Name: Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Naucz się izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu inhibitora Rock Y-27632. Ta zmodyfikowana metoda enzymatyczna zwiększa wydajność i właściwości komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong (ZR2019ZD36) oraz Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Prowincji Shandong (2019GSF108107) do X.W.; Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Prowincji Shandong (2018GSF118240) do J.G.; Projekt Rozwoju Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w prowincji Shandong (2018WS163) do ZX oraz Projekt Rozwoju Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w Prowincji Shandong (2019WS045) do JS

Ludzkie tkanki użyte w tym protokole to świeże dorosłe tkanki dziąseł, wyrzucone z ekstrakcji zębów zatrzymanych na Oddziale Chirurgii Szczękowo-Twarzowej zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych Instytucji (Protokół No. GR201711, z dnia: 27.02.2017).
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Zebrać świeże dorosłe tkanki dziąseł do probówek o pojemności 15 ml zawierających 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 3% penicyliną/streptomycyną (P/S) i utrzymywać tkanki w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Traktuj tkanki zgodnie z opisem poniżej w ciągu 24 godzin po wycięciu.</li>
</ol>
2. Przygotuj odczynniki i pożywkę hodowlaną
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór myjący: 3% P/S. Zmieszaj 50 ml PBS z 1,5 ml penicyliny (100 U/ml) i 1,5 ml streptomycyny (100 mg/l).</li>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki zawierającej czynnik wzrostu (zwanej pożywką G): pożywki DMEM/F12 (3:1) zawierającej 1% P/S, 2% suplementu B27, 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 40 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) i 40 μg/ml fungizonu.</li>
	<li>Przygotować roztwory trawienia enzymatycznego dla nowej metody: Rozpuścić 125 mg proszku Dispazy i 125 mg proszku kolagenazy typu I w 50 ml DMEM. 
	UWAGA: Przefiltruj wszystkie roztwory enzymów przez sitko 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki, aby zneutralizować trawienie enzymatyczne: 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% P/S w pożywce DMEM.</li>
</ol>
3. Metoda bezpośredniego eksplantatu
<ol>
	<li>Wstępne leczenie tkanki dziąseł
	<ol>
		<li>Myj tkankę dziąseł 5 ml 75% etanolu przez 30 s. Następnie spłukać dwukrotnie 5 ml roztworu myjącego (krok 2.1) przez 5 min. 
		UWAGA: Wszystkie mycia należy wykonywać w naczyniach do hodowli komórkowych o średnicy 50 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek nabłonka dziąseł
	<ol>
		<li>Pokrój tkankę dziąsła na 1 mm3 kawałki i rozsyp je w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Do operacji cięcia używaj cienkich spiczastych kleszczy i nożyczek okulistycznych.</li>
		<li>Dodaj G-pożywkę (krok 2.2) do naczynia hodowlanego. Następnie inkubować szalkę hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Za pomocą mikroskopu odwróconego (40x) badać tkanki co 24 godziny.</li>
		<li>Usuń kawałki tkanki dziąseł, gdy komórki nabłonka rozpropagują się do średnicy 2-5 mm wokół kawałków tkanki. Zmieniaj G-medium co 2-4 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nowa zmodyfikowana metoda enzymatyczna
<ol>
	<li>Wstępne leczenie tkanki dziąseł
	<ol>
		<li>W tym celu należy wykonać te same czynności, które opisano dla metody bezpośredniego eksplantatu, krok 3.1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie tkanki dziąsłowej
	<ol>
		<li>Pokrój tkankę dziąsła na drobne kawałki o wielkości około <1 mm za pomocą dwóch wysterylizowanych ostrzy. Powtórz proces rozdrabniania za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu 2,5 mg/ml dispazy + kolagenazy do 1,5 ml probówki wirówkowej zawierającej fragmenty tkanki dziąsła, a następnie inkubować probówkę przez 15-20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Gdy tkanka stanie się przezroczysta i kłaczkowata, dodaj 1 ml roztworu neutralizującego, aby zakończyć trawienie. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół 10-15 razy. Przepuścić roztwór przez filtr siatkowy o wielkości 100 μm.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy na dnie w 10 ml pożywki zawierającej czynnik wzrostu (krok 2.2). Przenieść zawiesinę komórkową do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm. Dodać 10 μM Y-27632 do naczynia do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Wymieniaj starą pożywkę G-medium na świeżą pożywkę G-pożywkę co 2 dni. Obserwuj komórki w dniu 1 i dniu 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przekazywanie komórek
<ol>
	<li>Wyjmij naczynie z inkubatora, usuń zużyte podłoże i umyj dwukrotnie PBS. Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny na każde naczynie 100 mm. 
	UWAGA: Wstrząśnij naczyniem, aby upewnić się, że roztwór trypsyny ma wystarczający kontakt z dnem naczynia.</li>
	<li>Pozostawić naczynie w inkubatorze na około 5 minut w temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia procesu trawienia.</li>
	<li>Użyj mikroskopu (40x), aby zbadać komórki i upewnij się, że większość komórek oddzieliła się od dna naczynia.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu neutralizującego, aby zatrzymać trawienie i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml. Pipetę w górę i w dół 10-15 razy. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad powoli. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki G i policzyć liczbę komórek.</li>
	<li>Dodaj około 1 x 106 komórek w 10 ml G-pożywki i 10 μM Y-27632 do każdej 100 mm szalki.</li>
	<li>Odnawiaj G-medium i Y-27632 co 2 dni. Wyświetl komórki w dniu 1 i dniu 5.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gingival+barrier%3A+regulation+by+beneficial+and+harmful+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes.</a> Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).</li>
<li>Michea, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+control+of+the+human+pDC+response+to+extracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria.</a> European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).</li>
<li>Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anti-inflammatory+activity+of+the+antimicrobial+peptides+human+beta-defensin-3+%28hBD-3%29+and+cathelicidin+%28LL-37%29+in+a+three-dimensional+co-culture+model+of+gingival+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts.</a> PloS one. 9, 106766(2014).</li>
