Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności
6 sierpnia 2021
Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.
Protokół stanowi model do badania mechanizmów uszkodzenia naczyń krwionośnych i późniejszego rozwoju obrzęku w sposób nieinwazyjny. Główną zaletą tej techniki jest to, że można śledzić uraz na żywo w czasie bez interwencji chirurgicznej. Daje to możliwość skuteczniejszego testowania zabiegów.
Nauczenie się, jak prawidłowo żyłkować ogon i prawidłowo umieścić zwierzę na platformie, może być trudne. W przypadku obu technik zalecam uzbroić się w cierpliwość i działać powoli. Aby rozpocząć, delikatnie obejmij się z światłowodowym i podłącz go do skrzynki sterowniczej lasera i adaptera laserowego mikroskopu do obrazowania siatkówki, a następnie włącz lampę mikroskopu do obrazowania siatkówki.
Włącz komputer i otwórz program do obrazowania. Umieść kawałek białego papieru przed okularem mikroskopu i wyreguluj balans bieli, klikając Dostosuj w programie do obrazowania. Włącz skrzynkę kontrolną lasera, przekręcając kluczyk i postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie skrzynki sterowniczej lasera.
Aby sprawdzić bazową moc lasera, ustaw skrzynkę kontrolną lasera na 50 miliwatów i 2 000 milisekund. Następnie włącz laser i umieść miernik mocy przed okularem. Naciśnij pedał przełącznika nożnego, aby aktywować laser, dążąc do tego, aby odczyt mocy lasera wynosił od 13 do 15 miliwatów.
Następnie, korzystając z ekranu skrzynki kontrolnej lasera, dostosuj eksperymentalną moc lasera do 100 miliwatów i 1 000 milisekund i wyłącz laser. Wlej 300 mililitrów wody do 500-mililitrowej zlewki i podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez minutę. Następnie umieść gazę w ciepłej wodzie.
Następnie umieść dwumiesięcznego samca myszy w uwięzi. Delikatnie wciśnij ciepłą gazę w ogon myszy i poszukaj rozszerzonych żył. Za pomocą igły o rozmiarze 26 wstrzyknąć odpowiednią ilość róży bengalskiej w zależności od wagi zwierzęcia i wywrzeć nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec krwiakowi lub krwawieniu przed wytarciem miejsca.
Następnie uwolnij mysz z uwięzi i włóż ją z powrotem do klatki. Odczekaj osiem minut, aby róża bengalska zaczęła krążyć przed wstrzyknięciem środków znieczulających. Włącz podgrzewaną platformę myszy.
Następnie dodaj po jednej kropli fenylefryny i tropikamidu do każdego oka myszy. Po potwierdzeniu znieczulenia dodaj jedną kroplę chlorowodorku proparakainy na oko, a następnie dodaj maść do oczu do obu oczu. Następnie wstrzyknij podskórnie 150 mikrolitrów karprofenu między uszy.
Następnie umieść mysz na platformie i wyreguluj platformę, aż widok dna siatkówki będzie wyraźny i skoncentrowany. Policz żyły siatkówki i zrób zdjęcie dna oka. Następnie włącz laser i skieruj się w stronę żyły siatkówki w odległości około 375 mikrometrów od tarczy nerwu wzrokowego.
Naświetlić naczynie, naciskając przełącznik nożny i lekko przesuwając wiązkę lasera do 100 mikrometrów. Powtórz ten krok trzy razy i przesuwaj wiązkę lasera po każdym impulsie, tak aby promieniowanie nie skupiało się w jednym punkcie. Powtórz napromienianie na innych głównych naczyniach, aby uzyskać dwie do trzech okluzji.
Po napromienieniu naczyń należy wyłączyć lampę i odczekać 10 minut. Następnie ponownie włącz lampę, policz liczbę niedrożnych żył i zrób zdjęcie dna oka. Po uzyskaniu obrazu i wstrzyknięciu soli fizjologicznej dodaj nawilżające krople do oczu i żelową maść do obu oczu.
