Name: Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj zoptymalizowany model niedrożności żyły siatkówki u myszy z wykorzystaniem róży bengalskiej i lasera. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne badanie mechanizmów uszkodzeń naczyniowych oraz rozwoju obrzęku w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<div>Praca ta była wspierana przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) grant DGE – 1644869 (dla CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (dla AMP), National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (dla CMT) oraz przez Departament Obrony Army Research Office Defense University Research Instrumentation Program (DURIP) (dla CMT).</div>

Ten protokół jest zgodny z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Eksperymenty na gryzoniach były zatwierdzone i monitorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Columbia.
UWAGA: We wszystkich eksperymentach używano dwumiesięcznych samców myszy, które ważyły około 20 g.
1. Przygotowanie i podawanie tamoksyfenu do indukowalnej genetycznej ablacji genów floxed
UWAGA: Na średnicę naczynia siatkówki może mieć wpływ waga zwierzęcia. Upewnij się, że wszystkie zwierzęta użyte do eksperymentu mają podobną wagę.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć tamoksyfen w oleju kukurydzianym do stężenia 20 mg/ml. 
	UWAGA: Tamoksyfen jest toksyczny i jest wrażliwy na światło. Chronić przed światłem, np. folią aluminiową.</li>
	<li>Wiruj roztwór przez kilka sekund.</li>
	<li>Pozostaw w piekarniku w temperaturze 55 °C na 15 min. 
	UWAGA: Upewnij się, że tamoksyfen całkowicie się rozpuścił. Może być konieczne dodatkowe wirowanie.</li>
	<li>Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. </li>
	<li>Do wstrzykiwań tamoksyfenu należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o sile 26 g. Oczyścić obszar wstrzyknięcia 70% etanolem. Podawać 2 mg tamoksyfenu (100 μl z 20 mg/ml) dootrzewnowo (IP) raz dziennie przez ustalony czas, zgodnie ze specyficzną indukowalną linią Cre. </li>
	<li>Przed rozpoczęciem doświadczeń należy zapewnić zwierzętom dwa dni odpoczynku.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników do fotokoagulacji laserowej
<ol>
	<li>Róża bengalska 
	UWAGA: Róża bengalska jest wrażliwa na światło. Przechowuj w ciemności do czasu użycia i przygotuj świeże, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
	<ol>
		<li>Przygotuj różę bengalską, rozcieńczając ją do 5 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przefiltruj przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.</li>
		<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę 26 G z różowym bengalem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ketamina/ksylazyna
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć ketaminę i ksylazynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dla następujących stężeń: ketamina (80-100 mg/kg) i ksylazyna (5-10 mg/kg).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karprofen
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć karprofen do 1 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę 26 G z karprofenem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylna sól fizjologiczna
	<ol>
		<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 5 ml wyposażoną w igłę o sile 26 g ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja lasera
<ol>
	<li>Delikatnie obchodź się z światłowodowym i podłącz go do skrzynki sterowniczej lasera i adaptera laserowego mikroskopu do obrazowania siatkówki.</li>
	<li>Włącz lampę mikroskopu do obrazowania siatkówki.</li>
	<li>Włącz komputer i otwórz program do tworzenia obrazów.</li>
	<li>Dostosuj balans bieli, używając kawałka białego papieru i kładąc go przed okularem myszy, a następnie klikając Dostosuj w programie do obrazowania.</li>
	<li>Włącz skrzynkę kontrolną lasera, przekręcając kluczyk i postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie skrzynki sterowania laserem. 
	UWAGA: Laser użyty w tym eksperymencie należy do klasy 3B i może powodować uszkodzenie oczu. Podczas obsługi lasera należy nosić okulary ochronne.</li>
	<li>Sprawdź podstawową moc lasera.
	<ol>
		<li>Użyj miernika mocy lasera.</li>
		<li>Dostosuj ekran skrzynki sterowniczej lasera do następujących parametrów: 50 mW i 2 000 ms.</li>
		<li>Włącz laser i umieść miernik mocy przed okularem. 
