Name: Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania aktywności transkrypcyjnej w żywych komórkach przy pęknięciach dwuniciowych DNA. Technika fluorescencyjna umożliwia obserwację pojedynczych cząsteczek RNA z rozdzielczością czasową do sekund.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy RH Singerowi, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca za dary plazmidów i odczynników. Jesteśmy również wdzięczni pracownikom Zakładu Bioobrazowania iMM, A. Temudo, A. Nascimento i J. Rino, za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca została sfinansowana przez PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 i PTDC/MED-OUT/4301/2020 z Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugalia oraz przez LISBOA-01-0145-FEDER-007391, projekt współfinansowany przez FEDER za pośrednictwem POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa i FCT. Finansowanie uzyskano również z unijnego programu badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" (RiboMed 857119). M.A. jest stypendystą FCT Ph.D. Fellowship 2020.05899.BD.

1. Przygotowanie i transfekcja komórek do mikroskopii żywych komórek
<ol>
	<li>Przygotować kolbę do hodowli komórkowych o długości 25cm2 linii komórek reporterowych (EX2, EX2-AS lub PROM) z 5 ml DMEM, aby osiągnąć 80-90% konfluencji w dniu poprzedzającym eksperyment mikroskopowy z żywymi komórkami.</li>
	<li>Odessać pożywkę pipetą z 25 cm kolby do hodowli 2 komórek i przemyć komórki 2,5 ml 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty w celu oderwania komórek.</li>
	<li>Po oddzieleniu komórek dodać 4 ml DMEM bez buforu HEPES zawierającego czerwień fenolową, uzupełnionego 10% (v/v) pozbawioną węgla drzewnego płodowej surowicy bydlęcej i delikatnie ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Rozlać 1 ml roztworu komórkowego w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm z 10 mm dołkiem ze szklanym dnem (średnica nr 1,5) i homogenizować. Okrągłą naczynie o średnicy 35 mm należy przechowywać w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .</li>
	<li>~ 6 godzin po wysianiu transfekować komórki w naczyniu ze szklanym dnem. Dla każdej mieszaniny transfekcyjnej należy przygotować dwa roztwory w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przygotować roztwór A zawierający 150 μl pożywki minimalnej ilości niezbędnej pożywki (MEM) o zredukowanej surowicy, plazmidowego DNA (zgodnie z opisem w Tabeli 1) i 2,5 μg/μl DNA odczynnika pomocniczego do transfekcji (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Równolegle przygotować roztwór B zawierający 150 μl MEM o zmniejszonej surowicy i 1,5 μg/μl DNA odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Inkubować oba roztwory w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Następnie delikatnie dodać roztwór A do roztworu B i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aby przetoczyć transfekcję komórek, dodaj kroplami 300 μl roztworu A + B do każdego naczynia i delikatnie rozprowadź. Przechowywać naczynie ze szklanym dnem w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml z 200 μl DMEM z HEPES, bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej pozbawionej węgla drzewnego i dodać TA do stężenia 7,5 x 10-7 M.</li>
</ol>
2. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Ustawić temperaturę w dużej komorze inkubacyjnej mikroskopu z pleksiglasu i komorze inkubacyjnej najwyższego stopnia na 37 °C we wspólnej jednostce sterującej. Ustaw warunki środowiskowe wewnątrz komory inkubacyjnej stage na 5% CO2 i 100% wilgotności. 
	UWAGA: Temperaturę klatki mikroskopu i inkubatora stage należy ustawić co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić podgrzanie całego systemu w celu zminimalizowania wahań temperatury. Uruchom wszystkie inne jednostki sterujące i operacyjne mikroskopu w tym samym czasie.</li>
	<li>Indukować transkrypcję genów reporterowych, dodając doksycyklinę (0,5 μg/ml) do pożywki wzrostowej i delikatnie mieszać, pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl ~ 1 h przed rozpoczęciem obserwacji mikroskopowej. 
	UWAGA: Naczynie ze szklanym dnem z transfekowanymi komórkami należy przechowywać w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm, co ułatwia obsługę i transport z hodowli komórkowej do pomieszczenia mikroskopu w styropianowym pojemniku, aby utrzymać jak najbardziej stabilną temperaturę.</li>
	<li>Przetransportować komórki do mikroskopu co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji, a po przybyciu umieścić 100-milimetrową szalkę z komórkami bezpośrednio w wstępnie podgrzanej dużej komorze inkubacyjnej mikroskopu.</li>
	<li>Umieścić probówkę wirówkową ze wstępnie rozcieńczonym TA z kroku 1.7 w dużej komorze środowiskowej mikroskopu, aby rozgrzała się do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Załóż pokrywkę naczynia ze szklanym dnem podobną do tej przygotowanej wcześniej z otworem o średnicy 3 mm wywierconym w pokrywie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). 
	UWAGA: TA zostanie później dodany do komórek przez mały otwór w pokrywie bez manipulowania naczyniem zamontowanym na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Wybierz 100-krotny (obiektyw apochromatyczny, apertura numeryczna 1,4) obiektyw zanurzeniowy z olejkiem na panelu sterowania mikroskopu. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw.
	<ol>
		<li>Ustaw naczynie ze szklanym dnem z komórkami wewnątrz komory inkubacyjnej stolika mikroskopu i zablokuj je na miejscu. Zamknij pokrywę inkubatora stage i wszystkie drzwiczki obudowy mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do obsługi i sterowania mikroskopem, otwórz okno Kontrola ostrości (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B), kliknij panel Zakres, a następnie w panelu Wybór emisji kliknij pole 100% Oko, aby ustawić ścieżkę wiązki gałki ocznej dla bezpośredniej obserwacji próbki przez oko.
	<ol>
		<li>W menu Zestaw filtrów przełącz się na Zestaw filtrów oczu i kliknij opcję Jasne pole, a następnie naciśnij przycisk Otwórz jasne pole.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesuń obiektyw mikroskopu w kierunku szklanego dna naczynia, aż olej dotknie szkła. Następnie spójrz przez okulary i ręcznie skup się na płaszczyźnie komórek. Wyłącz przycisk Otwórz jasne pole.</li>
	<li>Pozostaw komórki na 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji eksperymentalnych, aby dostosować się do warunków środowiskowych i zapobiec dryfowaniu ogniskowej podczas obrazowania przez gradienty temperatury.</li>
	<li>Umieść mikropipetę o pojemności 200 μl i końcówki filtrujące o pojemności 200 μl gotowe do użycia w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>W oknie Focus Control w oprogramowaniu sterującym mikroskopem ustaw intensywność lasera na 5% i wprowadź wartość 50 ms dla czasu naświetlania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Otwórz okno Przechwytywanie, aby dostosować ustawienia w celu automatycznego akwizycji obrazu trójwymiarowych (3D) filmów poklatkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Wybierz typ akwizycji przechwytywania 3D i ustaw od 12 do 16 warstw optycznych oddzielonych od siebie 0,4 μm, zaznacz pola wyboru Zakres wokół bieżącego i Wróć do bieżącej pozycji po przechwyceniu.</li>
	<li>W okienku Timelapse Capture (Przechwytywanie poklatkowe) wprowadź wartość 120 dla pola # punktów czasowych i 30 s dla interwału.</li>
	<li>Wybierz zestaw filtrów konfokalnych zgodnie z transfekowanymi znacznikami białek fluorescencyjnych z λ = 488 nm dla GFP, λ = 561 nm dla TagRFPt i λ = 640 nm dla iRFP713 i ustaw czas ekspozycji dla każdego kanału na 50 ms.</li>
	<li>Użyj ustawienia Prąd dla mocy lasera, aby użyć wartości 5% wybranej w oknie ostrości (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>W oknie Focus Control (Kontrola ostrości) przejdź do okienka Camera (Kamera), wybierz kontrolkę Skaluj wyświetlanie obrazu i wybierz przycisk Manual (Ręcznie), aby ustawić stały zakres intensywności obrazu, który ma być wyświetlany. Wprowadź wartości w polach Niskie: 500 i Wysokie: 5000 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: To ustawienie ogranicza zakres dynamiczny przechwytywania z kamery wyświetlanego w podglądzie na żywo, aby wybrać komórki w tym samym zakresie intensywności fluorescencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Wybierz komórki do obrazowania poklatkowego 3D miejsc transkrypcji po indukcji DSB. Prześwietl komórki i wybierz trzy pola widzenia zgodnie z warunkami opisanymi w dyskusji.</li>
	<li>Skoncentruj się na każdej wybranej komórce, która wcześniej znajdowała się w środku pola widzenia, z miejscem transkrypcji w środkowej płaszczyźnie stosu Z. 