Obserwuj, jak mysz dochodzi do siebie po znieczuleniu i wracaj do klatki z innymi zwierzętami tylko wtedy, gdy w pełni wyzdrowieje. Liczba okluzji uzyskanych bezpośrednio po napromieniowaniu laserowym nie różniła się między zwierzętami, które zostały poddane zabiegowi laserowemu 10 i 20 minut po podaniu różu bengalskiego. Liczba okluzji utrzymywanych do jednego dnia po zamknięciu żył siatkówki znacznie zmniejszyła się u zwierząt poddanych zabiegowi laserowemu 20 minut po podaniu róży bengalskiej, niezależnie od genotypu.
Bez modyfikacji eksperymentalnej mocy 100 miliwatów, niska podstawowa moc lasera wynosząca 11,5 miliwata spowodowała brak okluzji. Natomiast podstawowa moc lasera wynosząca 13,5 miliwata skutkowała udaną okluzją. Po fotokoagulacji laserowej występują cztery główne typy okluzji: naczynia całkowicie zamknięte, naczynia częściowo zdrożone, naczynia częściowo zreperfundowane i naczynia w pełni zreperperowane.
Napromieniowane unaczynienie myszy z nokautem Casp9 indukowanych przez tamoksyfen komórek śródbłonka spędzało więcej czasu w stanach częściowo reperfuzyjnych i częściowo okluzyjnych niż myszy C57 Black 6, które spędzały więcej czasu w stanach całkowicie zamkniętych. Stan niedrożności naczyń zmienia się gwałtownie w ciągu pierwszych 10 minut po zaobserwowaniu fotokoagulacji laserowej i krwotoków w kształcie płomienia 24 godziny po urazie. Po niedrożności żyły siatkówki wystąpiły różne patologie okulistyczne.
Poziom obrzęku siatkówki po zamknięciu żyły siatkówki można określić ilościowo w uszkodzonych oczach za pomocą obrazów optycznej koherentnej tomografii. Stan warstw neuronalnych można również określić, oceniając dezorganizację wewnętrznych warstw siatkówki. Przykład obrazu optycznej koherentnej tomografii z odpowiednimi etykietami dla każdej warstwy pokazano tutaj.
Pomiar podstawowej mocy lasera jest ważny. Ten odczyt będzie miał ogromny wpływ na powodzenie okluzji i może być zoptymalizowany. Można wykonać dodatkowe metody, takie jak OCT, ERG i Optiger.
Pomoże to w rozwiązaniu problemu wpływu uszkodzenia układu nerwowo-naczyniowego na integralność neuronów siatkówki i funkcję szlaku wzrokowego. Technika ta toruje drogę do badania szlaków molekularnych napędzających choroby nerwowo-naczyniowe, a dzięki śledzeniu poszczególnych zwierząt w czasie dostarcza danych, które można łatwiej przełożyć na choroby ludzkie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia zoptymalizowany protokół dla zakrzepicy żyły siatkówki z użyciem bromku róży i systemu mikroskopii siatkówki sterowanej laserem. Model umożliwia badanie mechanizmów uszkodzeń naczyń krwionośnych i rozwoju obrzęku w czasie rzeczywistym bez interwencji chirurgicznej, co pozwala na bardziej wydajne testowanie leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Neurobiologia
- Okulistyka
- Biologia naczyniowa
Wprowadzenie
- Modele zakrzepicy żyły siatkówki są ważne do badania uszkodzeń naczyniowych.
- Bromek róży służy jako kluczowy czynnik wzmacniający obrazowanie i skuteczność zakrzepicy.
- Metoda umożliwia obserwację uszkodzenia siatkówki i regeneracji na żywo.
- Podkreśla się poprawioną zdolność do kwantyfikacji reakcji siatkówki z wykorzystaniem technik takich jak tomografia spójności optycznej (OCT).
Cel badania
- Opracowanie odtwarzalnego modelu do badania uszkodzenia naczyń siatkówki.
- Pomiar i obserwacja zmian w stanie naczyń krwionośnych siatkówki po zakrzepicy wywołanej laserem.
