Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na jedno z kluczowych pytań w dziedzinie reprodukcji, a mianowicie, w jaki sposób i kiedy procesy regulowane genetycznie wpływają na wielkość rezerwy jajnikowej, o której wiemy, że wpływa na długowieczność reprodukcyjną kobiet. Generuje dane, które można uzyskać, zapewniając skuteczną kwantyfikację komórek rozrodczych. Ta metoda zastosowana do genetycznie zróżnicowanych zwierząt tego samego gatunku może dostarczyć informacji na temat czynników genetycznych bezpośrednio wpływających na rozwój komórek rozrodczych i jajników oraz innych narządów rozwojowych.

Procedurę zademonstruje Nathaniel Boechat, stażysta naukowy z mojego laboratorium Na początek krok obfitości umieść i zabezpiecz znieczuloną samicę myszy w okresie dojrzewania na grzbiecie, delikatnie przypinając wszystkie nogi przez opuszki łap w zrelaksowanej pozycji na desce. Aby otworzyć klatkę piersiową myszy, ostrożnie przeciąć żebra po obu stronach mostka tuż pod łopatką, unikając przebicia płuc, chwyć kleszczem skórę lub płaty żeber i przygwoźdź płaty, aby odsłonić narządy wewnętrzne, użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć prawy przedsionek serca i uwolnić krew z układu. Następnie, przytrzymując serce kleszczami, włóż igłę perfuzyjną do lewej komory i pompuj 10 mililitrów PBS z delikatnym i stałym ciśnieniem.

Gdy tkanki, takie jak wątroba, nerki i drogi rozrodcze, zmienią kolor z różowego na biały, zastąp PBS świeżo przygotowanym 1% paraformaldehydem lub PFA i kontynuuj perfuzję około 10 mililitrami PFA. Następnie zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową z jajnikami poniżej nerki i delikatnie rozetnij cały układ rozrodczy, w tym poduszeczkę tłuszczową, jajniki i rogi macicy, aby umieścić ją w fiolce z 4% PFA. Utrwal jajniki w temperaturze pokojowej przez 16 do 24 godzin przed zastąpieniem 4% PFA 70% etanolem.

W dniu barwienia należy przyciąć jajniki przed przystąpieniem do barwienia immunologicznego. W pierwszym dniu protokołu barwienia immunologicznego należy pobrać pipetę z jednego mililitra PBS na studzienkę do żądanej liczby dołków na czystej płytce 24-dołkowej. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby zrobić szeroki otwór i użyj szerokiej końcówki, aby delikatnie przenieść jajniki dojrzewania z fiolek z 70% etanolem do studzienek, a następnie zastąp PBS w studzience świeżym 0,8 mililitra PBS Następnego dnia odessać PBS ze studzienek, aby zastąpić go 0,8 mililitra buforu przenikającego na studzienkę.

Po inkubacji płytek na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez cztery godziny zastąp bufor przenikający buforem blokującym. W trzecim dniu przygotować przeciwciała pierwszorzędowe przez rozcieńczenie w buforze blokującym. Aby uwidocznić oocyty, należy inkubować jajniki prenatalne i przedpokwitaniowe z markerami oocytów. W ósmym dniu przemywać próbki świeżym buforem płuczącym przez dwie godziny, a następnie zastąpić bufor płuczący 0,5 mililitra wtórnych mieszanin przeciwciał rozcieńczonych w buforze blokującym.

Uszczelnić płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu, i inkubować próbki w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy dni. W dniu 11 po przemyciu barwieniem immunologicznym odessać bufor płuczący i inkubować próbki z 0,8 mililitra sześciennego roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni w ciemności. Zmiana wagi sześciennej o jedno rozwiązanie dziennie.