	UWAGA: Wyśrodkowanie komórki i miejsca transkrypcji w XYZ dostosowuje się do pewnego ruchu komórki.</li>
	<li>Zaznacz każdą pozycję XYZ w panelu XY w oknie Focus Control (Sterowanie fokusem), klikając polecenie Set Point. 
	UWAGA: Ponownie odwiedź wybrane pozycje 2-3 razy w ciągu następnych 5 minut, aby potwierdzić ciągłą transkrypcję genów reporterowych i względną stabilność pozycyjną pozycji komórek w wymiarach XYZ.</li>
	<li>Dodaj 200 μl wstępnie rozcieńczonego TA z kroku 1.7. do komórek, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2F. 
	UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotykać naczynia ze szklanym dnem ani pokrywki podczas dodawania TA, aby zapobiec przesunięciu się z zaznaczonych pozycji XY. Po indukcji DSB upewnij się, że komórki są wyśrodkowane w polu widzenia, a miejsce transkrypcji znajduje się w środkowej płaszczyźnie Z. Ponowne ustawianie ostrości i aktualizacja pozycji nie powinny zająć więcej niż 1-2 minuty.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie szeregów czasowych 3D, klikając przycisk Start w oknie Przechwytywanie.</li>
	<li>Zapisz dane obrazowania w formacie danych oprogramowania sterującego mikroskopem na dysku twardym komputera sterującego mikroskopem.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz dane obrazowania w oprogramowaniu sterującym mikroskopem i wyeksportuj je jako 16-bitowe pliki w formacie TIFF.</li>
	<li>Otwórz wyeksportowane pliki za pomocą oprogramowania StaQtool21. Wybierz tryb Single Spot 3D i załaduj pliki obrazów, naciskając Go. 
	UWAGA: Wybrany szereg czasowy otwiera się w przeglądarce Max Projection Timelapse Viewer, pokazując projekcję maksymalnej intensywności stosu z pierwszego punktu czasowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Dostosuj intensywność wyświetlania obrazu za pomocą pionowego suwaka MAX po lewej stronie.</li>
	<li>Wybierz punkt czasowy do analizy za pomocą poziomego suwaka Punkt czasowy.</li>
	<li>Najedź kursorem na pozycję oznaczonej strony transkrypcji w celu ręcznego zaznaczenia lub użyj funkcji automatycznego wykrywania i naciśnij odpowiednią witrynę transkrypcji, jeśli wykryto kilka obiektów.</li>
	<li>Użyj funkcji automatycznego śledzenia, aby określić pozycje XYZ miejsca transkrypcji w czasie. 
	UWAGA: Jeśli dana pozycja nie była śledzona poprawnie, należy ręcznie wybrać miejsce transkrypcji zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania StaQtool.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Auto, aby wykonać dopasowanie Gaussa dla każdego punktu czasowego i zmierzyć całkowitą intensywność fluorescencji (TFI). 
	UWAGA: Jeśli aktywność transkrypcyjna zostanie zatrzymana, narzędzie śledzące pozostanie w ostatniej pozycji, w której wykryto obiekt ograniczony dyfrakcją (oznaczone miejsce transkrypcji). Jeśli komórka porusza się w kierunku XY po zniknięciu etykiety miejsca transkrypcji, wymagana jest ręczna zmiana położenia kwadratu wyszukiwania.</li>
	<li>Po zakończeniu dopasowywania wartości TFI dla każdego punktu czasowego naciśnij przycisk Zakończ timelapse, aby zamknąć bieżący plik obrazu szeregów czasowych i przejść do następnego pliku. 
	UWAGA: Wartości TFI są automatycznie eksportowane i zapisywane w pliku Excel.</li>
</ol>
5. Kalibracja, pomiary i analiza mikroskopowa
<ol>
	<li>Komórki nasienne umieścić w szalkach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i przetoczyć transfekcję za pomocą fluorescencyjnie znakowanych białek płaszcza MS2 i PP7, jak opisano w sekcji 1. 
	UWAGA: Do pomiarów kalibracyjnych należy użyć tych samych linii komórkowych genu reporterowego, które opisano we Wprowadzeniu.</li>
	<li>Dodać 0,5 μg/ml doksycykliny do pożywki wzrostowej komórek na 1 godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu mikroskopowego.</li>
	<li>Zamontuj szklaną dolną czaszę w komorze inkubacyjnej stolika mikroskopowego i przygotuj akwizycję obrazu jak poprzednio (patrz rozdział 2). 
	UWAGA: Oryginalna pokrywka naczynia ze szklanym dnem nie jest wymieniana na potrzeby eksperymentów kalibracyjnych.</li>
	<li>Stosować te same ustawienia intensywności lasera i ekspozycji, jak opisano w pkt 3.1.</li>
	<li>Ustaw ustawienia przechwytywania dla szeregów czasowych 2D (usuń zaznaczenie opcji 3D w panelu Typ przechwytywania) i ustaw 120 punktów czasowych w odstępach 500 ms w panelu Przechwytywanie poklatkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: To ustawienie akwizycji obrazu spowoduje, że szeregi czasowe w obrębie jednej płaszczyzny optycznej będą wyświetlane w bardzo krótkich odstępach czasu.</li>
	<li>Pozyskaj dziesiątki szeregów czasowych kalibracji z wielu pozycji, aby wygenerować zestawy danych w celu zliczenia kilkuset pojedynczych transkryptów pomiarów TFI.</li>
	<li>W celu analizy szeregów czasowych kalibracji należy przekonwertować pliki na 16-bitowe pliki w formacie TIFF zgodnie z pkt 4.1.</li>
	<li>Otwórz wyeksportowane pliki za pomocą oprogramowania StaQtool21 (Rysunek 3). Naciśnij przycisk Wybierz plik LOG, wybierz plik dziennika odpowiednich szeregów czasowych 2D uzyskanych zgodnie z opisem w punkcie 4.2.</li>
	<li>Zaznacz pole wyboru Wiele punktów 2D i naciśnij przycisk GO, aby załadować szeregi czasowe do oprogramowania do analizy.</li>
	<li>W oknie przeglądarki Timelapse (Rysunek 3A), w PSF FWHM, pole wejściowe wstawia wartość obliczoną dla systemu mikroskopu i obiektywu zgodnie z opisem21.</li>
	<li>Aby rozpocząć proces analizy, naciśnij przycisk Auto Detect (Automatyczne wykrywanie), aby wykryć wszystkie obiekty z ograniczeniami dyfrakcji dla aktualnie wyświetlanego punktu czasowego. Następnie kliknij Autodopasowanie, aby wykonać dopasowanie gaussowskie w celu określenia wartości TFI dla każdego obiektu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Możesz też najechać kursorem na obiekt z ograniczeniem dyfrakcji i kliknąć, aby go zaznaczyć (pojawi się zielone kółko w białym kwadracie), a następnie naciśnij przycisk Pasowanie Gaussa, aby przejść do procedury ręcznego wyboru i dopasowania Gaussa. 
	UWAGA: Ostatni tryb jest zalecany do wykluczania obiektów, które nie są zliczane, takich jak jasne miejsca transkrypcji z kilkoma powstającymi transkryptami obecnymi w tym samym jądrze.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Zakończ timelapse, aby zakończyć poprzedni krok. 
	UWAGA: Wyniki są automatycznie zapisywane w formacie pliku Microsoft Excel w tym samym folderze, w którym znajduje się plik obrazu.</li>
	<li>Uruchom moduł Rozkłady TFI i W dla wielu spotów, naciskając odpowiedni przycisk (Rysunek 3B).</li>
	<li>Załaduj pliki Excela za pomocą przycisku Dodaj plik i rozpocznij analizę TFI, naciskając przycisk Przejdź. 