		UWAGA: Upewnij się, że światło mikroskopu jest wyłączone podczas testowania podstawowej mocy lasera.</li>
		<li>Naciśnij pedał przełącznika nożnego, aby aktywować laser.</li>
		<li>Celuj w to, aby odczyt mocy lasera wynosił 13-15 mW. 
		UWAGA: Odczyt mocy lasera określi wskaźnik powodzenia niedrożności żył siatkówki. Jeśli odczyt mocy lasera jest zbyt niski, można dokonać regulacji mocy i czasu ekspozycji lasera. Zalecenia znajdują się w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj eksperymentalną moc lasera, ustawiając ekran skrzynki sterowniczej lasera na następujące parametry: 100 mW, 1,000 ms.</li>
	<li>Wyłącz laser. 
	UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa i aby zapobiec przegrzaniu, najlepiej trzymać laser wyłączony między myszami.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie żyły mysiego ogona róży bengalskiej
<ol>
	<li>Wlej 300 ml wody do zlewki o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę.</li>
	<li>Włóż gazę do ciepłej wody w zlewce.</li>
	<li>Umieść mysz w ograniczniku.</li>
	<li>Delikatnie wciśnij gazę w ogon myszy i poszukaj rozszerzonych żył. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia chusteczką nasączoną alkoholem po rozszerzeniu ciepłej wody. </li>
	<li>Wprowadzić igłę w miejsce wstrzyknięcia i pociągnąć za strzykawkę, aby upewnić się, że pacjent znajduje się w żyle. Następnie wstrzyknąć żyłę ogona myszy, podając odpowiednią ilość w zależności od masy ciała zwierzęcia (37,5 mg/kg). Uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby uniknąć krwiaka lub krwawienia. Wyczyść witrynę.</li>
	<li>Uwolnij mysz z ogranicznika i włóż ją z powrotem do klatki.</li>
	<li>Odczekaj 8 minut, aby róża bengalska zaczęła krążyć przed wstrzyknięciem środków znieczulających. 
	UWAGA: Zapewni to łącznie 10 minut między wstrzyknięciem róży bengalskiej a napromieniowaniem laserowym.</li>
</ol>
5. Niedrożność głównych żył
<ol>
	<li>Włącz podgrzewaną platformę myszy.</li>
	<li>Dodaj po jednej kropli fenylefryny i tropikamidu do każdego oka.</li>
	<li>Wstrzyknąć 150 μl środków znieczulających, ketaminy (80-100 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg) IP. 
	UWAGA: Podczas tej procedury myszy podano dwa wstrzyknięcia IP. W związku z tym strony były naprzemienne. Wstrzyknięcie IP do znieczulenia podano do dolnego prawego kwadrantu brzucha, a sól fizjologiczną wstrzyknięto intp do dolnego lewego kwadrantu brzucha. Zaleca się pociągnięcie za strzykawkę przed wstrzyknięciem, aby upewnić się, że igła znajduje się w jamie brzusznej, a nie w żadnym narządzie.</li>
	<li>Uszczypnij zwierzę u nogi, aby określić głębokość znieczulenia i poczekaj, aż przestanie reagować.</li>
	<li>Dodać jedną kroplę chlorowodorku proparakainy na oko (przeciwbólowe).</li>
	<li>Dodaj maść żelową do obu oczu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 150 μl karprofenu podskórnie między uszy.</li>
	<li>Pomieścij mysz na platformie.</li>
	<li>Dostosuj platformę, aż widok dna siatkówki będzie wyraźny i skoncentrowany.</li>
	<li>Policz żyły siatkówki i zrób zdjęcie dna oka. 
