Name: Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji całego jajnika i mikroskopii wielofotonowej do ilościowej analizy 3D rezerwy jajnikowej u myszy. Protokół umożliwia badania toksykologiczne i diagnostykę kliniczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (R01 HD093778 dla E.B-F i T32 HD007065 dla R.B). Dziękujemy Zachary'emu Boucherowi za pomoc w eksperymencie z promieniowaniem. Dziękujemy Mary Ann Handel za krytyczną lekturę rękopisu. Wyrażamy wdzięczność za wkład Sonii Erattupuzha i Microscopy Core Service w The Jackson Laboratory za fachową pomoc w pracach mikroskopowych opisanych w tej publikacji oraz Jarka Trapszo z Scientific Instrument Services w The Jackson Laboratory za zaprojektowanie wydrukowanego w 3D suwaka adaptacyjnego.

<ol><li>Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+ovarian+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of the ovarian reserve.</a> Frontiers in Genetics. 6, 308(2015).</li>
<li>Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+primordial+germ+cell+to+primordial+follicle%3A+mammalian+female+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development.</a> Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).</li>
<li>Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+reproductive+decline+is+determined+by+remaining+ovarian+reserve+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age.</a> PLoS One. 9 (10), 108343(2014).</li>
<li>Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+developmental+origins+of+ovarian+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Environmental and developmental origins of ovarian reserve.</a> Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).</li>
<li>Spears, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+damage+from+chemotherapy+and+current+approaches+to+its+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection.</a> Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).</li>
<li>Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+chemotherapeutic+agents+damage+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">How do chemotherapeutic agents damage the ovary.</a> Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).</li>
<li>Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+primary+ovarian+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
<li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+interrupted%3A+the+genetics+of+female+infertility+via+meiotic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure.</a> Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).</li>
<li>Tam, P. P., Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+migration+of+primordial+germ+cells+during+compensatory+growth+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).</li>
<li>Pepling, M. E., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+mouse+germ+cells+form+synchronously+dividing+cysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts.</a> Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).</li>
<li>Pepling, M. E., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ovarian+germ+cell+cysts+undergo+programmed+breakdown+to+form+primordial+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles.</a> Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).</li>
<li>Adams, I. R., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+dimorphic+development+of+mouse+primordial+germ+cells%3A+switching+from+oogenesis+to+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis.</a> Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).</li>
<li>McLaren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+mouse+embryonic+germ+cells+into+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis.</a> Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).</li>
<li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+number+of+primordial+follicles+in+the+ovarian+reserve+established%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111(2015).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commuting+the+death+sentence%3A+how+oocytes+strive+to+survive%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).</li>
<li>Baker, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+and+cytological+study+of+germ+cells+in+human+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).</li>
<li>Baker, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+and+cytological+study+of+oogenesis+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey.</a> Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).</li>
<li>Kurilo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+antenatal+development+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in antenatal development in man.</a> Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).</li>
<li>Matova, N., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+animal+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of animal oogenesis.</a> Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).</li>
<li>Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+retrotransposon+LINE-1+in+fetal+oocyte+attrition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice.</a> Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).</li>
<li>Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+ovarian+reserve+in+mice+by+evading+LINE-1+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity.</a> Nature Communications. 11 (1), 330(2020).</li>
<li>Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+checkpoint+eliminates+mouse+oocytes+with+chromosome+synapsis+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure.</a> Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).</li>
<li>Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+female+infertility+by+Chk2+ablation+reveals+the+oocyte+DNA+damage+checkpoint+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway.</a> Science. 343 (6170), 533-536 (2014).</li>