	UWAGA: Wynikiem jest średnia wartość TFI wyznaczona na podstawie wielu zmierzonych pojedynczych transkryptów TFI.</li>
	<li>Rozpocznij analizę W, wstawiając FWHM PSF użyty poprzednio w punkcie 5.10 i naciśnij przycisk Go, używając wartości domyślnej dla Bin. 
	UWAGA: Parametr W służy do kontroli jakości pomiarów TFI z pojedynczym transkryptem w celu zapewnienia zgodności z prawidłową wartością FWHM PSF dla zastosowanego systemu mikroskopowego.</li>
</ol>
6. Łączenie danych i kalibracji
<ol>
	<li>Wprowadź do nowego arkusza Excel wartości TFI szeregów czasowych uzyskane z arkusza Excel zapisanego w pkt. 4.8. i podziel każdą wartość punktu czasowego przez średnią TFI dla pojedynczych transkryptów uzyskanych w pkt 5.15. 
	UWAGA: Do standaryzacji tego procesu wykorzystano specjalnie przygotowane szablony formularzy Excel.</li>
</ol>

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+or+repress%3F+The+transcriptional+dilemma+of+damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin.</a> FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).</li>
<li>Michelini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+lncRNAs+control+the+DNA+damage+response+through+interaction+with+DDRNAs+at+individual+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks.</a> Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).</li>
<li>Vítor, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcription+at+damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin.</a> Science Advances. 5 (1), (2019).</li>
<li>Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+response+at+DNA+ends+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNA response at DNA ends in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+small+RNAs+in+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for small RNAs in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 149 (1), 101-112 (2012).</li>
<li>Francia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DICER+and+DROSHA+RNA+products+control+the+DNA-damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response.</a> Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).</li>
<li>Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+An+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24(2020).</li>
<li>Alt, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+secreted+and+membrane-bound+immunoglobulin+mu+heavy+chains+is+directed+by+mRNAs+that+differ+at+their+3%27+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3' ends.</a> Cell. 20 (2), 293-301 (1980).</li>
<li>Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+exon+sequences+in+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The role of exon sequences in splice site selection.</a> Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).</li>
<li>Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+substrate-specific+requirement+of+the+splicing+factor+U2AF%2835%29+and+for+its+function+after+polypyrimidine+tract+recognition+by+U2AF%2865%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65).</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).</li>
<li>Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+visualization+of+pre-mRNA+splicing+with+single-molecule+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity.</a> Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).</li>
<li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li>
<li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li>
<li>Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+coevolution+of+a+viral+RNA-protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).</li>
<li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Soutoglou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+stability+of+single+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096(1994).</li>
<li>Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoukos%2C+V+%22Science%22">Science</a>. 341 (6146), New York, N.Y. 660(2013).</li>
<li>Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STaQTool%3A+Spot+tracking+and+quantification+tool+for+monitoring+splicing+of+single+pre-mRNA+molecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells.</a> Methods. 98, 143-149 (2016).</li>
<li>Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-replication+conflict+orientation+modulates+R-Loop+levels+and+activates+distinct+DNA+damage+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses.</a> Cell. 170 (4), 774-786 (2017).</li>
<li>D'Alessandro, G., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+DNA+Damage%3A+Holding+Hands+or+Crossing+Swords%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).</li>
<li>Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+counteract+membrane+tension+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Konflikty między podstawowymi procesami biologicznymi, takimi jak replikacja, transkrypcja, uszkodzenie DNA i naprawa DNA, zostały zidentyfikowane jako krytyczne źródło niestabilności genomu22. Badania te doprowadziły również do odkrycia transkrypcji w miejscach uszkodzenia DNA i przypisały funkcjonalną rolę transkryptom indukowanym przerwaniem w regulacji procesów naprawy uszkodzeń DNA23. Nowe narzędzia i opisany tutaj protokół pozwalają na dalsze badania dynamiki transkrypcji RNA Pol II w DSB. Krytycznym punktem w tym protokole jest generowanie linii komórkowych, które zawierają pojedynczą kopię genu reporterowego zintegrowanego z genomem. Ta kluczowa cecha eliminuje szum powstający w wyniku transkrypcji kilku genów reporterowych zintegrowanych z wieloma kopiami w obrębie jednego locus genomowego i umożliwia zbieranie parametrów kinetycznych dynamiki transkrypcji i poszczególnych transkryptów RNA. Kluczowym wymogiem technicznym do obserwacji transkrypcji integracji pojedynczych genów reporterowych jest dostępność systemu mikroskopowego, który umożliwia wykrywanie pojedynczych transkryptów RNA znakowanych systemem MS2 lub PP7 w żywych komórkach 4,12. W tym przypadku mikroskopia żywych komórek jest wykonywana na konfokalnym systemie wirującego dysku zamontowanym na mikroskopie odwróconym, wyposażonym w lasery półprzewodnikowe o mocy 100 mW sprzężone z przestrajalnym filtrem akustyczno-optycznym, jak opisano w innym miejscu24. Ponadto, aby badać transkrypcję w pojedynczym DSB za pomocą reporterów, poszczególne komórki muszą być dokładnie monitorowane, aby osiągnąć najwyższą rozdzielczość czasową, co wymaga obrazowania komórek przez kilka godzin, co sprawia, że jest to test o niskiej przepustowości. Mimo to obserwujemy kilka komórek równolegle z pozycjonowaniem kontrolowanym przez stolik mikroskopowy napędzany piezo. Aby zapewnić optymalne warunki środowiskowe do obserwacji żywych komórek przez wiele godzin, korpus mikroskopu, w tym stolik na próbkę, umieszcza się w komorze środowiskowej z pleksiglasu. Dodatkowo na stoliku mikroskopu zamontowana jest komora inkubacyjna z fazą zamkniętą, która jest podłączona do sterowników CO2 i wilgotności.
Pierwszym krytycznym krokiem w protokole jest wybór obszarów zainteresowania z komórkami do obrazowania. Każda pozycja XY oznaczona do obrazowania musi zawierać jedną lub więcej komórek wykazujących transfekcję z białkami wiążącymi pętlę macierzystą fluorescencyjnego RNA zgodnie z genem reporterowym i schematem transfekcji opisanym w sekcji 1, tabela 1, jak również na rysunku 2D, E. Ponadto komórki muszą wykazywać jasne znakowane miejsca transkrypcji, które muszą być współtransfekowane z konstruktem I-SceI-GR-iRFP713, a białko musi być początkowo zlokalizowane w cytoplazmie (ryc. 2D i E).
Komórki powinny wykazywać poziom intensywności fluorescencji niezwiązanego, znakowanego fluorescencyjnie białka płaszcza MS2 i / lub PP7 wystarczająco niski, aby wykryć pojedyncze znakowane transkrypty na poziomie fluorescencji tła. Jednocześnie konieczny jest solidny poziom intensywności fluorescencji znakowanych fluorescencyjnie białek płaszcza MS2 i/lub PP7, aby umożliwić obrazowanie przez co najmniej 60 minut bez utraty zbyt dużej fluorescencji z powodu występującego bielenia. "Wyświetlanie obrazu w skali" ze stałym zakresem, jak opisano w sekcji 3.7, służy do umożliwienia standaryzowanego wyboru komórek zgodnie z ich poziomem intensywności fluorescencji.