<li>Sciezynska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).</li>
<li>Bryja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+different+methods+used+in+the+primary+culture+of+oral+mucosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Regulators+and+Homeostatic+Agents%22%5BJournal%5D)">Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells.</a> Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).</li>
<li>Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+human+gingival+epithelial+cells%3A+comparison+of+two+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cranio-Maxillo-Facial+Surgery%3A+Official+Publication+of+the+European+Association+for+Cranio-Maxillo-Facial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques.</a> Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).</li>
<li>Klingbeil, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+cellular+harvesting+methods+for+primary+human+oral+culture+of+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).</li>
<li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+simple+isolation+method+to+obtain+both+epidermal+and+dermal+stem+cells+from+human+skin+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).</li>
<li>Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+during+healing+of+free+palatal+mucosa+grafts+on+plastic-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%3A+Official+Publication+of+the+International+Association+of+Oral+Pathologists+and+the+American+Academy+of+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).</li>
<li>Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gingival+epithelial+phenotypes+by+interactions+with+regionally+defined+populations+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts.</a> Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).</li>
<li>Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratin+patterns+of+human+oral+mucosae+in+histiotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture.</a> Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).</li>
<li>Kasai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+human+oral+mucosal+epithelial+cells+as+a+quality+control+of+the+cell+source+for+fabrication+of+transplantable+epithelial+cell+sheets+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine.</a> Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).</li>
<li>Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oral+epithelial+cell+culture.+II.+Keratin+expression+in+fetal+and+adult+gingival+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%3A+Journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).</li>
<li>Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contribution+of+epithelium+to+organ+fibrosis%3A+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition.</a> Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+bromodeoxyuridine-incorporating%2C+p63-+and+p75%28NGFR%29-+expressing+cells+in+the+human+gingival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium.</a> Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).</li>
<li>Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+produced+oral+mucosa+equivalent+by+using+the+direct+explant+cell+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Balkan+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique.</a> Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).</li>
<li>Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocyte+isolation+and+cell+culture%3A+a+survey+of+current+practices+in+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK.</a> Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).</li>
<li>Carrel, A., Burrows, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+adult+tissues+and+organs+outside+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cultivation of adult tissues and organs outside the body.</a> Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+keratinizing+epithelium+in+culture+by+a+cloned+cell+line+derived+from+a+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma.</a> Cell. 6, 317-330 (1975).</li>
<li>Oda, D., Watson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oral+epithelial+cell+culture+I.+Improved+conditions+for+reproducible+culture+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%3A+Journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).</li>
<li>Smola, H., Krieg, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmola%2C+H+%22The+keratinocyte+handbook%22">The keratinocyte handbook</a>. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).</li>
<li>Shwetha, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+oral+keratinocytes+using+direct+explant+cell+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%3A+JOMFP%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).</li>
<li>Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+low+calcium+with+Y-27632+rock+inhibitor+increases+the+proliferative+capacity%2C+expansion+potential+and+lifespan+of+primary+human+keratinocytes+while+retaining+their+capacity+to+differentiate+into+stratified+epidermis+in+a+3D+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model.</a> PloS One. 10, 0123651(2015).</li>
<li>Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+and+explant+methods+for+the+culture+of+keratinocytes+isolated+from+human+foreskin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin.</a> Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).</li>
<li>Rosin, F. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+expression+in+gingival+tissue+and+primary+cultured+gingival+keratinocytes%3A+Are+there+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences.</a> Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).</li>
<li>Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+inhibitor+Y-27632+facilitates+the+proliferation%2C+migration+and+pluripotency+of+human+periodontal+ligament+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Tkanka dziąseł jest kluczową strukturą, która utrzymuje integralność i zdrowie przyzębia. Komórki nabłonka dziąseł odgrywają znaczącą rolę w naprawie i regeneracji tkanki przyzębia i mogą być wykorzystywane w badaniach naukowych i zastosowaniach klinicznych oraz w dziedzinach pokrewnych, w tym w biologii jamy ustnej, farmakologii, toksykologii i niedoborach błony śluzowej jamy ustnej18. Dlatego konieczne jest opracowanie stabilnej i skutecznej metody pobierania komórek nabłonka jamy ustnej<sup cla...

