Name: Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę DNA Curtains do obrazowania pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 na DNA. Technika ta pozwala badać dynamikę separacji fazowej czynników transkrypcyjnych i jej znaczenie w rozwoju mięsaka Ewinga.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

<ol><li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li>
<li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li>
<li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li>
<li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+super-enhancer%3A+Positive+regulators+in+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Models+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors%3A+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li>
<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li>
<li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li>
<li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li>
<li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li>
<li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
<li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li>
<li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+C+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Ponieważ podejścia jednocząsteczkowe są niezwykle wrażliwe na zawartość układu reakcyjnego, należy dołożyć dodatkowych starań, aby zapewnić dobrą jakość wszystkich materiałów i roztworów podczas eksperymentów z kurtynami DNA, zwłaszcza lipidów przygotowanych w sekcjach 1 i 2 oraz użytych w sekcji 5. Do przygotowania należy użyć odczynników o wyższej czystości, a muszą być świeżo przygotowane do oznaczania pojedynczych cząsteczek
Kiedy EWS-FLI1 znakowany mCherry o wartości 500 nM został przepłu...

Regulacja transkrypcji jest kluczowym krokiem dla precyzyjnej ekspresji genów w żywych komórkach. W tym skomplikowanym procesie uczestniczy wiele czynników, takich jak modyfikacja chromosomów, czynniki transkrypcyjne (TF) i niekodujące RNA1,2,3. Wśród tych czynników, TF przyczyniają się do specyficzności regulacji transkrypcji poprzez rozpoznawanie i wiązanie się z określonymi sekwencjami DNA znanymi jako promotory lub wzmacniacze, a następnie rekrutację innych funkcjonalnych białek do aktywacji lub tłumienia transkrypcji4,5,6,7. Sposób, w jaki te TF udaje się szukać swoich docelowych miejsc w ludzkim genomie i wchodzić w interakcje z DNA pokrytym histonami i białkami niewiążącymi histonów DNA, od dziesięcioleci wprawia naukowców w zakłopotanie. W ciągu ostatnich kilku lat zbudowano kilka klasycznych modeli docelowego mechanizmu wyszukiwania TF, aby opisać, w jaki sposób "ślizgają się", "przeskakują", "skaczą" lub "przeskakują między segmentami" wzdłuż łańcucha DNA8,9,10,11. Modele te koncentrują się na zachowaniach poszukiwawczych w DNA pojedynczej cząsteczki TF. Jednak ostatnie badania pokazują, że niektóre TF przechodzą separację faz ciecz-ciecz (LLPS) samodzielnie w jądrze lub z kompleksem Mediator12. Obserwowane kropelki TF są związane z regionami promotora lub wzmacniacza, co podkreśla rolę tworzenia kondensatu biomolekularnego w transkrypcji i trójwymiarowym genomie13,14,15. Te biomolekularne kondensaty są połączone z przedziałami pozbawionymi błony in vivo i in vitro. Są one tworzone przez LLPS, w których modułowe biomakrocząsteczki i wewnętrznie nieuporządkowane regiony (IDR) białek są dwiema głównymi siłami napędowymi oddziaływań wielowartościowych16. W ten sposób TF nie tylko przeszukują DNA, ale także działają synergistycznie w tych kondensatach4,17,18. Do tej pory biofizyczna właściwość tych kondensatów transkrypcyjnych na DNA pozostaje niejasna.
Dlatego to badanie miało na celu zastosowanie metody jednocząsteczkowej - Zasłony DNA - do bezpośredniego zobrazowania powstawania i dynamiki kondensatów transkrypcyjnych tworzonych przez TF na DNA in vitro. DNA Curtains, wysokoprzepustowa platforma obrazowania in vitro do badania interakcji między białkami a DNA, została zastosowana w naprawie DNA19,20,21, target search22, and LLPS17,23,24. Komórka przepływowa kurtyn DNA jest pokryta biotynylowanymi dwuwarstwami lipidowymi, które pasywują powierzchnię i umożliwiają dyfuzję biomolekuł na powierzchni. Nanowytworzone zygzakowate wzory ograniczają ruch DNA. Biotynylowane substraty DNA Lambda mogą ułożyć się wzdłuż krawędzi bariery i zostać rozciągnięte przez zorientowany przepływ buforowy. Te same sekwencje początkowe i końcowe wszystkich cząsteczek umożliwiają śledzenie białka na DNA i opisują rozkład pozycji zdarzeń wiązania25,26. Co więcej, połączenie kurtyn DNA z mikroskopią fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) pomaga zminimalizować szum tła i wykrywać sygnały na poziomie pojedynczej cząsteczki. W związku z tym DNA Curtains może być obiecującą metodą badania dynamiki tworzenia się kondensatu transkrypcyjnego na motywach DNA. W artykule opisano przykład onkoproteiny fuzyjnej z rodziny FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generowanej przez translokację chromosomową. DNA Lambda zawierające 25× GGAA - sekwencję wiążącą EWS-FLI127- zostało użyte jako substrat DNA w eksperymentach DNA Curtains w celu obserwacji, jak cząsteczki EWS-FLI1 przechodzą LLPS na DNA. W niniejszym manuskrypcie szczegółowo omówiono protokół eksperymentalny i metody analizy danych.