<li>Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+assembly%3A+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicular assembly: mechanisms of action.</a> Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).</li>
<li>Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial+pool+of+follicles+and+nest+breakdown+in+mammalian+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries.</a> Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).</li>
<li>Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+reserve+from+conception+to+the+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human ovarian reserve from conception to the menopause.</a> PLoS One. 5 (1), 8772(2010).</li>
<li>Pepling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+oocyte+development+and+estradiol+sensitivity+among+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains.</a> Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).</li>
<li>Nelson, S. M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+premature+ovarian+insufficiency%3A+foolish+fallacy+or+feasible+foresight%5BTitle%5D)+AND+%22Climacteric%22%5BJournal%5D)">Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight.</a> Climacteric. , 1-10 (2021).</li>
<li>Wood, M. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+markers+of+ovarian+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic markers of ovarian reserve.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1%2C+2%2C+3%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).</li>
<li>Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+follicle+enumeration+in+adult+mouse+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782(2020).</li>
<li>Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+and+reconstruction+of+the+whole+ovary+and+testis%3A+a+new+frontier+for+the+reproductive+scientist%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist.</a> Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007(2021).</li>
<li>Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+quantifying+primordial+follicles+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121(2020).</li>
<li>Skodras, A., Marcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-generated+ovaries+to+assist+follicle+counting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments.</a> PLoS One. 10 (3), 0120242(2015).</li>
<li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499(2018).</li>
<li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72(2018).</li>
<li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+the+DNA+damage+checkpoint+prevents+radiation-induced+oocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death.</a> Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 113(2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765">https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765</a> (2018).</li>
<li>Niu, W., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+pathways+of+pregranulosa+cell+differentiation+support+follicle+formation+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).</li>
<li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li>
<li>Carroll, J., Marangos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+genetics%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response in mammalian oocytes.</a> Frontiers in genetics. 4, 117(2013).</li>
<li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li>
<li>McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mouse+ovary+morphogenesis+with+developmental+dynamics+of+the+oviduct%2C+ovarian+ligaments%2C+and+rete+ovarii%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Di Giovanna, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+sample+mounting+for+light-sheet+fluorescence+Microscopy+of+clarified+specimens+by+polydimethylsiloxane+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół barwienia immunologicznego i obrazowania 3D dla jajników prenatalnych i postnatalnych do wysokoprzepustowych i porównawczych badań ilościowych komórek rozrodczych i lokalizacji białek. Opracowaliśmy ten protokół do analizy liczby oocytów w jajnikach (N = 6-12) w sześciu punktach czasowych rozwoju w 10-16 różnych szczepach, w których zwykle przetwarzane są jednocześnie 2-4 24-dołkowe płytki. Metodę tę można dostosować do innych narządów lub markerów komórkowych. Na przykład pr...

Większość samic ssaków rodzi się ze skończoną liczbą meiotycznie zatrzymanych oocytów przechowywanych w pierwotnych pęcherzykach, tworzących rezerwę jajnikową (OR)1,2. OR określa ogólną długość życia reprodukcyjnego i zdrowie samic3. Sala operacyjna zwykle zmniejsza swój rozmiar wraz z wiekiem i może zostać przedwcześnie uszczuplona pod wpływem niektórych czynników genotoksycznych (radioterapia/chemioterapia) i stresu środowiskowego (niedożywienie), co prowadzi do niepłodności4,5,6. Idiopatyczna niepłodność żeńska może być często przypisywana genetycznej i fizjologicznej jakości komórek jajowych rozwijających się z sali operacyjnej i pozostaje słabo poznana7,8. Ponieważ wyposażenie żeńskich pęcherzyków jest w dużej mierze z góry zdeterminowane przez urodzenie, konieczne jest zrozumienie mechanizmów regulacyjnych związanych z powstawaniem i utrzymywaniem sali operacyjnej.
U myszy tworzenie OR rozpoczyna się wraz z określeniem pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) około dnia embrionalnego (E) 7.52. PGC migrują do grzbietów narządów płciowych, gdzie będą przebywać w przybliżeniu E10.59. Poniższa ekstensywna proliferacja występuje z niepełną cytokinezą, co skutkuje powstawaniem torbieli, które zostaną rozłożone w późniejszym etapie rozwoju10,11. Przy około E12,5 określa się płeć goad, a proliferacja PGC zatrzymuje się w jajnikach. U samic PGC, obecnie oocyty, wchodzą w profazę mejotyczną I (MPI) w przybliżeniu E13.512,13. Oocyty przechodzą przez rozszerzony MPI i zatrzymują się na etapie dyktowania w czasie porodu. W pierwszym tygodniu po urodzeniu każdy zatrzymany oocyt jest otoczony komórkami ziarnistymi, tworząc w ten sposób pierwotny pęcherzyk.