Ludzkie dziąsło, pierwsza linia obrony chroniąca tkankę przyzębia, jest nie tylko fizyczną i chemiczną barierą1, ale także wydziela różne klasy mediatorów stanu zapalnego, które uczestniczą w odpowiedziach immunologicznych i stanowią barierę immunologiczną2,3. Nabłonek dziąseł odgrywa ważną rolę w naprawie i regeneracji tkanki przyzębia. Dlatego badanie obrony i odporności nabłonka dziąseł ma ogromne znaczenie dla zrozumienia występowania, diagnozowania i leczenia zapalenia przyzębia. Izolacja i hodowla komórek nabłonka dziąseł z ludzkiej tkanki dziąsła jest pierwszym krokiem wymaganym do zbadania nabłonka dziąseł. Taka procedura wymaga podstawowych operacji, takich jak produkcja komórek nasiennych do inżynierii tkankowej, modeli in vitro chorób związanych z przyzębiem oraz materiałów do naprawy wad przyzębia.
Pierwotne komórki nabłonka dziąseł charakteryzują się niskim współczynnikiem podziału in vitro4, naukowcy od dziesięcioleci poszukują optymalnej metody izolacji i hodowli. Do tej pory dwie różne techniki, metoda bezpośredniego eksplantatu i metoda enzymatyczna, są powszechnie stosowane w laboratoriach do uzyskiwania pierwotnych komórek nabłonka dziąseł in vitro4,5. Metoda bezpośredniego eksplantatu ma zalety, takie jak wymóg mniejszej ilości próbek tkanek i prosta procedura izolacji, ale ma wady w postaci dłuższego czasu hodowli i podatności na zanieczyszczenie5. Chociaż metoda enzymatyczna skraca wymagany czas hodowli, wydajność jest stosunkowo niska i różni się w zależności od użytych enzymów i pożywki. Kedjarune et al.6 wykazali, że metoda bezpośredniego eksplantatu, która wymaga więcej czasu przed subkulturą (2 tygodnie), okazała się bardziej skuteczna w hodowli komórek nabłonka dziąseł w porównaniu z metodą enzymatyczną. Jednak porównując te dwie metody, Klingbeil i wsp.7 stwierdzili, że metoda enzymatyczna dała najlepsze wyniki dla pierwotnych hodowli komórek nabłonka jamy ustnej i możliwe było uzyskanie optymalnej wydajności komórek w najkrótszym czasie (11,9 dnia w porównaniu z 14,2 dnia).
Dlatego ważne było opracowanie wygodniejszej i skuteczniejszej metody izolacji i hodowli komórek nabłonka jamy ustnej4. Wcześniej informowaliśmy, że dodanie Y-27632, inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK), upraszcza procedurę izolacji ludzkich pierwotnych komórek naskórka i keratynocytów z dorosłych tkanek skóry8,9,10. Opracowaliśmy G-pożywkę, nową kondycjonowaną pożywkę do inokulacji, która spontanicznie oddziela komórki naskórka od komórek skóry właściwej oraz wspomaga wzrost i wydajność pierwotnych komórek naskórka8,9,10. W niniejszym badaniu opracowaliśmy nową technikę izolacji i hodowli komórek nabłonka dziąseł bez surowicy poprzez połączenie G-medium z Y-27632. Zasadniczo nasza metoda opiera się na uproszczeniu tradycyjnej dwuetapowej metody enzymatycznej, dlatego porównaliśmy naszą nową metodę z metodą bezpośredniego eksplantatu. Ta zmodyfikowana metoda enzymatyczna znacznie skraca czas potrzebny do oddzielenia komórek nabłonka dziąseł od tkanki dziąsła i zwiększa efektywność hodowli komórek nabłonka dziąseł.