	UWAGA: Żyły siatkówki są ciemniejsze i szersze niż tętnice. Żyły i tętnice występują naprzemiennie; Czasami jednak w pobliżu nerwu wzrokowego może znajdować się rozgałęziona tętnica, a zatem dwie sąsiednie tętnice.</li>
	<li>Włącz laser i skieruj się w stronę żyły siatkówki w odległości około 375 μm od tarczy nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Naświetlić naczynie, naciskając przełącznik nożny i lekko przesuwając wiązkę lasera do 100 μm. Powtórz ten krok trzy razy i przesuwaj wiązkę lasera po każdym impulsie, tak aby napromieniowanie nie skupiało się w jednym miejscu.</li>
	<li>Powtórz napromienianie na innych głównych naczyniach, aby uzyskać 2-3 okluzje.</li>
</ol>
6. Ustalanie liczby żył niedrożnych w dniu 0
<ol>
	<li>Po naświetleniu naczyń wyłączyć lampę i odczekać 10 min. 
	UWAGA: Ekspozycja na światło może powodować uszkodzenie siatkówki i stan zapalny; Wyłącz lampę w czasie oczekiwania, aby zminimalizować ekspozycję7.</li>
	<li>Włącz lampę z powrotem i policz liczbę zasłoniętych żył.</li>
	<li>Zrób zdjęcie dna oka.</li>
</ol>
7. Opieka po leczeniu
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej IP. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wstrzykiwania adresu IP znajdują się w sekcji 5, kroku 3.</li>
	<li>Dodaj nawilżające krople do oczu do obu oczu.</li>
	<li>Dodaj maść żelową do obu oczu.</li>
	<li>Obserwuj, jak mysz dochodzi do siebie po znieczuleniu i nie wracaj do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Karprofen (5 mg/kg) może być podawany codziennie do 2 dni po zabiegu. W przypadku stosowania u ludzi ból nie jest objawem RVO. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki w pełni nie wyzdrowieją ze znieczulenia. </li>
</ol>
8. Ocena obrzęku siatkówki za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT)
UWAGA: Ten krok można wykonać w interesującym go punkcie czasowym badacza. Szczyt obrzęku siatkówki u myszy C57BL/6J przypada na 1 dzień po zabiegu RVO. Ten punkt czasowy może się różnić w zależności od tła myszy.
<ol>
	<li>Włącz kaseton świetlny mikroskopu do obrazowania siatkówki, maszynę OCT i podgrzewaną platformę myszy.</li>
	<li>Dzień po okluzji wykonaj kroki od 5.2 do 5.7, aby przygotować zwierzę.</li>
	<li>Otwórz programy do obrazowania i OCT.</li>
	<li>W programie OCT ustaw szturchnięcie na 5.</li>
	<li>Weź OCT w odległości 75 μm od oparzenia lub 4 kliknięcia.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia OCT w czterech kwadrantach siatkówki.</li>
	<li>Analizuj obrazy OCT za pomocą oprogramowania do śledzenia.</li>
	<li>Porównaj grubość siatkówki w pomiarach przed napromieniowaniem z 1 dniem po RVO lub w punkcie zainteresowania w czasie. 