- Poszerzenie wiedzy na temat wpływu urazów neurokrążeniowych na funkcję siatkówki.
Wykorzystane metody
- Główną platformą jest mikroskop siatkówki sterowany laserem.
- Model biologiczny składa się z genetycznie zmodyfikowanych myszy wykorzystywanych do oceny zakrzepic.
- Kluczowe etapy obejmują pozyskiwanie obrazów, ustawienia sterowania laserem i prawidłową obsługę bromku róży.
- Zauważono pomiary mocy lasera i odpowiedniego czasu po podaniu bromku róży.
- Określono protokoły znieczulenia i monitorowania powrotu do zdrowia w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt.
Główne wyniki
- Timing aplikacji lasera po dawkowaniu bromku róży wpływał na liczbę utrzymujących się zakrzepic.
- Obserwowano różne stany zakrzepicy, co dostarczyło ważnych spostrzeżeń dotyczących odpowiedzi krwotocznych po urazie.
- Zważono kluczowe zmiany molekularne, demonstrując skuteczność modelu do badania mechanizmów regeneracji naczyniowej.
- Obrazowanie OCT służyło do oceny obrzęku siatkówki i zniekształceń warstwy wewnętrznej.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów chorób neurokrążeniowych.
- Możliwość monitorowania zmian siatkówki w czasie pomoże w przełożeniu wyników na warunki u ludzi.
- Ogólnie rzecz biorąc, badanie pogłębia zrozumienie urazów naczyniowych i potencjału interwencji terapeutycznych w chorobach siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This optimized retinal vein occlusion model addresses variability in preclinical ophthalmology studies by standardizing critical procedural parameters. By controlling baseline laser output and post-dye administration timing, the method improves reproducibility of vascular injury induction across genetically diverse mouse strains. This supports more reliable evaluation of neurovascular therapeutics targeting retinal edema and hypoxic-ischemic injury mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular injury pathways in retinal disease models with controlled occlusion consistency.
- Operational Value: Reduces experimental noise from variable laser timing and power settings, improving assay sensitivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized vascular injury model for evaluating compound effects on retinal edema and reperfusion dynamics.
- Operational Value: Supports reproducible endpoint measurement via optical coherence tomography for quantitative screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models neurovascular injury progression including hemorrhage and neuronal layer disorganization relevant to human retinal pathologies.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of vascular repair mechanisms in the same animal over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing by providing a quantifiable model of retinal vascular injury.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular drivers in vascular leakage and inflammatory responses post-occlusion.
- Screening: Enables standardized assessment of therapeutic candidates on occlusion persistence and edema reduction.
- Analytics: Generates quantitative OCT-derived metrics on retinal thickness and layer integrity for comparative analysis.
- Translational Research: Models human-relevant neurovascular injury phenotypes including flame-shaped hemorrhages and inner retinal disruption.
- Enterprise Reuse: Adaptable across mouse strains and genetic backgrounds for consistent target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing biological variability in injury models.
- Operational Value: Standardizes laser and dye timing parameters to enhance inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision reliability by minimizing false negatives from inconsistent model penetrance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurovascular candidates based on reproducible edema and reperfusion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical tail vein injection and retinal imaging microscopy.
- Dependent on calibrated laser systems with adjustable baseline and experimental power settings.
- Necessitates standardized animal handling and anesthesia protocols to minimize physiological confounders.
- Must account for strain-specific vascular responses when comparing occlusion durability across genotypes.
- Limited by the learning curve in achieving consistent venous cannulation and laser targeting precision.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Laser Setup
2:05
Mouse Tail Vein Injection of Rose Bengal
2:54
Occlusion of Major Veins
4:07
Establishing the Number of Veins Occluded at Day 0 and Aftercare
4:40
Results: Analysis of Types and Timelines of Photo-Occlusion, Baseline and Experimental Laser Output Measurement, Ophthalmic Pathologies, and Quantification of OCT Images
6:37
Conclusion