Drugim krytycznym krokiem protokołu jest dodanie TA do komórek w określonych wcześniej pozycjach XY przez mały otwór w pokrywie naczynia ze szklanym dnem. Jakakolwiek manipulacja naczyniem ze szklanym dnem spowodowałaby przesunięcie komórek z oznaczonej pozycji XY i należy tego unikać. W związku z tym ostrożne obchodzenie się z mikropipetą podczas dodawania TA rozcieńczonego do pożywki komórkowej ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnej obserwacji wstępnie wybranych komórek, jak pokazano na rysunku 2F. Adaptacja różnych systemów do dodawania leków do komórek zamontowanych na stoliku mikroskopowym, takich jak system perfuzyjny, wymagałaby oddzielnej komory inkubacyjnej z otworami wejściowymi i wyjściowymi rurki oraz pompą lub systemem iniekcji do podawania leków. Inne metody, takie jak szkiełka kanałowe z dnem przypominającym szkiełko nakrywkowe, powodują powolną dyfuzję podawanych leków do kanału i powodują dodatkowe opóźnienie między dodaniem leku a jego efektem. Wreszcie, nieostrożne pipetowanie do otworu szkiełka kanałowego może również spowodować zmianę pozycji próbki. Dlatego obecny system z niestandardowym wywierconym otworem w pokrywie naczynia ze szklanym dnem jest łatwy do dostosowania, tani i odpowiedni do podawania różnych pożywek wzrostowych, leków i komponentów. Mała średnica otworu i nawilżona atmosfera w komorze inkubacyjnej etapu zapobiega również wysychaniu pożywki komórkowej.
Trzecim krytycznym krokiem w tym protokole jest analiza danych, która wymaga ręcznej kontroli punktów czasowych, w których transkrypcja zostaje zatrzymana z powodu indukcji DSB. Punkt czasowy zakończenia transkrypcji jest wskazywany przez uwolnienie ostatnich transkryptów z wcześniej jasno oznaczonego miejsca transkrypcji genu reporterowego. Podobnie, zdarzenia inicjacji transkrypcji wywołanej przerwaniem muszą być dokładnie kontrolowane w celu wykrycia indywidualnych zdarzeń transkrypcji o stosunkowo niskim stosunku sygnału do szumu pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych mRNA.
Dynamika naprawy indukowanego DSB dodaje dodatkową warstwę złożoności do analiz danych generowanych za pomocą tych reporterów, ograniczając je do pierwszych minut bezpośrednio po indukcji DSB. Transgeniczna natura genów reporterowych i bogata w powtórzenia natura macierzy pętli macierzystych MS2 i PP7 mogą tworzyć unikalny krajobraz chromatyny, zakłócając ustanawianie przypuszczalnie stabilnych programów transkrypcji indukowanych przerwaniem. Niemniej jednak, w porównaniu z promieniowaniem jonizującym lub promieniowaniem UV, indukcja DSB w genach reporterowych za pośrednictwem I-SceI jest znacznie bardziej niezawodnym systemem do badania transkrypcji w poszczególnych DSB.
Różne systemy endonukleaz, takie jak I-CreI, I-PpoI lub AsiSI , które mają lub nie mają dodatkowych miejsc rozpoznawania w ludzkim genomie, można połączyć z obecnymi systemami genów reporterowych w celu uzyskania możliwej wyższej wydajności generowania DSB. Wymagają one jednak najpierw wprowadzenia miejsca rozpoznawania endonukleazy do genów reporterowych. Po drugie, mogą mieć podobną zmienność w zakresie indukcji czasu i wydajności DSB w poszczególnych komórkach. Z drugiej strony, wstawienie tandemowych kopii miejsc rozpoznawania endonukleazy może zwiększyć skuteczność indukcji DSB. Co więcej, przetestowanie zaprezentowanych systemów genów reporterowych w różnych liniach komórkowych pozwoliłoby na porównanie dynamiki transkrypcji w miejscach DSB między różnymi tłami komórkowymi oraz dostępność różnych szlaków naprawy uszkodzeń DNA, takich jak w komórkach nowotworowych, komórkach pierwotnych i zróżnicowanych komórkach niecyklicznych. Jednak konstrukcja genów reporterowych tak, aby były kompatybilne z systemem Flp/FRT, obecnie ogranicza integrację z dostępnymi liniami komórek gospodarza Flp/FRT.
Oprócz zastosowań opartych na mikroskopii, obecne geny reporterowe mogą być również łączone z testami biochemicznymi, takimi jak immunoprecypitacja chromatyny, w celu zbadania rekrutacji czynników naprawy DNA lub transkrypcji do pojedynczego DSB lub w celu oceny zajętości nukleosomów, modyfikacji histonów i stanu chromatyny wokół miejsca DSB. Co więcej, połączenie z różnymi systemami reporterowymi pozwoliłoby na badanie funkcjonalnych powiązań między uszkodzeniem DNA a procesami takimi jak organizacja genomu lub replikacja DNA.

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) to toksyczne uszkodzenia DNA, które zakłócają funkcjonowanie komórek i przyczyniają się do powstawania wielu chorób i starzenia się1. Mutacje wynikające z niedokładnej naprawy DSB wpływają na ekspresję genów i stanowią podstawę do funkcjonalnego upadku komórki. Wyłaniający się pogląd, że DSB napędzają de novo transkrypcję wywołaną przerwaniem w miejscu uszkodzenia2,3,4,5,6,7 sugeruje, że DSB mogą również wpływać na funkcje komórkowe poprzez RNA indukowane przerwaniem. Kilka ostatnich badań wskazuje, że DSB są wystarczające do zainicjowania zaprogramowanej (np. w genach indukowanych bodźcem) i nieplanowanej (np. w niekanonicznych promotorach) transkrypcji4,5,7. Jednak pomimo kilku badań badających powiązania między uszkodzeniem DNA a transkrypcją, dziedzina ta nadal pozostawała w tyle pod względem zdolności do zapewnienia precyzyjnej (tj. pojedynczej) charakterystyki zdarzeń transkrypcyjnych w miejscach pęknięcia DNA. Jednym z ważnych powodów takiego stanu rzeczy był brak odpowiednich narzędzi eksperymentalnych. Napromienianie komórek (promieniowanie γ, promieniowanie rentgenowskie, ciężkie jony) i leczenie farmakologiczne (np. inhibitorami topoizomerazy lub środkami interkalacyjnymi) nie jest precyzyjne przestrzennie i indukuje zmiany w DNA inne niż DSB, w tym pęknięcia pojedynczej nici i addukty DNA8. Endonukleazy, takie jak I-PpoI i AsiSI, generują DSB specyficzne dla locus, ale nie zostały połączone z systemem, który umożliwia jednoczesną wizualizację transkrypcji na żywych komórkach w jednym locus z wysoką precyzją czasową8. Aby obejść to ograniczenie, nasze laboratorium opracowało zestaw najnowocześniejszych reporterów, które bezpośrednio wizualizują transkrypcję z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki po kontrolowanej indukcji unikalnego DSB4. Tutaj opisujemy te reportery, przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania transkrypcji w żywych komórkach w DSB i pokazujemy dane ujawniające inicjację transkrypcji w pojedynczym DSB.
Systemy genów reporterowych używane w tym protokole są oparte na dobrze scharakteryzowanym genie reporterowym IgM myszy i zawierają eksony M1 i M2 formy związanej z błoną (μm) łańcucha ciężkiego IgM μ9,10,11. Intron hybrydowy oddziela dwa eksony za pomocą silnego adenowirusa o dużej późnej transkryptacji (AdML) PY tract12. Ekspresja genów reporterowych jest kontrolowana przez ludzki promotor wirusa cytomegalii (CMV), do którego wprowadzono dwie tandemowe kopie sekwencji operatora Tet (TetO). Każdy z genów reporterowych jest wprowadzany do wektora plazmidowego zawierającego miejsce docelowe rekombinacji Flp (FRT) i wstawiany do określonego miejsca docelowego FRT w genomie linii komórek gospodarza HEK293. Ta linia komórkowa konstytutywnie ulega również ekspresji białka represorowego Tet w celu regulacji ekspresji genu reporterowego poprzez obecność lub brak tetracykliny / doksycykliny. Aby umożliwić wizualizację transkrypcji genu reporterowego, 24 powtórzenia tandemowe sekwencji pętli macierzystej MS2 i 24 powtórzenia tandemowe sekwencji pętli macierzystej PP7 zostały wstawione w różnych pozycjach w odniesieniu do miejsca rozpoczęcia transkrypcji i struktury eksonu/intronu genu reporterowego. Pętle macierzyste RNA MS2 / PP7 tworzą się podczas transkrypcji i są specyficznie związane przez ektopowo wyrażane białka płaszcza MS2 / PP7 oznaczone zielonymi i czerwonymi białkami fluorescencyjnymi, strategia szeroko stosowana wcześniej do obrazowania transkrypcji13,14,15. Ponadto wstawiono pojedynczą kopię sekwencji rozpoznawania 18 pz dla endonukleazy naprowadzającej I-SceI, która jest bezpośrednio otoczona przez układy sekwencji pętli macierzystej RNA w genach reporterowych. Do wygenerowania wszystkich plazmidów zastosowano standardowe techniki klonowania, fragment zawierający pętlę macierzystą I-SceI-24xMS2 genu reporterowego PROP został zsyntetyzowany przez komercyjną usługę syntezy genów.