	UWAGA: Analizując dane, należy wziąć pod uwagę liczbę napromieniowanych żył, ponieważ może to wpływać na rozwój obrzęku siatkówki. Zwierzęta są następnie poddawane eutanazji poprzez podanie środka znieczulającego, a następnie operację perfuzji bez przeżycia.</li>
</ol>

<ol><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Ehlers, J. P., Fekrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vein+occlusion%3A+beyond+the+acute+event%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal vein occlusion: beyond the acute event.</a> Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).</li>
<li>Iftikhar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peak+vision+in+retinal+vein+occlusion+patients+treated+for+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema.</a> American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li>
<li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinal+morphology+alterations+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+mouse+model+of+retinal+branch+and+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion.</a> PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).</li>
<li>Fuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+approach+in+newly+established+retinal+vein+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model.</a> Scientific Reports. 7, 43509(2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+and+chemokines+in+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration.</a> Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Nicholson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+disorganization+of+the+retinal+inner+layers+in+detecting+macular+capillary+non-perfusion+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).</li>
<li>Moein, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+angiography+to+detect+macular+capillary+ischemia+in+patients+with+inner+retinal+changes+after+resolved+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema.</a> Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+model+of+central+retinal+vascular+occlusion+and+the+therapeutic+potential+of+the+adrenomedullin-receptor+activity-modifying+protein+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system.</a> American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).</li>
<li>Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+a+mouse+model+of+retinal+vein+occlusion+induced+by+laser+treatment+reveals+a+predominant+inflammatory+and+tissue+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response.</a> PLoS One. 13 (3), 0191338(2018).</li>
<li>Drechsler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intravitreal+anti-vascular+endothelial+growth+factor+treatment+on+the+retinal+gene+expression+in+acute+experimental+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion.</a> Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).</li>
<li>Genevois, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+remodeling+after+occlusion-recanalization+of+a+branch+retinal+vein+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).</li>
<li>Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of retinal vein occlusion.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).</li>
<li>Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+multimodal+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography+image-guided+laser+induced+branch+retinal+vein+occlusion+in+living+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10560(2019).</li>
<li>Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rose+Bengal+sensitized+bilayered+photoanode+of+nano-crystalline+TiO2-CeO2+for+dye-sensitized+solar+cell+application%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Nanoscience%22%5BJournal%5D)">Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application.</a> Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).</li>
<li>Emmart, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+absorption+spectra+of+fluorescein%2C+fluorescein+derivatives+and+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).</li>
<li>Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+spectrophotometric+method+for+the+determination+of+polyvinylpyrrolidone+with+eosin+Y%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y.</a> Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).</li>
<li>MacDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCs+of+RVO%3A+a+review+of+retinal+venous+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Optometry%22%5BJournal%5D)">The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion.</a> Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+weight+gain+modifies+severity+and+functional+outcome+of+oxygen-induced+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy.</a> American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).</li>
<li>LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sensitivity+to+light-induced+photoreceptor+degeneration+in+albino+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice.</a> Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).</li>
<li>Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+albino+retina%3A+an+abnormality+that+provides+insight+into+normal+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development.</a> Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).</li>
<li>Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Albinism.</a> Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+weight+gain+modifies+severity+and+functional+outcome+of+oxygen-induced+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy.</a> American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mysi model RVO umożliwia lepsze zrozumienie patologii RVO i przetestowanie potencjalnych środków terapeutycznych. Podczas gdy mysi model RVO jest szeroko stosowany w terenie, istnieje zapotrzebowanie na aktualny szczegółowy protokół modelu, który odnosi się do jego zmienności i opisuje optymalizację modelu. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik z przykładami z doświadczenia na temat tego, co można zmienić, aby uzyskać najbardziej spójne wyniki w całej kohorcie zwierząt doświadczalnych i dostarczyć wiarygodnych danych.</...

Niedrożność żył siatkówki (RVO) jest powszechną chorobą naczyniową siatkówki, która dotknęła około 28 milionów ludzi na całym świecie w 2015 roku1. RVO prowadzi do pogorszenia i utraty wzroku u osób dorosłych w wieku produkcyjnym i starszych, co stanowi trwającą chorobę zagrażającą wzrokowi, której szacuje się, że nasili się w ciągu najbliższej dekady. Niektóre z odrębnych patologii RVO obejmują uszkodzenie niedotlenieniowo-niedokrwienne, obrzęk siatkówki, stan zapalny i utratę neuronów2. Obecnie pierwszą linią leczenia tego zaburzenia jest podawanie inhibitorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF). Chociaż leczenie anty-VEGF pomogło złagodzić obrzęk siatkówki, wielu pacjentów nadal boryka się z pogorszeniem widzenia3. Aby lepiej zrozumieć patofizjologię tej choroby i przetestować potencjalne nowe linie leczenia, istnieje potrzeba stworzenia funkcjonalnego i szczegółowego protokołu mysiego modelu RVO dla różnych szczepów myszy.
