Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Protokół ten pozwala na obserwację i wykrywanie zdarzeń transkrypcyjnych oraz daje wgląd w wpływ pęknięć podwójnej nici DNA na trwającą transkrypcję genu. Główną zaletą tej techniki jest obserwacja indywidualnie znakowanych transkryptów RNA w pojedynczych komórkach w odstępach sekundowych przez łączny okres jednej godziny lub dłużej. Metoda ta zapewnia wgląd w reakcję na uszkodzenie DNA w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między transkrypcją a procesami komórkowymi, takimi jak replikacja DNA i uszkodzenia DNA.

Naszą radą jest obserwacja komórek za pomocą doksycykliny i wykonywanie pomiarów kalibracyjnych w celu wytrenowania wykrywania miejsca transkrypcji i znakowanych cząsteczek RNA. W 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki przygotować roztwór A zawierający 150 mikrolitrów zredukowanego DNA osocza MEM w surowicy i 2,5 mikrograma na mikrolitr DNA w odczynniku pomocniczym do transfekcji. Równolegle przygotować roztwór B zawierający 150 mikrolitrów zredukowanego MEM w surowicy i 1,5 mikrograma na mikrolitr DNA w odczynniku do transfekcji na bazie lipidów.

Inkubować oba roztwory w temperaturze pokojowej przez pięć minut, następnie delikatnie dodać roztwór A do roztworu B i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby przetransfekować komórki, dodaj kroplami 300 mikrolitrów zmieszanego roztworu A i B do każdego naczynia i delikatnie rozprowadz. Przechowuj naczynie ze szklanym dnem w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 milimetrów i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla.

Przygotować 1,5-mililitrową mikroprobówkę wirówkową z 200 mikrolitrami DMEM z HEPES bez czerwieni fenolowej i uzupełnioną 10% surowicą bydlęcą pozbawioną węgla drzewnego, a następnie dodać TA. Na około godzinę przed rozpoczęciem obserwacji mikroskopowej wywołaj transkrypcję genów reporterowych, dodając doksycyklinę do pożywki wzrostowej i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów. Przenieś komórki do mikroskopu co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji i umieść 100-milimetrową szalkę z komórkami w nagrzanej dużej komorze inkubacyjnej mikroskopu. Umieść probówkę wirówki mikrowirówkowej ze wstępnie rozcieńczonym TA w dużej komorze środowiskowej mikroskopu, aby ogrzać ją do 37 stopni Celsjusza.

Zastąp pokrywkę naczynia ze szklanym dnem pokrywką z wywierconym otworem o średnicy trzech milimetrów. Wybierz obiektyw zanurzeniowy 100X w olejku na panelu sterowania mikroskopu i nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Ustaw naczynie ze szklanym dnem z komórkami wewnątrz komory inkubacyjnej stopnia mikroskopu i zablokuj je na miejscu, a następnie zamknij pokrywę inkubatora stage i wszystkie drzwi obudowy mikroskopu.

Uruchom oprogramowanie do obsługi i sterowania mikroskopem, otwórz okno sterowania ostrością i kliknij okienko zakresu. W okienku wyboru emisji kliknij pole 100%eye, aby ustawić ścieżkę wiązki gałki ocznej dla bezpośredniej obserwacji próbki przez oko. W menu zestawu filtrów przełącz się na zestaw filtrów oczu i kliknij opcję Jasne pole, a następnie naciśnij przycisk otwierania Jasne pole.

Przesuń obiektyw mikroskopu w kierunku szklanego dna naczynia, aż olej dotknie szkła. Spójrz przez lornetki i ręcznie ustaw ostrość na płaszczyźnie komórek, a następnie wyłącz otwarty przycisk Brightfield. Pozostaw komórki na 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji eksperymentalnych, aby umożliwić im dostosowanie się do warunków środowiskowych i zapobiec dryfowaniu ogniskowej podczas obrazowania z powodu gradientów temperatury.

Ustaw mikropipetę o pojemności 200 mikrolitrów i końcówki filtrujące o pojemności 200 mikrolitrów w temperaturze pokojowej. W oknie sterowania ostrością w oprogramowaniu sterującym mikroskopem ustaw intensywność lasera na 5% i wprowadź wartość 50 milisekund jako czas naświetlania. Otwórz okno przechwytywania, aby dostosować ustawienia w celu automatycznego pozyskiwania obrazów trójwymiarowych timelapsów.

Wybierz typ akwizycji przechwytywania 3D i ustaw od 12 do 16 warstw optycznych oddzielonych od siebie o 0,4 mikrometra. Zaznacz pola wyboru zasięgu wokół prądu i wróć do bieżącej pozycji po przechwyceniu. W okienku przechwytywania poklatkowego wprowadź wartość 120 dla liczby punktów czasowych i 30 sekund dla interwału.