Gen reporterowy promotora promotora proksymalny DSB (PROP) został skonstruowany przez wstawienie miejsca cięcia I-SceI 45 par zasad (bp) poniżej domniemanego miejsca rozpoczęcia transkrypcji w eksonie I, a następnie 149 pz aż do rozpoczęcia kasety pętli macierzystej 24x MS2, która została de novo zaprojektowana z dwoma naprzemiennie nieidentycznymi sekwencjami pętli macierzystej16 oraz dodatkowe pięć niepowtarzalnych sekwencji dystansowych 20 pz w celu zmniejszenia redundancji. Po układzie pętli macierzy MS2 następuje 72 pz do początku intronu 1844 pz i ekson II 1085 pz do miejsca rozszczepienia i poliadenylacji. Ekson II koduje cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP) połączone z C-końcową sekwencją peroksysomalną celującą (PTS) z ludzkiej peroksysomalnej oksydazy acylo-CoA, aby umożliwić niezależne badanie przesiewowe ekspresji genu reporterowego (<silna klasa = "xfig">Figura 1A).
Gen reporterowy DSB eksonu II (EX2) składa się z eksonu I o masie 167 pz, po którym następuje intron i ekson II kodujące CFP-PTS. Dalej w dół rzeki, w odległości 169 pz, włożono kasetę zawierającą 24 pętle trzpienia MS2, a następnie sekwencję łącznika 84 pz z miejscem I-SceI w środku, a następnie pętle łodygi 24x PP7 i 221 pz aż do miejsca rozszczepienia i poliadenylacji17 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
Na koniec, gen reporterowy DSB eksonu II z antysensownym znakowaniem transkrypcyjnym (EX2AS) jest oparty na ludzkim transkryptorze genu ubikwityny B (UBB) UBB-201 i zawiera dwa eksony i jeden intronowy. Ekson I ma całkowitą długość 1534 pz z odwrotnym wstawieniem sekwencji pętli pnia 24x MS2. W związku z tym prawidłowa sekwencja RNA pętli macierzystej MS2 zostanie przepisana w kierunku antysensownym w odniesieniu do transkrypcji zmysłowej genu reporterowego z promotora CMV. Intron ma długość 490 pz, za nim następuje ekson II z miejscem I-SceI, a region kodujący został wstawiony dla dwóch podjednostek ubikwityny w ramce. Poniżej genu UBB znajduje się sekwencja, która tworzy 24-krotną pętlę macierzystą PP7 po transkrypcji genu reporterowego w kierunku zmysłowym (<silna klasa = "xfig" >Figura 1C).
Przejściowa transfekcja indukowalnego konstruktu endonukleazy samonaprowadzającej I-SceI pozwala na kontrolowane tworzenie DSB w miejscu rozpoznania w każdym genie reporterowym18. Endonukleaza I-SceI jest połączona w ramce z domeną wiążącą ligand receptora glukokortykosteroidowego i białkiem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni iRFP713. Ten konstrukt jest cytoplazmatyczny przy braku acetonidu triamcynolonu (TA), ale szybko migruje do jądra po dodaniu TA do pożywki wzrostowej komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). Indukcja DSB przez system I-SceI jest solidna, jak pokazano wcześniej18,19,20. Transkrypcja genu reporterowego może być monitorowana równolegle poprzez wizualizację znakowanych fluorescencyjnie systemów pętli macierzystych RNA MS2 i PP7.

<table><tbody><tr><td>Lasery półprzewodnikowe o mocy 100 mW</td><td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk System</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chłodzona powietrzem kamera EMCCD Evolve 512</td><td>Photometrics, Tucson, AZ USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>surowica bydlęca pozbawiona węgla drzewnego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>CO2 moduł S</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 konfokalny wirujący dysk</td><td>Yokogawa Electric, Tokio, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z Hepes no PhenolRed</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Doxicyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>do indukcji ekspresji genu reporterowego; roztwór podstawowy 0,5 mg/ml zastosowano w rozcieńczeniu 1:1000 w pożywka do wzrostu komórek</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In T-REx 293 linia komórkowa</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>R75007</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencja pętli macierzystej SceI-24x MS2</td><td>GeneArt, Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td>specjalnie zsyntetyzowany fragment DNA zawierający pojedynczą sekwencję rozpoznawania I-SceI i 24 tandemowe sekwencje pętli macierzystej MS2</td></tr><tr><td>Wilgotność urządzenia grzewczego 2000</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny Immersol 518 F</td><td>Carl Zeiss MicroImaging Inc.)</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik pomocniczy Lipofectamin 3000 P3000</td> Odczynnik pomocniczy do transfekcji <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>odczynnik do transfekcji na bazie lipidów</td></tr><tr><td>MatTek 35 mm talerz, szklane dno nr 1,5</td><td>MatTek Korporacja, Ashland, MA, Stany Zjednoczone Mikroskopowa</td> komora inkubacyjna <td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PeCon GmbH, Erbach, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT/TO</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V652020</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pOG44</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0 Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>komora inkubacyjna sceniczna PeCon P-Set 2000</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StaQtool Software</td><td>iMM-JLA Lizbona, Portugalia</td><td></td><td>dostępne pod adresem: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip</td></tr><tr><td>acetonid triamcynolonu (TA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6501</td><td>syntetyczny glikokortykosteroid; indukuje migrację receptora glikokortykoidowego z cytoplazmy do jądra</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA (TE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R001100</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych dna

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są najpoważniejszym rodzajem uszkodzenia DNA. Pomimo katastrofalnych konsekwencji dla integralności genomu, do tej pory nie wiadomo, w jaki sposób DSB wpływają na transkrypcję. Powodem tego był brak odpowiednich narzędzi do jednoczesnego monitorowania transkrypcji i indukcji genowego DSB z wystarczającą rozdzielczością czasową i przestrzenną. W tej pracy opisano zestaw nowych reporterów, które bezpośrednio wizualizują transkrypcję w żywych komórkach natychmiast po indukcji DSB w matrycy DNA. Pętle macierzyste RNA bakteriofagów są wykorzystywane do monitorowania transkrypcji z czułością pojedynczej cząsteczki. W celu skierowania DSB do określonego regionu genu, geny reporterowe są modyfikowane tak, aby zawierały pojedynczą sekwencję rozpoznawczą endonukleazy naprowadzającej I-SceI, która w przeciwnym razie byłaby nieobecna w ludzkim genomie. Pojedyncza kopia każdego genu reporterowego została zintegrowana z genomem ludzkich linii komórkowych. Ten eksperymentalny system pozwala na wykrycie pojedynczych cząsteczek RNA generowanych przez kanoniczną transkrypcję genu lub inicjację transkrypcji wywołaną przerwaniem DNA. Reporterzy ci dają bezprecedensową możliwość interpretacji wzajemnych oddziaływań między transkrypcją a uszkodzeniem DNA oraz ujawnienia dotychczas niedocenianych aspektów transkrypcji wywołanej przerwaniem DNA.