<table><tbody><tr><td>Laser półprzewodnikowy pompowany diodą 488 nm Laser półprzewodnikowy</td><td>Koherentny</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 nm Laser półprzewodnikowy pompowany diodą</td><td>Koherentny</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>agarowy</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>Przewodząca powłoka ochronna</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I bydlęca</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S Ekstrakty</td><td></td></tr><tr><td>z upakowania lambda</td><td>Epicentrum</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon</td><td>Eclipse</td><td>Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Bulion</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, MLECZAN ETYLU 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANIZOL 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Naukowa kamera CMOS</td><td>FOTOMETRIA</td><td>Proteinaza Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko ze szkła krzemionkowego</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sześciodrogowy zawór wtryskowy</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>Rozcieńczony ddH2O</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Pompa do aparatury</td><td>Harvard11 Ligaza DNA Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>Jodek YOYO-1 (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>Rozcieńczony DMSO</td></tr></tbody></table>

obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów ews-fli1 składających się na dna

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Geny fuzyjne wynikające z translokacji chromosomów zostały znalezione w wielu guzach litych lub białaczce. EWS-FLI1, który należy do rodziny onkoprotein fuzyjnych FUS/EWS/TAF15 (FET), jest jednym z najczęściej zaangażowanych genów fuzyjnych w mięsaku Ewinga. Te białka fuzyjne z rodziny FET zazwyczaj zawierają domenę o niskiej złożoności (LCD) białka FET na swoim N-końcu i domenę wiążącą DNA (DBD) na C-końcu. Potwierdzono, że EWS-FLI1 tworzy kondensaty biomolekularne w docelowych loci wiązania w wyniku interakcji LCD-LCD i LCD-DBD, a kondensaty te mogą rekrutować polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów. Jednak sposób, w jaki te kondensaty są gromadzone w miejscach wiązania, pozostaje niejasny. Niedawno zastosowano metodę biofizyki pojedynczej cząsteczki - DNA Curtains - do wizualizacji tych procesów składania kondensatów EWS-FLI1. W tym miejscu omówiono szczegółowy protokół eksperymentalny i podejścia do analizy danych w celu zastosowania kurtyn DNA w badaniu kondensatów biomolekularnych gromadzących się na docelowym DNA.

Schemat DNA Curtains przedstawiono na Rysunku 1A, Rysunku 1B oraz Rysunku 1D. Sklonowana sekwencja docelowa zawierająca 25 nieprzerwanych powtórzeń GGAA znajduje się w promotorze NORB1 w mięsakowi Ewinga. Ta sekwencja docelowa jest kluczowa dla rekrutacji EWS-FLI128. Cząsteczki EWS-FLI1 wizualizowano poprzez wykrywanie sygnałów mCherry-EWS-FLI1 uzyskanych za pomocą lasera 561 nm (<strong class="xfi...