W dniu 15 umyć próbki trzy razy przez 10 minut i 0,8 mililitra PBS w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając. Następnie zastąp PBS 0,8 mililitra świeżo przygotowanej, odgazowanej 20% sacharozy PBS, a następnie delikatnie wstrząśnij w temperaturze pokojowej. Po godzinie zastąp 20% roztwór sacharozy, aby potraktować próbki 0,8 mililitra roztworu dwupoziomowego przez cztery do pięciu dni, jak wyjaśniono wcześniej.

Aby przygotować zestaw próbek, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów z odciętą końcówką, aby przenieść jajniki dojrzewania z 15 do 20 mikrolitrami roztworu dwuskładnikowego do środka studzienki kleju. Gdy jajniki zostaną przeniesione do indywidualnej studzienki za pomocą kropli roztworu klarującego, delikatnie umieść szkło nakrywkowe na studzience kleju i dociśnij, aby utworzyć uszczelnienie, umieszczając próbki i roztwór czyszczący między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Do obrazowania miejsce, szkiełko nakrywkowe w wydrukowanym w 3D szkiełku adaptera mikroskopu.

Ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z rdzeniami mikroskopowymi lub specyfikacjami producenta. Jeśli to możliwe, użyj dwukierunkowej akwizycji obrazu, aby skrócić czas skanowania i poprawić wydajność. Dostosuj średnią linii, średnią klatek i akumulację klatek w oprogramowaniu.

Ustaw stos Z, identyfikując pozycję początkową i końcową, a następnie wybierz rozmiar kroku Z wynoszący dwa mikrometry dla jajników przed pokwitaniem i pięć mikrometrów dla jajników w okresie dojrzewania. Następnie aktywuj funkcję kompensacji Z i wzmocnienie wzbudzenia. Ustaw kompensację Z dla dolnej i górnej części próbki, wybierając intensywność lasera dla obu.

Trybu kafelkowania należy używać w przypadku większych próbek, których nie można uchwycić w jednym polu widzenia. Aktywuj nawigatora obrazów i wskaż liczbę kafelków potrzebnych do przechwycenia całej próbki za pomocą prostokątnego narzędzia do znakowania. Po zakończeniu ustawiania rozpocznij akwizycję obrazu dla obrazów z wieloma kafelkami, rozpocznij akwizycję obrazu za pomocą nawigatora, aby przechwycić wszystkie kafelki.

Po pobraniu obrazu zapisz wszystkie obrazy. A jeśli uzyskano wiele kafelków, uruchom narzędzie do scalania mozaiki, aby scalić kafelki w jeden obraz. Aby określić rozmiar oocytów, otwórz obraz i wybierz opcję plasterka, aby otworzyć obraz stosu Zs.

Wybierz opcję linii i panel miary, a następnie zmierz odległość, rysując linię od jednej krawędzi oocytów lub markera do drugiej krawędzi w najszerszym punkcie, aby określić średnicę XY oocytu. Przejdź przez stos i uzyskaj zakres średnic dla wielu oocytów tego samego typu. Użyj najkrótszej długości jako kryterium wyboru wielkości dla liczby oocytów.

Następnie, w opcji Widok 3D, wybierz funkcję spotów. W panelu sceny aktywuj funkcję dodawania nowych miejsc, aby otworzyć panel algorytmu. Następnie odznacz wszystkie ustawienia algorytmu jako filtr wyboru rozmiaru z uzyskaną wcześniej wielkością oocytów.

Kliknij strzałkę kanału do przodu, aby przejść do kanału źródłowego. Następnie wybierz kanał z preferowanym znacznikiem i wpisz uzyskaną średnicę w szacowanej średnicy X, Y. Po wybraniu rozmiaru aktywuj model wydłużenia PSF i odjęcia tła, które są automatycznie określane.

Następnie wybierz pojedynczą strzałkę do przodu, aby przejść do panelu miejsc filtrowania i dodaj filtr jakości, aby określić próg. Aby zapewnić dokładne oszacowanie liczby oocytów, powiększ obraz. Później kliknij podwójną strzałkę, aby zakończyć automatyczne liczenie.