Linie komórkowe zawierające geny reporterowe przedstawione na Rysunku 1A-C umożliwiają badanie dynamiki transkrypcji w obrębie pojedynczego DSB w żywych komórkach. Liczby na Rysunku 1A-C znajdujące się pod graficznym przedstawieniem każdego genu reporterowego wskazują długość w kilobazach (kbp). CMV oznacza promotor cytomegalowirusa, TetO to sekwencje operatora Tet, a pA oznacza miejsce cięcia 3' i poliadenylacji na końcu genu. CFP-PTS to kodowane cyjanowe białko fluorescencyjne połączone z sygnałem kierującym do peroksysomów, a 2UBB to kodowana tandemowa jednostka ludzkiej ubikwityny B. Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem i procedurami analizy, możliwe jest uzyskanie wykresów przedstawiających liczbę fluorescencyjnie znakowanych transkryptów genu reporterowego w czasie, z rozdzielczością czasową rzędu sekund w okresach do kilku godzin (Rysunek 4A-D). Wykres na Rysunku 4A przedstawia przebieg czasowy wartości TFI w miejscu transkrypcji genu reporterowego PROM, znakowanego poprzez akumulację cząsteczek MS2-GFP na powstających transkryptach. Ten konkretny wykres reprezentuje eksperyment kontrolny bez dodania TA; w związku z czym nie indukowano DSB. Transkrypcja trwa z pikami o charakterze seryjnym (burst-like) i 2-8 transkryptami jednocześnie przez cały 60 min okres obserwacji. Podobne wyniki uzyskano dla genów reporterowych EX2 oraz EX2-AS (dane nie przedstawione tutaj)4. Indukcja pojedynczych DSB w genach reporterowych (przy użyciu I-SceI-GR-iRFP) pozwala na badanie wpływu DSB na trwającą transkrypcję genu reporterowego oraz monitorowanie zdarzeń transkrypcyjnych powstających w miejscu DSB, a mianowicie transkrypcji indukowanej pęknięciem (Rysunek 4B-D).
Dynamika transkrypcji indukowanej pęknięciem DNA zależy od lokalizacji DSB w obrębie genu 
Indukcja pojedynczego DSB przez I-SceI-GR-iRFP w genie reporterowym z sekwencją rozpoznawczą I-SceI położoną blisko promotora prowadzi do wyciszenia transkrypcji genu reporterowego około 11 min po dodaniu TA, a transkrypcja nie zostaje przywrócona w ciągu 60 min okresu obserwacji (Rycina 4B). Podczas obserwacji transkrypcji genu reporterowego EX2, całkowite stłumienie transkrypcji napędzanej przez kanoniczny promotor wykryto poprzez jednoczesną całkowitą utratę sygnałów zarówno MS2-GFP, jak i PP7-RFP około 30 min po dodaniu TA. Jednak w ciągu 10 min transkrypcja zostaje wznowiona, co objawiło się ponownym pojawieniem się pików fluorescencji PP7-RFP. Pełny powrót sygnału PP7-RFP (przy braku fluorescencji MS2-GFP) wskazuje na inicjację transkrypcji indukowanej pęknięciem (Rycina 4C). Transkrypcja indukowana pęknięciem nie jest stabilna w długich okresach; pojawia się w formie krótkich impulsów o niskiej intensywności piku, co wskazuje, że w miejscu DSB zainicjowano tylko kilka transkryptów indukowanych pęknięciem.
Gen reporterowy EX2AS, który zawiera macierz 24x pętli stem-loop PP7 w eksonie II w kierunku downstream od miejsca I-SceI w celu wykrycia transkrypcji sensownej, wykazuje kanoniczną transkrypcję sterowaną przez promotor, która kończy się w obrębie genu reporterowego EX2AS w ciągu około 25 min po dodaniu TA. Jest ona następnie zastępowana transkrypcją antysensowną indukowaną pęknięciem, co ujawnia akumulacja białka MS2-GFP wiążącego się z RNA generowanym z antysensownych sekwencji pętli stem-loop MS2 (Rysunek 4D). Aktywność transkrypcyjna antysensowna była nieobecna przed przerwaniem transkrypcji sensownej spowodowanym indukcją DSB i pokazuje w tym przykładzie, że kilka transkryptów zostało zainicjowanych w miejscu pęknięcia w ciągu około 15 min. Przedstawione tutaj reprezentatywne dane wykazują, że DSB mają różny wpływ na transkrypcję w zależności od ich lokalizacji w obrębie genu, co zgłoszono niedawno4. Dane ujawniają również zmienność międzykomórkową w czasie indukcji DSB przez I-SceI-GR-iRFP, która wynosi od 12 do 30 min po dodaniu TA. Co więcej, detekcja poszczególnych transkryptów pozwala na odkrycie różnic międzykomórkowych oraz różnic w miejscu pęknięcia w odniesieniu do intensywności indukowanej pęknięciem aktywności transkrypcyjnej. Transkrypcja indukowana pęknięciem jest wykrywana wyłącznie w przypadku DSB w obrębie genu. Jest ona nieobecna w przypadku DSB blisko promotora, gdzie kanoniczna transkrypcja ustaje po wystąpieniu DSB na pozostały okres obserwacji.
<img alt="Schematy edycji genów; A-C modele ekson-intron; D eksperymentalne wyniki TA w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Geny reporterowe i system indukcji pęknięć dwuniciowych DNA. Schematyczne przedstawienie w punktach (A) do (C) pokazuje strukturę trzech genów reporterowych użytych do badania transkrypcji po indukcji pęknięcia dwuniciowego DNA. W punkcie (A) przedstawiono gen reporterowy z położoną blisko promotora sekwencją rozpoznawaną przez I-SceI w pierwszym eksonie (PROM), flankowaną w kierunku 3' przez macierz 24x pętli MS2 (MS2-SL). W punkcie (B) pokazano gen reporterowy z sekwencją I-SceI w drugim eksonie (EX2), flankowany w kierunku 5' sekwencją 24x pętli MS2 oraz w kierunku 3' macierzą 24x pętli PP7 (PP7-SL). W punkcie (C) przedstawiono gen reporterowy z sekwencją I-SceI zlokalizowaną w eksonie II z antyrównoległą insercją sekwencji 24x pętli MS2 powyżej miejsca I-SceI w celu wykrycia transkrypcji antysensownej (EX2-AS). Funkcja konstruktu białka fuzyjnego I-SceI-GR-iRFP jest przedstawiona w punkcie (D) za pomocą wykresu graficznego oraz odpowiadających mu obrazów żywych komórek poniżej. Po przejściowej ekspresji konstruktu (kolor czerwony) w liniach komórkowych z genem reporterowym, białko znajduje się wyłącznie w cytoplazmie, co zapobiega przedwczesnemu cięciu miejsca docelowego przez endonukleazę I-SceI. Po dodaniu TA białko fuzyjne zaczyna migrować do jądra komórkowego (oznaczonego linią przerywaną) i zaczyna się w nim akumulować między 5 a 15 min. Pasek skali = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ obrazowania w szalce Petriego, interfejs oprogramowania, mikroskopia fluorescencyjna białek MS2-GFP i I-SceI-GR-iRFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wybór komórek do obrazowania 3D time-lapse miejsc transkrypcji. Zdjęcie w (A) przedstawia szalkę o dnie szklanym 35 mm używaną do obrazowania żywych komórek, z niestandardowo zmodyfikowaną pokrywką, w której wywiercono otwór o średnicy 3 mm, aby móc dodawać rozcieńczony TA w pożywce wzrostowej bezpośrednio do szalki. Lokalizacja otworu zaznaczona jest czerwonym okręgiem. Panel w (B) przedstawia zrzut ekranu okna „Focus” oprogramowania sterującego mikroskopem, służącego do ustawienia czasu ekspozycji