Liczba pierwotnych pęcherzyków na sali operacyjnej kobiety zależy od tego, ile oocytów przeżyło fale eliminacji oocytów, które występują przed i podczas zatrzymania MPI przez apoptozę, autofagię lub martwicę14,15. Pierwsza fala występuje podczas rozwoju płodu i jest znana jako FOA. FOA to ewolucyjnie konserwatywny proces u samic (ssaków i innych ssaków), w którym szacuje się, że 50-80% oocytów jest eliminowanych w zależności od gatunku żeńskiego16,17,18,19. U myszy FOA występuje w okresie od E15.5 do E18.5 i przypisuje się go reaktywacji i ekspresji sekwencji retrotranspozonu LINE-1 powodujących śmierć oocytów20,21. Druga fala eliminacji oocytów odbywa się poprzez mejotyczny punkt kontrolny, który eliminuje oocyty z defektami mejotycznymi, takimi jak nienaprawione pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB)22,23. Kolejna fala eliminacji oocytów następuje podczas rozpadu torbieli, a jej kulminacją jest tworzenie pierwotnych pęcherzyków, z których każdy zawiera pojedynczy oocyt10,11,24,25.
U myszy, pierwotna rezerwa pęcherzyków jest w dużej mierze tworzona przez okres dojrzewania, po czym zmniejsza się, ponieważ pierwotne pęcherzyki są aktywowane do wzrostu podczas regularnych cykli rozrodczych. Rozmiar sali operacyjnej różni się u poszczególnych kobiet i między różnymi szczepami genetycznymi myszy; jednak genetyczna regulacja rozmiaru OR nie jest dobrze poznana26,27,28,29. Badania genetyczne nad regulacją OR są utrudnione przez brak ustandaryzowanych protokołów do badania fal eliminacji oocytów podczas rozwoju prenatalnego i postnatalnego. U myszy opracowano kilka metodologii kwantyfikacji oocytów, z których najczęstszą i najczęściej stosowaną jest histomorfometryczna ocena przekrojów histologicznych30,31. W tej technice oocyty są identyfikowane na seryjnych odcinkach z barwnikami histologicznymi, takimi jak hematoksylina i eozyna (H&E) oraz kwas okresowy Schiffa (PAS) lub markery fluorescencyjne. Technika ta jest niezawodna, jeśli wszystkie warunki pozostają stałe, w tym grubość przekroju, skuteczne odzyskiwanie wszystkich skrawków w jajniku oraz schematy liczenia poszczególnych laboratoriów. Jednak liczby podawane przez różne laboratoria często znacznie się różnią, a zatem nie są łatwe do porównania.
Ponadto, biorąc pod uwagę różnice genetyczne, użycie różnych szczepów myszy może również wpływać na liczbę oocytów. Dodatkowe podejścia obliczeniowe zostały opracowane do oceny histomorfometrycznej i obejmują automatyczne wykrywanie oocytów przy użyciu metody frakcjonowania, automatyczne liczenie przy użyciu algorytmów obliczeniowych oraz rekonstrukcję 3D obrazów histologicznych w celu zapobieżenia wielokrotnemu liczeniu tego samego oocytu31,32,33,34,35,36. Nawet po tych ulepszeniach dodanych do oceny histomorfometrycznej, technika ta jest stosunkowo pracochłonna, szczególnie w przypadku badań na dużą skalę i o wysokiej przepustowości. Zebrane dane mogą nie być odtwarzalne i porównywalne między badaniami ze względu na różnice w schematach liczenia, algorytmach komputerowych i używanym oprogramowaniu.