Modele myszy zostały opracowane przy użyciu tego samego urządzenia laserowego, które stosuje się u ludzkich pacjentów, w połączeniu z systemem obrazowania przeskalowanym do rozmiaru odpowiedniego dla myszy. Ten mysi model RVO został po raz pierwszy opisany w 2007 roku4, a następnie ustalony przez Ebnetera i innych4,5. Ostatecznie model został zoptymalizowany przez Fumę i wsp., aby odtworzyć kluczowe objawy kliniczne RVO, takie jak obrzęk siatkówki6. Od czasu pierwszego doniesienia o modelu wiele badań wykorzystywało go przy użyciu podawania barwnika fotouczulającego, a następnie fotokoagulacji głównych żył siatkówki za pomocą lasera. Jednak ilość i rodzaj podawanego barwnika, moc lasera i czas ekspozycji różnią się znacznie w badaniach, w których zastosowano tę metodę. Różnice te mogą często prowadzić do zwiększonej zmienności modelu, co utrudnia jego replikację. Do tej pory nie opublikowano żadnych badań zawierających szczegółowe informacje na temat potencjalnych sposobów jego optymalizacji.
Ten raport przedstawia szczegółową metodologię modelu myszy RVO w szczepie C57BL/6J oraz szczepu indukowanego tamoksyfenem nokautem kaspazy śródbłonkowej-9 (iEC Casp9KO) z tłem C57BL/6J i mającym znaczenie dla patologii RVO jako szczep referencyjny dla genetycznie zmodyfikowanej myszy. Poprzednie badanie wykazało, że nieapoptotyczna aktywacja śródbłonkowej kaspazy-9 wywołuje obrzęk siatkówki i sprzyja śmierci neuronów8. Doświadczenie w stosowaniu tego szczepu pomogło określić i dostarczyć informacji na temat potencjalnych modyfikacji w celu dostosowania mysiego modelu RVO, który może mieć zastosowanie do innych genetycznie zmodyfikowanych szczepów.

<table><tbody><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>NADA #141-199</td><td>trzymaj na 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>światłowodowy</td><td>Thor Labs</td><td>M14L02</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Lasercheck</td><td>Coherent</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoneix Micron IV z południkiem,&nbsp; Moduły StreamPix i OCT</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy</td><td>Akorn</td><td>NDC: 17478-263-12</td><td>utrzymywać na poziomie 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Refresh</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-5G</td><td>światłoczuły</td></tr><tr><td>Tropicamid</td><td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mysie modele niedrożności żył siatkówki (RVO) są często używane w okulistyce do badania uszkodzeń niedotlenieniowo-niedokrwiennych siatkówki nerwowej. W tym raporcie przedstawiono szczegółową metodę wskazującą krytyczne kroki wraz z zaleceniami dotyczącymi optymalizacji w celu osiągnięcia niezmiennie skutecznych wskaźników okluzji w różnych genetycznie zmodyfikowanych szczepach myszy. Mysi model RVO składa się głównie z dożylnego podania barwnika fotouczulającego, a następnie fotokoagulacji laserowej przy użyciu mikroskopu do obrazowania siatkówki podłączonego do lasera kierowanego okulistycznie. Zidentyfikowano trzy zmienne jako determinanty spójności okluzji. Dostosowując czas oczekiwania po podaniu róży bengalskiej i równoważąc wartość wyjściową i eksperymentalną lasera, można ograniczyć zmienność między eksperymentami i osiągnąć wyższy wskaźnik powodzenia okluzji. Metoda ta może być stosowana do badania chorób siatkówki, które charakteryzują się obrzękiem siatkówki i uszkodzeniem niedotlenieniowo-niedokrwiennym. Dodatkowo, ponieważ model ten indukuje uszkodzenie naczyń krwionośnych, może być również stosowany do badania układu nerwowo-naczyniowego, śmierci neuronów i stanu zapalnego.