Wybierz zestaw filtrów konfokalnych zgodnie z etykietami transektowanych białek fluorescencyjnych, jak podano w manuskrypcie tekstowym i ustaw czas ekspozycji dla każdego kanału na 50 milisekund. Użyj prądu ustawionego dla mocy lasera, aby użyć wartości 5% wybranej w oknie ostrości. W oknie sterowania ostrością przejdź do okienka aparatu, wybierz kontrolkę skalowania wyświetlania obrazu i wybierz przycisk ręczny, aby ustawić stały zakres intensywności obrazu, który ma być wyświetlany.

Wybierz komórki do obrazowania poklatkowego 3D miejsc transkrypcji po indukcji pęknięcia podwójnej nici DNA. Prześwietl komórki i wybierz trzy pola widzenia zgodnie z warunkami opisanymi w dyskusji nad tekstem. Skoncentruj się na każdej wybranej komórce, która wcześniej znajdowała się w środku pola widzenia, z miejscem transkrypcji w środkowej płaszczyźnie stosu Z.

Zaznacz każdą pozycję XYZ w płaszczyźnie XY okna sterowania ostrością, klikając przycisk Ustaw punkt. Dodaj 200 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonego TA do komórek i rozpocznij obrazowanie szeregów czasowych 3D, klikając start w oknie przechwytywania. Zapisz dane obrazowania w formacie danych oprogramowania sterującego mikroskopem na dysku twardym komputera sterującego mikroskopem.

Dodaj 0,5 mikrograma na mililitr doksycykliny do pożywki wzrostowej komórek na godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu mikroskopowego. Zamontuj szklaną dolną miskę w komorze inkubacyjnej stolika mikroskopowego i przygotuj akwizycję obrazu, jak pokazano wcześniej. Użyj tych samych ustawień intensywności lasera i ekspozycji, co poprzednio.

Ustaw ustawienia przechwytywania dla szeregów czasowych 2D i ustaw 120 punktów czasowych w odstępach 500 milisekund w panelu przechwytywania poklatkowego. Pozyskaj dziesiątki szeregów czasowych kalibracji z wielu pozycji, aby wygenerować zestawy danych w celu zliczenia kilkuset pojedynczych pomiarów TFI z pojedynczym transkryptem. Korzystając z tego protokołu, uzyskuje się wykres przedstawiający liczbę znakowanych fluorescencyjnie transkryptów genów reporterowych w czasie z rozdzielczością czasową wynoszącą sekundy w okresach do godzin.

Przedstawiono tutaj przebieg w czasie wartości TFI miejsca transkrypcji genu reporterowego PROM znakowanego przez akumulację białka płaszcza MS2 znakowanego zielonymi cząsteczkami białka fluorescencyjnego na powstających transkryptach. Indukcja pojedynczego DSB w genach reporterowych umożliwia zbadanie jego wpływu na trwającą transkrypcję genu reporterowego oraz monitorowanie zdarzeń transkrypcyjnych pojawiających się w miejscu DSB, a mianowicie transkrypcji indukowanej przerwaniem. Dodanie TA i indukcja DSB prowadzi do zahamowania transkrypcji genu reporterowego PROM po około 11 minutach, która nie jest przywracana do 60 minut.

Całkowite odzyskanie sygnału PP7-RFP wykazuje inicjację transkrypcji wywołaną przerwaniem. Antysensowny gen reporterowy EXON 2 wykazuje zakończenie transkrypcji sterowane przez promotor, które jest następnie zastępowane transkrypcją indukowaną przerwaniem antysensownym, co ujawnia się przez akumulację białka płaszcza MS2 znakowanego czerwonym białkiem fluorescencyjnym wiążącym się z RNA generowanym z antysensownych sekwencji pętli macierzystej MS2. Wybór komórek do obrazowania, skonfiguruj leczone obrazowanie poklatkowe, dostosowując pozycję Z znakowanego miejsca transkrypcji na każdej pozycji XY do środka stosu Z, który ma zostać uzyskany.

I wreszcie, dodawanie TA rozcieńczonego w pożywce wzrostowej musi być wykonane z najwyższą ostrożnością, aby zapobiec jakimkolwiek przesunięciom wstępnie wybranych pozycji z komórkami, które mają być obrazowane. Obrazowanie pojedynczych transkryptów RNA w 3D w czasie w żywych komórkach można zastosować do badania transkrypcji RNA podczas replikacji DNA lub zmian transkrypcji podczas progresji cyklu komórkowego.