Użyj zakładki edycji, aby ręcznie wybrać pominięte oocyty lub odznaczyć cząstki nieoocytów wybrane przez automatyczny próg. Po zakończeniu zapisz dane w zakładce statystyki pod zakładką ogólne w celu dalszej analizy. Aby oszacować całkowitą liczbę oocytów i uszkodzonych jajników, otwórz obrazy nienaruszonych jajników za pomocą MRS i wybierz funkcję ramki.

W ustawieniach ramki zaznacz pola siatki, znaczniki osi i etykiety dostępu. Na karcie pozycji XYZ wybierz 200 mikromów, aby wygenerować znaczniki z 200 mikrometrami spacji we wszystkich pozycjach XYZ. Używając znaczników o długości 200 mikrometrów, wybierz oocyty, które mieszczą się w 50% objętości każdego jajnika.

Kliknij funkcję plam i wybierz etykiety edycji, aby sklasyfikować oocyty, które mieszczą się w regionie 50% według koloru. Na reprezentatywnych, wielofotonowych obrazach w skali szarości jajników nieperfundowanych i perfundowanych można było zobaczyć małe oocyty w pęcherzykach pierwotnych z cienką warstwą cytoplazmatycznego barwienia DDX4. Dodatkowo zauważono większe oocyty w obrębie rosnących pęcherzyków.

Zbadano renderingi 3D z wielofotonowych obrazów jajników prenatalnych i poporodowych. W 28. dobie poporodowej jajnik z kontrolnej samicy nienapromieniowanej zawierał dużą populację małych komórek jajowych w pęcherzykach pierwotnych. Natomiast jajniki od napromienianej samicy z promieniowaniem gamma o 0,5 greja były całkowicie pozbawione małych komórek jajowych w pęcherzykach pierwotnych.

Ale większe oocyty były nadal obecne. W celu ilościowego określenia oocytów obrazy wielofotonowe 3D zostały przetworzone w oprogramowaniu MRS przy użyciu filtra gouciańskiego, a oocyty o małych i dużych rozmiarach zostały zidentyfikowane i określone ilościowo za pomocą funkcji spot. Następnie obliczono średni odsetek oocytów na każdym etapie w porównaniu ze średnią liczbą obecnych w najwcześniejszym stadium: liczba oocytów E 15,5 gwałtownie spadła między E 15,5 a E 18,5, a oocyty płodowe E 15,5 i E 18,5 wykazywały ekspresję w linii pierwszej lub E 18,5, jak widać na obrazach wielofotonowych.

Analiza intensywności wykazała wyższą ekspresję pierwszej linii lub jednego P na oocyty przy E 18,5 niż E 15,5. Do analizy można wykorzystać jajniki z niewielkimi uszkodzeniami. Całkowita liczba oocytów jest określana za pomocą korekcji obliczeniowej.

Model reprezentatywny pokazuje oocyty G CNA dodatnie w jajniku E 15,5 z pięcioma 10% regionami zaznaczonymi w nienaruszonym jajniku. Podobnie wygenerowano symulowany jajnik z 10% przyrostowymi regionami brakującymi do 50% jajnika. Całkowitą liczbę oocytów i symulowane jajniki porównano z oryginalnymi nienaruszonymi jajnikami.

Różnica została przedstawiona jako odchylenie procentowe: dobra perfuzja skutkuje dobrą jakością obrazu. Dlatego upewnij się, że wszystkie tkanki zostały oczyszczone za pomocą PBS przed przejściem na PFA. Upewnij się, że jajniki są całkowicie odsłonięte, przycinając dodatkową tkankę.

Protokół pozwala na efektywną analizę dużej liczby próbek, a dane ilościowe uzyskane z genetycznych populacji referencyjnych, takie jak wspólne krzyżowanie lub różnorodność, pomogą zidentyfikować genetyczne modyfikatory rozwoju oocytów i liczby oocytów.