Model mysi RVO ma na celu skuteczne wywołanie zatorów w żyłach siatkówki, co prowadzi do uszkodzeń niedokrwienno-hipoksycznych, rozpadu bariery krew-siatkówka, śmierci neuronów oraz obrzęku siatkówki8. Rycina 1 przedstawia harmonogram działań zapewniających powtarzalność, schemat planu eksperymentalnego oraz opisuje kroki, które mogą zostać dodatkowo zoptymalizowane w zależności od stawianych pytań badawczych. Trzema głównymi etapami podlegającymi modyfikacji są: czas...

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Protokół stanowi model do badania mechanizmów uszkodzenia naczyń krwionośnych i późniejszego rozwoju obrzęku w sposób nieinwazyjny. Główną zaletą tej techniki jest to, że można śledzić uraz na żywo w czasie bez interwencji chirurgicznej. Daje to możliwość skuteczniejszego testowania zabiegów.Nauczenie się, jak prawidłowo żyłkować ogon i prawidłowo umieścić zwierzę na platformie, może być trudne. W przypadku obu technik zalecam uzbroić się w cierpliwość i działać powoli. Aby rozpocząć, delikatnie obejmij się z światłowodowym i podłącz go do skrzynki sterowniczej lasera i adaptera laserowego mikroskopu do obrazowania siatkówki, a następnie włącz lampę mikroskopu do obrazowania siatkówki.Włącz komputer i otwórz program do obrazowania. Umieść kawałek białego papieru przed okularem mikroskopu i wyreguluj balans bieli, klikając Dostosuj w programie do obrazowania. Włącz skrzynkę kontrolną lasera, przekręcając kluczyk i postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie skrzynki sterowniczej lasera.Aby sprawdzić bazową moc lasera, ustaw skrzynkę kontrolną lasera na 50 miliwatów i 2 000 milisekund. Następnie włącz laser i umieść miernik mocy przed okularem. Naciśnij pedał przełącznika nożnego, aby aktywować laser, dążąc do tego, aby odczyt mocy lasera wynosił od 13 do 15 miliwatów.Następnie, korzystając z ekranu skrzynki kontrolnej lasera, dostosuj eksperymentalną moc lasera do 100 miliwatów i 1 000 milisekund i wyłącz laser. Wlej 300 mililitrów wody do 500-mililitrowej zlewki i podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez minutę. Następnie umieść gazę w ciepłej wodzie.Następnie umieść dwumiesięcznego samca myszy w uwięzi. Delikatnie wciśnij ciepłą gazę w ogon myszy i poszukaj rozszerzonych żył. Za pomocą igły o rozmiarze 26 wstrzyknąć odpowiednią ilość róży bengalskiej w zależności od wagi zwierzęcia i wywrzeć nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec krwiakowi lub krwawieniu przed wytarciem miejsca.Następnie uwolnij mysz z uwięzi i włóż ją z powrotem do klatki. Odczekaj osiem minut, aby róża bengalska zaczęła krążyć przed wstrzyknięciem środków znieczulających. Włącz podgrzewaną platformę myszy.Następnie dodaj po jednej kropli fenylefryny i tropikamidu do każdego oka myszy. Po potwierdzeniu znieczulenia dodaj jedną kroplę chlorowodorku proparakainy na oko, a następnie dodaj maść do oczu do obu oczu. Następnie wstrzyknij podskórnie 150 mikrolitrów karprofenu między uszy.Następnie umieść mysz na platformie i wyreguluj platformę, aż widok dna siatkówki będzie wyraźny i skoncentrowany. Policz żyły siatkówki i zrób zdjęcie dna oka. Następnie włącz laser i skieruj się w stronę żyły siatkówki w odległości około 375 mikrometrów od tarczy nerwu wzrokowego.Naświetlić naczynie, naciskając przełącznik nożny i lekko przesuwając