podglądu na żywo, ustawień filtrów, natężenia lasera oraz skali wyświetlania obrazu w celu przesiewania komórek do późniejszego obrazowania time-lapse w (C), gdzie znajduje się zrzut ekranu odpowiadającego mu okna „Capture” do dostosowania wszystkich ustawień akwizycji 3D time-lapse dla żywych komórek. Szczegółowe ustawienia paneli Filter, Capture Type, Time-Lapse Capture i 3D Capture opisano w sekcji 3. W widoku pokazanym tutaj ustawienia zostały dostosowane do akwizycji 3D time-lapse linii genów reporterowych PROM transfekowanej konstruktami MS2-GFP i I-SceI-GR-iRFP w celu obrazowania transkrypcji po indukcji pęknięcia obu nici DNA w regionie proksymalnym względem promotora genu reporterowego. Obraz w (D) jest nałożeniem kanałów GFP i iRFP i przedstawia pole widzenia widziane przez system mikroskopowy z kilkoma komórkami linii komórek reporterowych 293-PROM. Komórki zostały kotransfekowane konstruktem tandemowego dimeru białka otoczki MS2 połączonego z sekwencją lokalizacji jądrowej, dwoma zielonymi białkami fluorescencyjnymi (GFP-MS2CP) oraz konstruktem I-SceI-GR-iRFP. W kilku komórkach widoczna jest ekspresja konstruktu GFP-MS2CP, co podkreśla jądra, natomiast konstrukt I-SceI-GR-iRFP podkreśla cytoplazmę. Przerywany kwadrat wskazuje powiększony obszar pokazany w (E). Do obrazowania 3D time-lapse komórki są wybierane zgodnie z wymaganiami opisanymi w Dyskusji, na przykład komórka z większym jądrem w powiększonym obszarze w (D). Komórka ta jest transfekowana obydwoma konstruktami fluorescencyjnymi i wykazuje silnie znakowane miejsce transkrypcji (grot strzałki) poprzez akumulację GFP-MS2CP na nowo transkrybowanych pre-mRNA genu reporterowego (obraz po lewej). Pożywka wzrostowa komórek nie zawiera TA; w związku z tym konstrukt I-SceI-GR-iRFP znajduje się wyłącznie w cytoplazmie (obraz po prawej). W (F) szalka z dnem szklanym jest zamontowana w komorze inkubacyjnej stolika mikroskopu do eksperymentów obrazowania 3D time-lapse i wyposażona w niestandardową pokrywkę z otworem do wprowadzania TA. Końcówka mikropipety 200 µL jest ostrożnie wkładana do otworu, aby aplikować rozcieńczony TA do pożywki wzrostowej komórek. Pasek skali = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy dopasowania Gaussa, wykresy rozkładu danych, śledzenie plamek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów. Panel w (A) przedstawia zrzut ekranu programu STaQTool: narzędzia do śledzenia i kwantyfikacji plamek. Obraz pokazuje przykładową serię czasową linii komórkowej z genem reporterowym PROM, w której znakowane miejsce transkrypcji jest zaznaczone zielonym kołem/białym kwadratem w wyświetlaniu maksymalnej projekcji intensywności w centrum. Okna po prawej stronie wyświetlają powiększony widok wybranej plamki miejsca transkrypcji, odpowiadający 3D zacieniowany wykres powierzchni intensywności z siatką dopasowania Gaussa 2D dla bieżącego punktu czasowego, a także wykresy pozycji Z plamki miejsca transkrypcji w stosie z (z-stack), szerokości dopasowania Gaussa (W) oraz pomiaru TFI w czasie. Obraz mikroskopowy w (B) przedstawia powiększoną pojedynczą płaszczyznę optyczną jądra komórkowego linii z genem reporterowym PROM przetransfekowanej MS2-GFP. Obraz reprezentuje jeden punkt czasowy z 2D serii czasowej kalibracyjnej składającej się ze 120 punktów czasowych. Jądro wykazuje kilka fluorescencyjnie znakowanych transkryptów pojawiających się jako obiekty ograniczone dyfrakcją w nukleoplazmie (zaznaczone białymi kwadratami). Panel po prawej stronie pokazuje zrzut ekranu narzędzia TFI and W Distributions w programie STaQTool do analizy wielu plamek w 2D akwizycjach time-lapse. W tej przykładowej analizie narzędzie wykryło 408 plamek ograniczonych dyfrakcją, reprezentujących transkrypty genu reporterowego znakowane MS2-GFP, które dyfundują w nukleoplazmie. Wykresy po prawej stronie wyświetlają histogramy rozkładu TFI i szerokości dopasowania Gaussa obiektów oraz krzywe dopasowania Gaussa. Średnie wartości TFI i W, wyprowadzone z pozycji centralnego piku krzywej dopasowania Gaussa, oraz obliczone przedziały ufności są wyświetlane w odpowiednim panelu. Pasek skali = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy ekspresji genów; MS2-GFP, PP7-RFP; liczba transkryptów w funkcji czasu; efekty dodania TA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki detekcji transkrypcji w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA. Wykresy od (A) do (D) przedstawiają skalibrowaną krzywą TFI jednego miejsca transkrypcji w czasie. Wartości TFI przeliczono na transkrypty, korzystając ze średniego TFI pojedynczych transkryptów zmierzonych w eksperymentach kalibracyjnych dla odpowiedniej konstrukcji genu reporterowego oraz białka wiążącego pętlę RNA z etykietą fluorescencyjną MS2 lub PP7 użytego w danym eksperymencie. Na wykresie (A) przedstawiono wyniki eksperymentu kontrolnego z użyciem genu reporterowego PROM bez dodania TA. Transkrypty znakowane MS2-GFP wskazują na ciągłą aktywność transkrypcyjną przez cały okres obserwacji. Wykres (B) przedstawia gen reporterowy PROM po dodaniu TA i indukcji pęknięcia dwuniciowego (DSB), co prowadzi do zahamowania transkrypcji przez pozostały czas obserwacji. Wykres genu reporterowego EX2 w punkcie (C) wykazuje supresję kanonicznej transkrypcji sterowanej promotorem po dodaniu TA. Później, w tym samym odstępie czasu, pojawia się jedynie aktywność transkrypcyjna znakowana PP7-RFP. Na wykresie (D) transkrypcja genu reporterowego EX2-AS z promotora kanonicznego w kierunku sensownym jest analogicznie hamowana po dodaniu TA, podobnie jak w przypadku genu reporterowego EX2 w punkcie (C). Jednakże pojawienie się transkryptów znakowanych MS2-RFP, pochodzących z odwróconej sekwencji pętli MS2, wskazuje na transkrypcję antysensowną, która nie występowała podczas aktywności transkrypcji sensownej przed dodaniem TA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Linia komórkowa reporterowa</td>
			<td>EX2 i EX2-AS</td>
			<td>PROM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Plazmidy do transfekcji</td>
			<td>1.5 µg pI-SceI-GR-iRFP</td>
			<td>1.5 µg pI-SceI-GR-iRFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 µg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry</td>
			<td>0.5 µg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.35 µg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Transfekcja linii komórkowych z genem reporterowym. Tabela przedstawia schematy transfekcji oraz ilości poszczególnych plazmidów wykorzystanych do przejściowej transfekcji różnych linii komórkowych z genem reporterowym.