Ostatnio, przyspieszone przez rozwój nowych metod mikroskopii wielofotonowej i świetlnej o średniej rozdzielczości oraz optycznego oczyszczania tkanek, techniki modelowania i analizy 3D dla nienaruszonych jajników stają się metodą z wyboru do efektywnego określania liczby oocytów oraz badania lokalizacji i dynamiki białek37,38. Te metody 3D są zazwyczaj korzystne w porównaniu z metodami histologicznymi, ponieważ tkanki i narządy są lepiej zachowane i zachowane w stanie nienaruszonym. Co więcej, analiza i modelowanie 3D zapewniają dodatkowy wgląd w funkcje i interakcje w obrębie i między niszami komórkowymi lub podstrukturami w narządzie, które mogą zostać pominięte w analizie 2D.
Analiza 3D całych narządów wymaga optymalizacji protokołów fiksacji, barwienia immunologicznego i optycznego oczyszczania dla poszczególnych narządów, takich jak jajniki, bez zniekształceń i uszkodzeń tkanek. Dodatkowa optymalizacja mocowania próbki do obrazowania jest wymagana w przypadku mikroskopii o wysokiej rozdzielczości i może zależeć od dostępnej platformy obrazowania. Wreszcie, obrazowanie całego nienaruszonego jajnika generuje dużą ilość danych do późniejszych analiz obliczeniowych. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania ustandaryzowanych metod 3D liczenia oocytów do badań porównawczych i na różnych etapach rozwoju.
Ten protokół wykorzystuje standardowe metody barwienia immunologicznego i wcześniej zgłoszone protokoły oczyszczania, koncentrując się na prostym, przyjaznym dla użytkownika i wysokowydajnym podejściu38,39,40,41. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem analizy dużej liczby jajników prenatalnych i pourodzeniowych do 28 dnia po urodzeniu (P28) oraz różnych rozmiarów jajników z różnych środowisk genetycznych myszy. Etapy barwienia immunologicznego są podobne dla wszystkich etapów; jednak protokoły oczyszczania różnią się dla jajników w okresie dojrzewania ze względu na ich większy rozmiar, ScaleS4(0) i CUBIC odpowiednio dla małych i dużych jajników40,41. Ponadto perfuzja całego ciała jest wykonywana u myszy P28 przed utrwaleniem, aby zapobiec autofluorescencji z komórek krwi. Mikroskop wielofotonowy został zbudowany na platformie Leica DIVE/4Tune jako alternatywa dla mikroskopii arkuszowej światła do pozyskiwania obrazów, a do tego protokołu wybrano oprogramowanie IMARIS 3D Visualization and Analysis z różnymi narzędziami analitycznymi. Ten protokół jest prosty do naśladowania i mniej praktyczny, co pozwala zaoszczędzić czas. Co więcej, kwantyfikacja oocytów jest stosunkowo szybka, w zależności od wielkości jajnika i ułożenia oocytów.

<table><tbody><tr><td>Inkubator laboratoryjny</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2200-H</td><td>37 &deg; C inkubator</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>mysi wsobny szczep</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1435</td><td>Materiał niebezpieczny</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6021</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>FastWells Bariery odczynnikowe</td><td>GraceBio</td><td>664113</td><td>Lepka i elastyczna uszczelka silikonowa (dobrze adhezyjna)</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21246</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-szczurze IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Software Oxford</td><td>Instruments Wersja 9.7.0</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów</td></tr><tr><td>Insight X3</td><td>Spectra-Physics</td><td>InSight&nbsp; X3 Przestrajalny ultraszybki laser laserowy</td><td>do obrazowania wielofotonowego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LASX</td><td>Leica</td><td>Wersja 3.5.6</td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazów</td></tr><tr><td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td><td>Leica</td><td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td><td>Mikroskop wielofotonowy</td></tr><tr><td>MaiTai HP</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee One Box Ultraszybki laser laserowy</td><td>do obrazowania wielofotonowego</td></tr><tr><td>Sterownik pompy Masterflex</td><td>Model przemysłowy SPW</td><td>: 7553-50</td><td>Pompa perystaltyczna do perfuzji</td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo FST</td><td></td><td>14010-17</td><td>5 "&ndash; 7" /nożyczki do dekapitacji</td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover Glass, Kwadratowe, Nr 1,5 25x25mm</td><td>VWR</td><td>48366-249</td><td></td></tr><tr><td>Mini