<table><tbody><tr><td>Nazwy</td><td></td><td></td><td>Skróty & Komentarze</td></tr><tr><td>Hrabina automatyczny licznik komórek</td><td>Shanghai Ruiyu Bio-science& Technologia Co.Ltd.</td><td>BBA0218AC</td><td>Automatyczne zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>Do inkubacji komórek</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Wirówka komórkowa</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Do wirowania komórek</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>KIRGEN</td><td>190691J</td><td>Do trawienia komórek</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Corning wbudowane</td><td>431792</td><td>Filtracja komórkowa</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanami</td><td>Solarbio Life Science</td><td>P1020-500</td><td>Roztwór myjący</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Składnik pożywki neutralizacyjnej</td></tr><tr><td>Zdefiniowany K-SFM</td><td>Żywotność Technologie</td><td>10785-012</td><td>Nabłonek dziąseł&nbsp; pożywka do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Przemysł biologiczny</td><td>04-001-1AC5</td><td>Składnik pożywki neutralizującej</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>Do dysocjacji HGGEPC</td></tr><tr><td>Podłoże rozcieńczające</td><td>Life Technologies</td><td>50-9701</td><td>Do powlekania matrycy</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Do izolacji HGGEPCs</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>Do izolacji HGGEPCs</td></tr><tr><td>F12 Mieszanka składników odżywczych, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Składnik G-medium</td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Czynnik wzrostu w G-pożywce</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Czynnik wzrostu w G-pożywce</td></tr><tr><td>Operacja genu</td><td>Y-27632</td><td>IAD1011</td><td>inhibitor ROCK</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparat do G-medium</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko ludzkie</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Czynnik wzrostu w G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>CK04</td><td>Do testu proliferacji komórek</td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki CK18</td><td>Abcam</td><td>ab82254</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC</td></tr><tr><td>Króliczej anty-ludzkiej cytokeratyny10</td><td>Abcam</td><td>ab76318</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> wimentyny<td>3390</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego fibroblastów dziąseł</td></tr><tr><td>Królik Anti-Human pan-ck</td><td>BD 550951</td><td></td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC</td></tr><tr><td>królika anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>15580</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC</td></tr><tr><td>królika anty-p63</td><td>Biolegend</td><td>619002</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC</td></tr><tr><td>królik anty-p75NGFR</td><td>Abcam</td><td>ab52987</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu y-27632

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Tkanka dziąseł jest pierwszą strukturą, która chroni tkanki przyzębia i odgrywa znaczącą rolę w wielu funkcjach jamy ustnej. Nabłonek dziąsła jest ważną strukturą tkanki dziąseł, szczególnie w naprawie i regeneracji tkanki przyzębia. Badanie funkcji komórek nabłonka dziąseł ma kluczową wartość naukową, taką jak naprawa wad jamy ustnej i wykrywanie kompatybilności biomateriałów. Ponieważ ludzkie komórki nabłonka dziąseł są wysoce zróżnicowanymi komórkami zrogowaciałymi, ich żywotność jest krótka i są trudne do przejścia. Jak dotąd istnieją tylko dwa sposoby izolacji i hodowli komórek nabłonka dziąseł: metoda bezpośredniego eksplantatu i metoda enzymatyczna. Jednak czas potrzebny do uzyskania komórek nabłonkowych metodą bezpośredniego eksplantatu jest dłuższy, a przeżywalność komórek metodą enzymatyczną jest niższa. Klinicznie pozyskiwanie tkanki dziąsła jest ograniczone, dlatego potrzebny jest stabilny, wydajny i prosty system izolacji i hodowli in vitro. Ulepszyliśmy tradycyjną metodę enzymatyczną, dodając Y-27632, inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCK), który może selektywnie promować wzrost komórek nabłonka. Nasza zmodyfikowana metoda enzymatyczna upraszcza etapy tradycyjnej metody enzymatycznej i zwiększa efektywność hodowli komórek nabłonkowych, co ma znaczące zalety w porównaniu z metodą bezpośredniego eksplantatu i metodą enzymatyczną.