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Zapewniamy test pojedynczej cząsteczki do obserwacji separacji faz czynników transkrypcyjnych na DNA Ta technika pozwala na realizację w czasie rzeczywistym dynamicznego procesu łączenia się czynników transkrypcyjnych w postaci ciekłej kropelki na DNA. EWS-FL1 jest jednym z najczęściej zaangażowanych genów fuzyjnych w nowotworzeniu mięsaka Ewinga. Nasze badania mogą zidentyfikować związek między liczbą motywów DNA a tworzeniem kondensatu EWS-FL1, który jest związany z jałową transkrypcją genów w komórkach nowotworowych i może być pomocny w rokowaniu.Metoda ta może być stosowana do badania dowolnych kondensatów lub kompleksów transkrypcyjnych in vitro, takich jak P53 i MED1. Aby przygotować komórkę przepływową z zygzakowatymi nano barierami do eksperymentu z kurtyną DNA, połącz rurki wejściowe i wyjściowe we właściwym kierunku. Następnie umyj komorę przepływową 2,5 mililitra buforu lipidowego za pomocą dwóch trzymililitrowych strzykawek, upewniając się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków.Wyjąć strzykawkę z wyjścia i wstrzyknąć jeden mililitr roztworu liposomu trzy razy w pięciominutowej inkubacji między każdym wstrzyknięciem. W celu gojenia należy powoli przemyć komórkę przepływową 2,5 mililitra buforu lipidowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Podczas inkubacji należy przygotować bufor BSA zgodnie z opisem w tekście.Następnie po 30 minutach gojenia przemyć komórkę przepływową 2,5 mililitra buforu BSA od strony wyjściowej. Następnie wstrzyknąć 800 mikrolitrów buforu streptawidyny do komory przepływowej od strony wejściowej w dwóch etapach z 10-minutową inkubacją po każdym kroku. Następnie umyj komórkę przepływową 2,5 mililitra buforu BSA, aby usunąć wszystkie wolne cząsteczki streptawidyny.Następnie rozcieńczyć biotynę DNA Lambda ze sklonowanymi motywami za pomocą buforu BSA i wstrzyknąć go powoli cztery razy w odstępach pięciominutowych. Podczas wstrzykiwania włącz mikroskop w naukowym systemie uzupełniającym półprzewodnikowym z tlenku metalu. Następnie umyj rurkę 10 mililitrami podwójnie destylowanej wody i wypłucz pryzmat i złącze rurki wodą, 2% płynnym środkiem do czyszczenia kuwet i 99% etanolem.Następnie pobrać co najmniej 20 mililitrów buforu do obrazowania do 30-mililitrowej strzykawki. Ustawić celę przepływową na stoliku mikroskopu i podłączyć ją do układu mikroprzepływowego. Używając natężenia przepływu 0,03 mililitra na minutę, spłukuj cząsteczki DNA do bariery przez 10 minut.Następnie wyłącz układ mikroprzepływowy i inkubuj przez 30 minut. z zatrzymanym przepływem, umożliwiając dyfuzję DNA na boki. Aby zobrazować tworzenie się kondensacji EWS-FLI1 na zasłonach DNA, otwórz oprogramowanie do obrazowania i znajdź i zaznacz pozycje dziewięciu zygzakowatych wzorów w jasnym polu.Następnie włącz przepływ z prędkością 0,2 mililitra na minutę, aby zabarwić DNA dwuniciowym barwnikiem DNA przez 10 minut. Następnie rozcieńczyć białko mCherry EWS-FLI1 buforem obrazowania w stężeniu 100 nanomoli w 100 mikrolitrach. Następnie załaduj próbkę białka przez zawór za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i zmień natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę.Po włączeniu lasera o długości 488 nanometrów należy wstępnie zeskanować każdy region, aby sprawdzić stan dystrybucji DNA i wybrać region, w którym cząsteczki DNA rozprowadzają się równomiernie. Następnie ustaw moc lasera na 10% dla lasera 488 nanometrów i 20% dla lasera 561 nanometrów. Za pomocą miernika mocy zmierz rzeczywistą moc lasera w pobliżu pryzmatu.Rozpocznij rejestrowanie obrazów w dwusekundowych odstępach za pomocą laserów o długości fali 488 i 561 nanometrów jednocześnie. Następnie zmień zawór z trybu ręcznego na tryb wstrzykiwania, aby bufor obrazowania przepłukał próbkę białka do komórki przepływowej po 60 sekundach. Aby usunąć wolny EWS-FLI1, myj komórkę przepływową buforem obrazowania przez pięć minut, gdy włączony jest tylko laser 561 nanometrów.Następnie zatrzymaj przepływ i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po 10 minutach włącz przepływ z prędkością 0,4 mililitra na minutę, aby DNA się rozszerzyło i uzyskaj obrazy w dwusekundowych odstępach między różnymi klatkami, aby uzyskać dane o wysokiej przepustowości tworzenia kondensatu EWS-FLI1. Cząsteczki EWS-FLI1 zwizualizowano poprzez wykrycie sygnałów EWS-FLI1 znakowanych mCherry uzyskanych za pomocą lasera o długości fali 561 nanometrów.Tworzenie się kondensatu EWS-FLI1 in vitro w miejscu 25 powtórzeń GGAA w substracie DNA można bezpośrednio zwizualizować. Specyficzność mCherry EWS-FLI1 zastosowanego w kurtynach DNA została potwierdzona przez test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu matrycy DNA z 25 powtórzeniami GGAA i bez nich oddzielnie. Gdy stężenie EWS-FLI1 zostało miareczkowane od 20 do 500 nanomoli, intensywność EWS-FLI1 dramatycznie wzrosła.Natomiast zmiana intensywności FLI one DBD była nieistotna, gdy białka były nasycone w celu pokrycia powtórzeń GGAA, co sugeruje, że EWS-FLI1 tworzył kondensaty na DNA. Wstrzyknięcie powinno być bardzo powolne i miękkie, aby liposom i DNA mogły równomiernie rozprowadzić się na komórce przepływowej. Ważne jest, aby wykonać MSA, aby potwierdzić, że oczyszczony czynnik transkrypcyjny specyficznie wiąże się z sekwencją docelową in vitro.Technika ta pozwala ludziom zbadać, czy kondensat ułatwi docelowe poszukiwanie czynników transkrypcyjnych i jego wpływ na transkrypcję.

single-molecule-imaging-of-ews-fli1-condensates-assembling-on-dna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Poznaj metodę DNA Curtains do obrazowania pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 na DNA. Technika ta pozwala badać dynamikę separacji fazowej czynników transkrypcyjnych i jej znaczenie w rozwoju mięsaka Ewinga.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Przeglądaj więcej filmów