BioMixer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>B3D1020</td><td>wytrząsarka/nutator do 37 & stopni; Inkubator C</td></tr><tr><td>Nikon Ergonomiczny SMZ1270</td><td>Leica</td><td>&nbsp; SMZ1270</td><td>mikroskop stereoskopowy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% (wodny roztwór formaldehydu)</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauki 15710</td><td>Materiał niebezpieczny</td></tr><tr><td>PBS Tabletki, sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td>Rozpuszczanie w wodzie Milli-Q</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, 200x, Podwójny roztwór antybiotyku</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ICN1670249</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis(2-hydroksypropyloetylenodiamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-DDX4/MVH</td><td>Abcam</td><td>ab27591</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Królik anty-LINE-1 ORF1p</td><td>Abcam</td><td>ab216324</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Szczur anty-TRA98 / GCNA</td><td>Abcam</td><td>ab82527</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Materiał niebezpieczny</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Materiał niebezpieczny</td></tr><tr><td>Sacharoza Wytrząsarka</td> orbitalna <td>ThermoFisher Scientific</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Tekmar Bimedis</td><td>VXR-S10</td><td>do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UNOLOK Zestaw infuzyjny</td><td>MYCO Medical</td><td>7001-23</td><td>igły do perfuzji</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Amresco</td><td>97061-920</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120LED</td><td>Excelitas</td><td>S/N XT640-W-0147</td><td>świetlówka LED małej mocy</td></tr></tbody></table>

immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3d rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Płodność kobiet i długość życia reprodukcyjnego zależą od jakości i ilości rezerwy oocytów jajnika. Szacuje się, że 80% żeńskich komórek rozrodczych wchodzących do mejotycznej profazy I jest eliminowanych podczas utraty komórek jajowych płodu (FOA) i w pierwszym tygodniu życia pourodzeniowego. Trzy główne mechanizmy regulują liczbę oocytów, które przeżywają podczas rozwoju i tworzą rezerwę jajnikową u samic wchodzących w okres dojrzewania. W pierwszej fali utraty oocytów 30-50% oocytów jest eliminowanych podczas wczesnego FOA, zjawiska, które przypisuje się wysokiej ekspresji długiego przeplatanego pierwiastka jądrowego-1 (LINE-1). Druga fala utraty oocytów polega na eliminacji oocytów z defektami mejozy za pomocą mejotycznego punktu kontroli jakości. Trzecia fala utraty komórek jajowych występuje okołoporodowo podczas tworzenia pęcherzyków pierwotnych, gdy niektóre oocyty nie są w stanie utworzyć pęcherzyków. Nie jest jasne, co reguluje każdą z tych trzech fal utraty oocytów i jak kształtują one rezerwę jajnikową u myszy lub ludzi.
Immunofluorescencja i wizualizacja 3D otworzyły nową drogę do obrazowania i analizowania rozwoju oocytów w kontekście całego jajnika, a nie w mniej pouczających sekcjach 2D. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół barwienia immunologicznego całego jajnika i oczyszczania optycznego, dający przygotowania do obrazowania przy użyciu mikroskopii wielofotonowej i modelowania 3D przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania. Pokazano, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do pokazania dynamiki zaniku oocytów podczas rozwoju jajników u myszy C57BL/6J i ilościowego określenia utraty oocytów podczas trzech fal eliminacji oocytów. Protokół ten można zastosować do jajników prenatalnych i wczesnopoporodowych w celu wizualizacji i kwantyfikacji oocytów, a także innych podejść ilościowych. Co ważne, protokół został strategicznie opracowany, aby umożliwić wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które może zaspokoić potrzeby w zakresie toksykologii, diagnostyki klinicznej i testów genomowych funkcji jajników.

Immunobarwienie i obrazowanie całego jajnika umożliwiają wizualizację i kwantyfikację oocytów lub ekspresji białek w jajnikach na różnych etapach rozwoju przy użyciu tej samej techniki i markerów (Rycina 3). Protokół ten został opracowany na potrzeby projektu na dużą skalę, w którym wymagana była analiza jajników na wielu etapach rozwoju oraz z wielu szczepów myszy. Przedstawiamy tutaj dane zebrane dla szczepu C57BL6/J, który jest standardowym szczepem do analiz genetycznych. Zaprezentowana ...