Rysunek 1 przedstawia schematycznie metodę bezpośredniego eksplantu oraz zmodyfikowaną metodę enzymatyczną. Metoda bezpośredniego eksplantu nie wymaga zastosowania żadnych enzymów trawiennych w całym procesie. W przeciwieństwie do niej, tradycyjna metoda enzymatyczna zazwyczaj wymaga dwóch zestawów enzymów trawiennych – dyspazy i kolagenazy – w celu oddzielenia warstwy nabłonka od podścielającej ją warstwy fibroblastów, a następnie trypsyny, aby uwolnić komórki nabłonka do zawiesiny. Nasza n...

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Tak więc ogólnym celem tego protokołu opartego na komórkach jest wyizolowanie i spotkanie ludzkich komórek nabłonka dziąseł w celu poprawy wad metody bezpośredniego bakłażana. Dzięki nowej, zmodyfikowanej metodzie endotemicznej możemy uzyskać większą liczbę pierwotnych komórek nabłonka dziąseł w stosunkowo krótkim czasie, w oparciu o nasze materiały i sprzęt. Tak więc tkanka ludzka użyta w tym protokole była świeżymi dorosłymi tkankami dziąsła wyrzuconymi z ekstrakcji zębów zatrzymanych na Oddziale Chirurgii Szczękowo-Twarzowej zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach Instytucji.Nowa zmodyfikowana metoda enzymatyczna.Wstępne leczenie tkanki dziąseł.Płucz tkanki 75% etanolem przez 30 sekund. A następnie z roztworem myjącym dwa razy po pięć minut. Trawienie tkanki dziąseł.Pokrój tkanki na drobne kawałki za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych. Dodać 2,5 mg/mililitr roztworu dypazy i kolagenazy-1 do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Umieść kawałki tkanek w probówce wirówkowej o średnicy 1,5 mililitra. Inkubuj przez 15-20 minut w 37

isolation-culture-primary-human-gingival-epithelial-cells-using-y

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film pokazuje procedurę izolacji sieci komórek odpornościowych dziąseł od modelu mysiego. Trawienie enzymatyczne uwalnia tkankę dziąsła z przyczepionych zębów i kości, która jest dalej trawiona mechanicznie, uwalniając komórki odpornościowe z dziąsła. Wyizolowane komórki są gotowe do eksperymentów immunologicznych.

Izolacja sieci komórek odpornościowych dziąseł z bloków zębów myszy

Ten film demonstruje technikę oceny zdolności Porphyromonas gingivalis, beztlenowej bakterii chorobotwórczej, do przylegania i atakowania ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Po zakażeniu komórek gospodarza bakteriami, komórki gospodarza są poddawane lizie w celu uwolnienia zarówno przylegających, jak i zinternalizowanych bakterii. Gdy lizat jest posiewany w odpowiednim pożywce, obecność kolonii wskazuje na udane interakcje bakteria-komórka gospodarza.

Test infekcji bakteryjnej do badania interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

To badanie opisuje skuteczną technikę izolowania i przetwarzania tkanek dziąseł z jamy ustnej myszy w celu wytworzenia hodowli jednokomórkowej. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane do analizy cytometrii przepływowej i badań molekularnych.

Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Ten artykuł przedstawia dwa protokoły: jeden do pomiaru bakterii beztlenowych, które mogą z powodzeniem zaatakować i przetrwać w organizmie gospodarza, a drugi do wizualizacji bakterii beztlenowych oddziałujących z komórkami gospodarza. Badanie to można zastosować do każdego uprawianego beztlenowca i dowolnego typu komórek eukariotycznych.

Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.

Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Mieszek włosowy zawiera populację nabłonków i komórki mezenchymalne. Populację nabłonka wybrano z niejednorodnej populacji komórek pęcherzyków zębowych poprzez zapewnienie odrębnej pożywki hodowlanej. Komórki nabłonkowe przetrwały i utworzyły kolonie w podłożu wolnym od surowicy.

Izolacja komórek nabłonkowych z ludzkiego pęcherzyka zębowego

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Naucz się izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu inhibitora Rock Y-27632. Ta zmodyfikowana metoda enzymatyczna zwiększa wydajność i właściwości komórek macierzystych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

Przeglądaj więcej filmów