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Protokół ten pozwala na obserwację i wykrywanie zdarzeń transkrypcyjnych oraz daje wgląd w wpływ pęknięć podwójnej nici DNA na trwającą transkrypcję genu. Główną zaletą tej techniki jest obserwacja indywidualnie znakowanych transkryptów RNA w pojedynczych komórkach w odstępach sekundowych przez łączny okres jednej godziny lub dłużej. Metoda ta zapewnia wgląd w reakcję na uszkodzenie DNA w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między transkrypcją a procesami komórkowymi, takimi jak replikacja DNA i uszkodzenia DNA.Naszą radą jest obserwacja komórek za pomocą doksycykliny i wykonywanie pomiarów kalibracyjnych w celu wytrenowania wykrywania miejsca transkrypcji i znakowanych cząsteczek RNA. W 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki przygotować roztwór A zawierający 150 mikrolitrów zredukowanego DNA osocza MEM w surowicy i 2,5 mikrograma na mikrolitr DNA w odczynniku pomocniczym do transfekcji. Równolegle przygotować roztwór B zawierający 150 mikrolitrów zredukowanego MEM w surowicy i 1,5 mikrograma na mikrolitr DNA w odczynniku do transfekcji na bazie lipidów.Inkubować oba roztwory w temperaturze pokojowej przez pięć minut, następnie delikatnie dodać roztwór A do roztworu B i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby przetransfekować komórki, dodaj kroplami 300 mikrolitrów zmieszanego roztworu A i B do każdego naczynia i delikatnie rozprowadz. Przechowuj naczynie ze szklanym dnem w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 milimetrów i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla.Przygotować 1,5-mililitrową mikroprobówkę wirówkową z 200 mikrolitrami DMEM z HEPES bez czerwieni fenolowej i uzupełnioną 10% surowicą bydlęcą pozbawioną węgla drzewnego, a następnie dodać TA. Na około godzinę przed rozpoczęciem obserwacji mikroskopowej wywołaj transkrypcję genów reporterowych, dodając doksycyklinę do pożywki wzrostowej i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów. Przenieś komórki do mikroskopu co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji i umieść 100-milimetrową szalkę z komórkami w nagrzanej dużej komorze inkubacyjnej mikroskopu. Umieść probówkę wirówki mikrowirówkowej ze wstępnie rozcieńczonym TA w dużej komorze środowiskowej mikroskopu, aby ogrzać ją do 37 stopni Celsjusza.Zastąp pokrywkę naczynia ze szklanym dnem pokrywką z wywierconym otworem o średnicy trzech milimetrów. Wybierz obiektyw zanurzeniowy 100X w olejku na panelu sterowania mikroskopu i nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Ustaw naczynie ze szklanym dnem z komórkami wewnątrz komory inkubacyjnej stopnia mikroskopu i zablokuj je na miejscu, a następnie zamknij pokrywę inkubatora stage i wszystkie drzwi obudowy mikroskopu.Uruchom oprogramowanie do obsługi i sterowania mikroskopem, otwórz okno sterowania ostrością i kliknij okienko zakresu. W okienku wyboru emisji kliknij pole 100%eye, aby ustawić ścieżkę wiązki gałki ocznej dla bezpośredniej obserwacji próbki przez oko. W menu zestawu filtrów przełącz się na zestaw filtrów oczu i kliknij opcję Jasne pole, a następnie naciśnij przycisk otwierania Jasne pole.Przesuń obiektyw mikroskopu w kierunku szklanego dna naczynia, aż olej dotknie szkła. Spójrz przez lornetki i ręcznie ustaw ostrość na płaszczyźnie komórek, a następnie wyłącz otwarty przycisk Brightfield. Pozostaw komórki na 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji eksperymentalnych, aby umożliwić im dostosowanie się do warunków środowiskowych i zapobiec dryfowaniu ogniskowej podczas obrazowania z powodu gradientów temperatury.Ustaw mikropipetę o pojemności 200 mikrolitrów i końcówki filtrujące o pojemności 200 mikrolitrów w temperaturze pokojowej. W oknie sterowania ostrością w oprogramowaniu sterującym mikroskopem ustaw intensywność lasera na 5% i wprowadź wartość 50 milisekund jako czas naświetlania. Otwórz okno przechwytywania, aby dostosować ustawienia w celu automatycznego pozyskiwania obrazów trójwymiarowych timelapsów.Wybierz typ akwizycji przechwytywania 3D i ustaw od 12 do 16 warstw optycznych oddzielonych od siebie o 0,4 mikrometra. Zaznacz pola wyboru zasięgu wokół prądu i wróć do bieżącej pozycji po przechwyceniu. W okienku przechwytywania poklatkowego wprowadź wartość 120 dla liczby punktów czasowych i 30 sekund dla interwału.Wybierz zestaw filtrów konfokalnych zgodnie z etykietami transektowanych białek fluorescencyjnych, jak podano w manuskrypcie tekstowym i ustaw czas ekspozycji dla każdego kanału na 50 milisekund. Użyj prądu ustawionego dla mocy lasera, aby użyć wartości 5% wybranej w oknie ostrości. W oknie sterowania ostrością przejdź do okienka aparatu, wybierz kontrolkę skalowania wyświetlania obrazu i wybierz przycisk ręczny, aby ustawić stały zakres intensywności obrazu, który ma być wyświetlany.Wybierz komórki do obrazowania poklatkowego 3D miejsc transkrypcji po indukcji pęknięcia podwójnej nici DNA. Prześwietl komórki i wybierz trzy pola widzenia zgodnie z warunkami opisanymi w dyskusji nad tekstem. Skoncentruj się na każdej wybranej komórce, która wcześniej znajdowała się w środku pola widzenia, z miejscem transkrypcji w środkowej płaszczyźnie stosu Z.Zaznacz każdą pozycję XYZ w płaszczyźnie XY okna sterowania ostrością, klikając przycisk Ustaw punkt. Dodaj 200 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonego TA do komórek i rozpocznij obrazowanie szeregów czasowych 3D, klikając start w oknie przechwytywania. Zapisz dane obrazowania w formacie danych oprogramowania sterującego mikroskopem na dysku twardym komputera sterującego mikroskopem.Dodaj 0,5 mikrograma na mililitr doksycykliny do pożywki wzrostowej komórek na godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu mikroskopowego. Zamontuj szklaną dolną miskę w komorze inkubacyjnej stolika mikroskopowego i przygotuj akwizycję obrazu, jak pokazano wcześniej. Użyj tych samych ustawień intensywności lasera i ekspozycji, co poprzednio.Ustaw ustawienia przechwytywania dla szeregów czasowych 2D i ustaw 120 punktów czasowych w odstępach 500 milisekund w panelu przechwytywania poklatkowego. Pozyskaj dziesiątki szeregów czasowych kalibracji z wielu pozycji, aby wygenerować zestawy danych w celu zliczenia kilkuset pojedynczych pomiarów TFI z pojedynczym transkryptem. Korzystając z tego protokołu, uzyskuje się wykres przedstawiający liczbę znakowanych fluorescencyjnie transkryptów genów reporterowych w czasie z rozdzielczością czasową wynoszącą sekundy w okresach do godzin.Przedstawiono tutaj przebieg w czasie wartości TFI miejsca transkrypcji genu reporterowego PROM znakowanego przez akumulację białka płaszcza MS2 znakowanego zielonymi cząsteczkami białka fluorescencyjnego na powstających transkryptach. Indukcja pojedynczego DSB w genach reporterowych umożliwia zbadanie jego wpływu na trwającą transkrypcję genu reporterowego oraz monitorowanie zdarzeń transkrypcyjnych pojawiających się w miejscu DSB, a mianowicie transkrypcji indukowanej przerwaniem. Dodanie TA i indukcja DSB prowadzi do zahamowania transkrypcji genu reporterowego PROM po około 11 minutach, która nie jest przywracana do 60 minut.Całkowite odzyskanie sygnału PP7-RFP wykazuje inicjację transkrypcji wywołaną przerwaniem. Antysensowny gen reporterowy EXON 2 wykazuje zakończenie transkrypcji sterowane przez promotor, które jest następnie zastępowane transkrypcją indukowaną przerwaniem antysensownym, co ujawnia się przez akumulację białka płaszcza MS2 znakowanego czerwonym białkiem fluorescencyjnym wiążącym się z RNA generowanym z antysensownych sekwencji pętli macierzystej MS2. Wybór komórek do obrazowania, skonfiguruj leczone obrazowanie poklatkowe, dostosowując pozycję Z znakowanego miejsca transkrypcji na każdej pozycji XY do środka stosu Z, który ma zostać uzyskany.I wreszcie, dodawanie TA rozcieńczonego w pożywce wzrostowej musi być wykonane z najwyższą ostrożnością, aby zapobiec jakimkolwiek przesunięciom wstępnie wybranych pozycji z komórkami, które mają być obrazowane. Obrazowanie pojedynczych transkryptów RNA w 3D w czasie w żywych komórkach można zastosować do badania transkrypcji RNA podczas replikacji DNA lub zmian transkrypcji podczas progresji cyklu komórkowego.

live-cell-imaging-transcriptional-activity-at-dna-double-strand

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Poznaj metodę obrazowania aktywności transkrypcyjnej w żywych komórkach przy pęknięciach dwuniciowych DNA. Technika fluorescencyjna umożliwia obserwację pojedynczych cząsteczek RNA z rozdzielczością czasową do sekund.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Przeglądaj więcej filmów