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na jedno z kluczowych pytań w dziedzinie reprodukcji, a mianowicie, w jaki sposób i kiedy procesy regulowane genetycznie wpływają na wielkość rezerwy jajnikowej, o której wiemy, że wpływa na długowieczność reprodukcyjną kobiet. Generuje dane, które można uzyskać, zapewniając skuteczną kwantyfikację komórek rozrodczych. Ta metoda zastosowana do genetycznie zróżnicowanych zwierząt tego samego gatunku może dostarczyć informacji na temat czynników genetycznych bezpośrednio wpływających na rozwój komórek rozrodczych i jajników oraz innych narządów rozwojowych.Procedurę zademonstruje Nathaniel Boechat, stażysta naukowy z mojego laboratorium Na początek krok obfitości umieść i zabezpiecz znieczuloną samicę myszy w okresie dojrzewania na grzbiecie, delikatnie przypinając wszystkie nogi przez opuszki łap w zrelaksowanej pozycji na desce. Aby otworzyć klatkę piersiową myszy, ostrożnie przeciąć żebra po obu stronach mostka tuż pod łopatką, unikając przebicia płuc, chwyć kleszczem skórę lub płaty żeber i przygwoźdź płaty, aby odsłonić narządy wewnętrzne, użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć prawy przedsionek serca i uwolnić krew z układu. Następnie, przytrzymując serce kleszczami, włóż igłę perfuzyjną do lewej komory i pompuj 10 mililitrów PBS z delikatnym i stałym ciśnieniem.Gdy tkanki, takie jak wątroba, nerki i drogi rozrodcze, zmienią kolor z różowego na biały, zastąp PBS świeżo przygotowanym 1% paraformaldehydem lub PFA i kontynuuj perfuzję około 10 mililitrami PFA. Następnie zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową z jajnikami poniżej nerki i delikatnie rozetnij cały układ rozrodczy, w tym poduszeczkę tłuszczową, jajniki i rogi macicy, aby umieścić ją w fiolce z 4% PFA. Utrwal jajniki w temperaturze pokojowej przez 16 do 24 godzin przed zastąpieniem 4% PFA 70% etanolem.W dniu barwienia należy przyciąć jajniki przed przystąpieniem do barwienia immunologicznego. W pierwszym dniu protokołu barwienia immunologicznego należy pobrać pipetę z jednego mililitra PBS na studzienkę do żądanej liczby dołków na czystej płytce 24-dołkowej. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby zrobić szeroki otwór i użyj szerokiej końcówki, aby delikatnie przenieść jajniki dojrzewania z fiolek z 70% etanolem do studzienek, a następnie zastąp PBS w studzience świeżym 0,8 mililitra PBS Następnego dnia odessać PBS ze studzienek, aby zastąpić go 0,8 mililitra buforu przenikającego na studzienkę.Po inkubacji płytek na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez cztery godziny zastąp bufor przenikający buforem blokującym. W trzecim dniu przygotować przeciwciała pierwszorzędowe przez rozcieńczenie w buforze blokującym. Aby uwidocznić oocyty, należy inkubować jajniki prenatalne i przedpokwitaniowe z markerami oocytów. W ósmym dniu przemywać próbki świeżym buforem płuczącym przez dwie godziny, a następnie zastąpić bufor płuczący 0,5 mililitra wtórnych mieszanin przeciwciał rozcieńczonych w buforze blokującym.Uszczelnić płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu, i inkubować próbki w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy dni. W dniu 11 po przemyciu barwieniem immunologicznym odessać bufor płuczący i inkubować próbki z 0,8 mililitra sześciennego roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni w ciemności. Zmiana wagi sześciennej o jedno rozwiązanie dziennie.W dniu 15 umyć próbki trzy razy przez 10 minut i 0,8 mililitra PBS