wiązkę lasera do 100 mikrometrów. Powtórz ten krok trzy razy i przesuwaj wiązkę lasera po każdym impulsie, tak aby promieniowanie nie skupiało się w jednym punkcie. Powtórz napromienianie na innych głównych naczyniach, aby uzyskać dwie do trzech okluzji.Po napromienieniu naczyń należy wyłączyć lampę i odczekać 10 minut. Następnie ponownie włącz lampę, policz liczbę niedrożnych żył i zrób zdjęcie dna oka. Po uzyskaniu obrazu i wstrzyknięciu soli fizjologicznej dodaj nawilżające krople do oczu i żelową maść do obu oczu.Obserwuj, jak mysz dochodzi do siebie po znieczuleniu i wracaj do klatki z innymi zwierzętami tylko wtedy, gdy w pełni wyzdrowieje. Liczba okluzji uzyskanych bezpośrednio po napromieniowaniu laserowym nie różniła się między zwierzętami, które zostały poddane zabiegowi laserowemu 10 i 20 minut po podaniu różu bengalskiego. Liczba okluzji utrzymywanych do jednego dnia po zamknięciu żył siatkówki znacznie zmniejszyła się u zwierząt poddanych zabiegowi laserowemu 20 minut po podaniu róży bengalskiej, niezależnie od genotypu.Bez modyfikacji eksperymentalnej mocy 100 miliwatów, niska podstawowa moc lasera wynosząca 11,5 miliwata spowodowała brak okluzji. Natomiast podstawowa moc lasera wynosząca 13,5 miliwata skutkowała udaną okluzją. Po fotokoagulacji laserowej występują cztery główne typy okluzji: naczynia całkowicie zamknięte, naczynia częściowo zdrożone, naczynia częściowo zreperfundowane i naczynia w pełni zreperperowane.Napromieniowane unaczynienie myszy z nokautem Casp9 indukowanych przez tamoksyfen komórek śródbłonka spędzało więcej czasu w stanach częściowo reperfuzyjnych i częściowo okluzyjnych niż myszy C57 Black 6, które spędzały więcej czasu w stanach całkowicie zamkniętych. Stan niedrożności naczyń zmienia się gwałtownie w ciągu pierwszych 10 minut po zaobserwowaniu fotokoagulacji laserowej i krwotoków w kształcie płomienia 24 godziny po urazie. Po niedrożności żyły siatkówki wystąpiły różne patologie okulistyczne.Poziom obrzęku siatkówki po zamknięciu żyły siatkówki można określić ilościowo w uszkodzonych oczach za pomocą obrazów optycznej koherentnej tomografii. Stan warstw neuronalnych można również określić, oceniając dezorganizację wewnętrznych warstw siatkówki. Przykład obrazu optycznej koherentnej tomografii z odpowiednimi etykietami dla każdej warstwy pokazano tutaj.Pomiar podstawowej mocy lasera jest ważny. Ten odczyt będzie miał ogromny wpływ na powodzenie okluzji i może być zoptymalizowany. Można wykonać dodatkowe metody, takie jak OCT, ERG i Optiger.Pomoże to w rozwiązaniu problemu wpływu uszkodzenia układu nerwowo-naczyniowego na integralność neuronów siatkówki i funkcję szlaku wzrokowego. Technika ta toruje drogę do badania szlaków molekularnych napędzających choroby nerwowo-naczyniowe, a dzięki śledzeniu poszczególnych zwierząt w czasie dostarcza danych, które można łatwiej przełożyć na choroby ludzkie.

optimization-retinal-vein-occlusion-mouse-model-to-limit

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Poznaj zoptymalizowany model niedrożności żyły siatkówki u myszy z wykorzystaniem róży bengalskiej i lasera. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne badanie mechanizmów uszkodzeń naczyniowych oraz rozwoju obrzęku w czasie rzeczywistym.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Przeglądaj więcej filmów