru wydajności fotosyntezy jako wskaźnika zdrowia Photosystem II (PSII) z kokulturami bakterii i glonów o małej objętości.

Test biologiczny o małej objętości do oceny wspólnej hodowli bakterii i fitoplanktonu przy użyciu fluorometrii z modulacją amplitudy WATER-Pulse-Amplitude (WATER-PAM)

Integracja hodowli mikroalg z przemysłowymi gazami spalinowymi ostatecznie wprowadzi metale ciężkie i inne związki nieorganiczne do podłoża wzrostowego. W pracy przedstawiono procedurę zastosowaną do określenia końcowego losu i wpływu metali ciężkich i zanieczyszczeń nieorganicznych na wzrost Nannochloropsis salina hodowanych w fotobioreaktorach.

Kwantyfikacja metali ciężkich i innych zanieczyszczeń nieorganicznych na produktywność mikroglonów

Obecność toksyn cyjanobakteryjnych w zbiornikach słodkiej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi jest głównym problemem dla organów zarządzających gospodarką wodną. Aby ocenić ryzyko zanieczyszczenia wody, w artykule opisano protokół wykrywania w terenie szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych przy użyciu chipa mikromacierzy przeciwciał.

Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Szybka multidyscyplinarna strategia wczesnego wykrywania zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn jest opisana tutaj. Pozwala na wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych sinic w próbkach wody oraz w matrycach organicznych, takich jak próbki małży, w ciągu 24 godzin.

Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania

Ten protokół demonstruje użycie platformy technologicznej mikromacierzy fenotypowej (PM) do zdefiniowania wymagań metabolicznych Chlamydomonas reinhardtii, zielonej mikroalgi, i udoskonalenia istniejącego modelu sieci metabolicznej.

Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

Tutaj prezentujemy ekstrakcję i przygotowanie polarnych i półpolarnych metabolitów z holobiontu koralowca, a także wydzielonych tkanek gospodarza koralowców i frakcji komórek Symbiodiniaceae, do analizy metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas.

Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas

Niniejsze badanie podkreśla zalety stosowania metody opracowanej przez Jeffreya i Humphreya do ekstrakcji i ilościowego oznaczania rozpuszczalnych w tłuszczach pigmentów z mikroalg. Metoda ta służy jako cenne narzędzie do oceny wpływu czynników wzrostu na produkcję chlorofilu i zawartość komórkową w tych organizmach.

Ocena wpływu czynników wzrostu na produkcję chlorofilów a i b z mikroalg

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Protokoły szybkiej oceny biologicznej wykorzystujące makrobezkręgowce bentosowe są często używane do monitorowania i oceny jakości wody. Skuteczny protokół obejmuje kolekcje wysięków poczwarkowych Chironomidae unoszących się na powierzchni (SFPE). Opisano tu techniki zbierania w terenie, obróbki laboratoryjnej, montażu szkiełek i identyfikacji Chironomidae SFPE.

Wykorzystanie pływających powierzchniowo wysięków poczwarkowych Chironomidae (Dipterae) jako protokołu szybkiej oceny biologicznej zbiorników wodnych

Poznaj metodę metabarcodingu do monitorowania szkodliwych zakwitów glonów w próbkach wody morskiej. Protokół obejmuje pobieranie próbek, ekstrakcję DNA, PCR i sekwencjonowanie genów 16S i 18S rRNA.

Ustandaryzowana procedura monitorowania szkodliwych zakwitów glonów w Chile za pomocą analizy metabarcoding

Przeglądaj więcej filmów