w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając. Następnie zastąp PBS 0,8 mililitra świeżo przygotowanej, odgazowanej 20% sacharozy PBS, a następnie delikatnie wstrząśnij w temperaturze pokojowej. Po godzinie zastąp 20% roztwór sacharozy, aby potraktować próbki 0,8 mililitra roztworu dwupoziomowego przez cztery do pięciu dni, jak wyjaśniono wcześniej.Aby przygotować zestaw próbek, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów z odciętą końcówką, aby przenieść jajniki dojrzewania z 15 do 20 mikrolitrami roztworu dwuskładnikowego do środka studzienki kleju. Gdy jajniki zostaną przeniesione do indywidualnej studzienki za pomocą kropli roztworu klarującego, delikatnie umieść szkło nakrywkowe na studzience kleju i dociśnij, aby utworzyć uszczelnienie, umieszczając próbki i roztwór czyszczący między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Do obrazowania miejsce, szkiełko nakrywkowe w wydrukowanym w 3D szkiełku adaptera mikroskopu.Ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z rdzeniami mikroskopowymi lub specyfikacjami producenta. Jeśli to możliwe, użyj dwukierunkowej akwizycji obrazu, aby skrócić czas skanowania i poprawić wydajność. Dostosuj średnią linii, średnią klatek i akumulację klatek w oprogramowaniu.Ustaw stos Z, identyfikując pozycję początkową i końcową, a następnie wybierz rozmiar kroku Z wynoszący dwa mikrometry dla jajników przed pokwitaniem i pięć mikrometrów dla jajników w okresie dojrzewania. Następnie aktywuj funkcję kompensacji Z i wzmocnienie wzbudzenia. Ustaw kompensację Z dla dolnej i górnej części próbki, wybierając intensywność lasera dla obu.Trybu kafelkowania należy używać w przypadku większych próbek, których nie można uchwycić w jednym polu widzenia. Aktywuj nawigatora obrazów i wskaż liczbę kafelków potrzebnych do przechwycenia całej próbki za pomocą prostokątnego narzędzia do znakowania. Po zakończeniu ustawiania rozpocznij akwizycję obrazu dla obrazów z wieloma kafelkami, rozpocznij akwizycję obrazu za pomocą nawigatora, aby przechwycić wszystkie kafelki.Po pobraniu obrazu zapisz wszystkie obrazy. A jeśli uzyskano wiele kafelków, uruchom narzędzie do scalania mozaiki, aby scalić kafelki w jeden obraz. Aby określić rozmiar oocytów, otwórz obraz i wybierz opcję plasterka, aby otworzyć obraz stosu Zs.Wybierz opcję linii i panel miary, a następnie zmierz odległość, rysując linię od jednej krawędzi oocytów lub markera do drugiej krawędzi w najszerszym punkcie, aby określić średnicę XY oocytu. Przejdź przez stos i uzyskaj zakres średnic dla wielu oocytów tego samego typu. Użyj najkrótszej długości jako kryterium wyboru wielkości dla liczby oocytów.Następnie, w opcji Widok 3D, wybierz funkcję spotów. W panelu sceny aktywuj funkcję dodawania nowych miejsc, aby otworzyć panel algorytmu. Następnie odznacz wszystkie ustawienia algorytmu jako filtr wyboru rozmiaru z uzyskaną wcześniej wielkością oocytów.Kliknij strzałkę kanału do przodu, aby przejść do kanału źródłowego. Następnie wybierz kanał z preferowanym znacznikiem i wpisz uzyskaną średnicę w szacowanej średnicy X, Y. Po wybraniu rozmiaru aktywuj model wydłużenia PSF i odjęcia tła, które są automatycznie określane.Następnie wybierz pojedynczą strzałkę do przodu, aby przejść do panelu miejsc filtrowania i dodaj filtr jakości, aby określić próg. Aby zapewnić dokładne oszacowanie liczby oocytów, powiększ obraz. Później kliknij podwójną strzałkę, aby zakończyć automatyczne liczenie.Użyj zakładki edycji, aby ręcznie wybrać pominięte oocyty lub odznaczyć cząstki nieoocytów wybrane przez automatyczny próg. Po zakończeniu zapisz dane w zakładce statystyki pod zakładką ogólne w celu dalszej analizy. Aby oszacować całkowitą liczbę oocytów i uszkodzonych jajników, otwórz obrazy nienaruszonych jajników za pomocą MRS i wybierz funkcję ramki.W ustawieniach ramki zaznacz pola siatki, znaczniki osi i etykiety dostępu. Na karcie pozycji XYZ wybierz 200 mikromów, aby wygenerować znaczniki z 200 mikrometrami spacji we wszystkich pozycjach XYZ. Używając znaczników o długości 200 mikrometrów, wybierz oocyty, które mieszczą się w 50% objętości każdego jajnika.Kliknij funkcję plam i wybierz etykiety edycji, aby sklasyfikować oocyty, które mieszczą się w regionie 50% według koloru. Na reprezentatywnych, wielofotonowych obrazach w skali szarości jajników nieperfundowanych i perfundowanych można było zobaczyć małe oocyty w pęcherzykach pierwotnych z cienką warstwą cytoplazmatycznego barwienia DDX4. Dodatkowo zauważono większe oocyty w obrębie rosnących pęcherzyków.Zbadano renderingi 3D z wielofotonowych obrazów jajników prenatalnych i poporodowych. W 28. dobie poporodowej jajnik z kontrolnej samicy nienapromieniowanej zawierał dużą populację małych komórek jajowych w pęcherzykach pierwotnych. Natomiast jajniki od napromienianej samicy z promieniowaniem gamma o 0,5 greja były całkowicie pozbawione małych komórek jajowych w pęcherzykach pierwotnych.Ale większe oocyty były nadal obecne. W celu ilościowego określenia oocytów obrazy wielofotonowe 3D zostały przetworzone w oprogramowaniu MRS przy użyciu filtra gouciańskiego, a oocyty o małych i dużych rozmiarach zostały zidentyfikowane i określone ilościowo za pomocą funkcji spot. Następnie obliczono średni odsetek oocytów na każdym etapie w porównaniu ze średnią liczbą obecnych w najwcześniejszym stadium: liczba oocytów E 15,5 gwałtownie spadła między E 15,5 a E 18,5, a oocyty płodowe E 15,5 i E 18,5 wykazywały ekspresję w linii pierwszej lub E 18,5, jak widać na obrazach wielofotonowych.Analiza intensywności wykazała wyższą ekspresję pierwszej linii lub jednego P na oocyty przy E 18,5 niż E 15,5. Do analizy można wykorzystać jajniki z niewielkimi uszkodzeniami. Całkowita liczba oocytów jest określana za pomocą korekcji obliczeniowej.Model reprezentatywny pokazuje oocyty G CNA dodatnie w jajniku E 15,5 z pięcioma 10% regionami zaznaczonymi w nienaruszonym jajniku. Podobnie wygenerowano symulowany jajnik z 10% przyrostowymi regionami brakującymi do 50% jajnika. Całkowitą liczbę oocytów i symulowane jajniki porównano z oryginalnymi nienaruszonymi jajnikami.Różnica została przedstawiona jako odchylenie procentowe: dobra perfuzja skutkuje dobrą jakością obrazu. Dlatego upewnij się, że wszystkie tkanki zostały oczyszczone za pomocą PBS przed przejściem na PFA. Upewnij się, że jajniki są całkowicie odsłonięte, przycinając dodatkową tkankę.Protokół pozwala na efektywną analizę dużej liczby próbek, a dane ilościowe uzyskane z genetycznych populacji referencyjnych, takie jak wspólne krzyżowanie lub różnorodność, pomogą zidentyfikować genetyczne modyfikatory rozwoju oocytów i liczby oocytów.

whole-ovary-immunofluorescence-clearing-multiphoton-microscopy-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Poznaj metodę immunofluorescencji całego jajnika i mikroskopii wielofotonowej do ilościowej analizy 3D rezerwy jajnikowej u myszy. Protokół umożliwia badania toksykologiczne i diagnostykę kliniczną.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Przeglądaj więcej filmów