Name: Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj protokół wytwarzania organoidów mózgowych z iPSC przy użyciu domowych mini bioreaktorów. Ta metoda umożliwia uzyskanie dużych ilości wysokiej jakości organoidów do modelowania chorób OUN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant 075-15-2019-1669 z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (analiza RT-PCR) oraz przez grant nr 19-15-00425 z Rosyjskiej Fundacji Naukowej (na wszystkie inne prace). Autorzy dziękują również Pavlowi Belikovowi za pomoc w montażu wideo. Figury w rękopisie zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

UWAGA : Używaj sterylnej techniki w całym protokole, z wyjątkiem kroków 1.2 i 1.3. Podgrzać wszystkie pożywki i roztwory do 37 °C przed zastosowaniem na komórkach lub organoidach. Hodować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy wilgotności 80%. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Przekształcanie szalek Petriego w mini bioreaktory
<ol>
	<li>Pociąć sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml w pierścienie o wysokości 7-8 mm; umieścić je w autoklawie.</li>
	<li>Rozbij szalki Petriego o niskiej przyczepności, niepoddane obróbce lub mikrobiologiczne na okruchy. Rozpuść około 1 g okruchów plastiku w 10 ml chloroformu przez noc, aby przygotować płynny plastik. 
	UWAGA: Pracować w dygestorium.</li>
	<li>Sprawdź, czy powstały w ten sposób płynny plastik jest wystarczająco lepki do pipetowania; jego kropla zachowuje kulistą formę i nie rozprzestrzenia się po powierzchni. Jeśli jest bardzo płynny, dodaj więcej okruchów plastiku. Jeśli jest gęsty, dodaj chloroform.</li>
	<li>Zrób plastikową gałkę na środku sterylnej 6-centymetrowej szalki Petriego o bardzo niskiej przyczepności. Istnieją dwa równie odpowiednie sposoby, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Umieść autoklawowany plastikowy pierścień na środku i upuść płynny plastik do wnętrza pierścienia.</li>
		<li>Bez żadnego plastikowego pierścienia upuść płynny plastik na środek szalki Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw naczynia otwarte na 2-3 godziny w okapie z przepływem laminarnym, aż do całkowitego wyschnięcia. Suszone naczynia należy traktować promieniowaniem ultrafioletowym przez 15-20 minut.</li>
</ol>
2. Indukcja różnicowania neuronalnego iPSC
<ol>
	<li>Hoduj iPSC w pożywce dla pluripotencjalnych komórek macierzystych do 75-90% konfluencji na 35-milimetrowych szalkach Petriego, wstępnie pokrytych macierzą składającą się z białek zewnątrzkomórkowych.</li>
	<li>Przygotować podłoże A-SR. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1.</li>
	<li>Odessać podłoże hodowlane i dodać 2 ml pożywki A-SR w dniu 0 różnicowania.</li>
	<li>Przygotować podłoże A (patrz Tabela 2).</li>
	<li>Hoduj komórki w pożywce A przez dwa tygodnie od 2 do 14 dni, odświeżając podłoże na szalkach Petriego co drugi dzień.</li>
</ol>
3. Tworzenie sferoid z neuroepitelialnych komórek prekursorowych w dniu 14
<ol>
	<li>W dniu 14 wykonaj sferoidy z neuroepitelialnych komórek prekursorowych, używając specjalnej 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej około 1200 mikrodołków w każdym dołku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C). Postępuj zgodnie z procedurą podaną poniżej. 
	UWAGA: Na tym etapie różnicowania szalka Petriego o średnicy 35 mm zwykle zawiera 3 - 3,5 x 106 neuroepitelialnych komórek prekursorowych. Tak więc jedna szalka Petriego o średnicy 35 mm z neuronapicelialnymi komórkami prekursorowymi wystarcza na 3 - 4 dołki 24-dołkowej płytki hodowlanej z mikrodołkami.</li>
	<li>Przygotuj 24-dołkową płytkę hodowlaną z mikrostudzienkami: Do każdej studzienki dodaj 1 ml pożywki A. Krótko odwirować przy 1,300 x g przez 5 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyt na płytkę. Sprawdź, pod mikroskopem, czy w mikrostudzienkach nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Przygotuj podłoże B (Tabela 3).</li>
	<li>Usunąć pożywkę z płytki Petriego z komórkami prekursorowymi nabłonka nerwowego; przemyć komórki 2 ml DMEM/F12. W celu oderwania komórek potraktuj komórki 1,5 ml 0,48 mM roztworu EDTA przygotowanego w PBS. Kontroluj oderwanie komórek pod mikroskopem.</li>
	<li>Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml DMEM/F12 do probówki, aby umyć komórki. Wirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki B.</li>
	<li>Sprawdź stężenie i żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometrem. Obliczyć objętość zawiesiny potrzebną do zawarcia łącznie 1 x 106 żywotnych komórek.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek zawierającą 1 x 106 komórek do każdej studzienki 24-dołkowej płytki z mikrodołkami. Dodaj pożywkę B do 2 ml do każdej studzienki, delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół kilka razy i krótko odwiruj 100 x g przez 1 minutę, aby uchwycić komórki w mikrostudzienkach. 
	UWAGA: Liczba komórek w studzience nie powinna przekraczać 1 x 106. W przeciwnym razie sferoidy z sąsiednich mikrostudzienek łączą się.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są równomiernie rozmieszczone w mikrostudzienkach. Powtórzyć pipetowanie i odwirowanie, jeśli komórki są rozmieszczone nierównomiernie.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez noc, aby komórki mogły się zagregować w sferoidy.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie i uprawa organoidów
<ol>
	<li>Następnego ranka (dzień 15) sprawdź jakość sferoid pod mikroskopem. Upewnij się, że są przezroczyste i gładkie, jeśli są zdrowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). Ostrożnie zbierz sferoidy z każdej studzienki do probówki o pojemności 15 ml, pozostaw sferoidy do wytrącenia się grawitacyjnie na 2-3 minuty, a następnie usuń supernatant.</li>
	<li>Dodać do sferoid 2 ml matrycy rozmrożonej w tym samym czasie na lodzie. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Aby zmyć nadmiar matrycy, dodać do probówki 8 ml pożywki B. Delikatnie odpipetować, a następnie odwirować probówkę przez 1 minutę przy 100 x g. 
	UWAGA: Nie należy przekraczać czasu i prędkości wirowania, aby uniknąć nieodwracalnej agregacji sferoid.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Dodać do probówki 2 ml pożywki B, delikatnie odpipetować. Podziel zawiesinę sferoidalną na dwa mini bioreaktory, z których każdy zawiera 4 ml pożywki B. Umieść mini bioreaktory na 15-centymetrowej szalce Petriego, aby zapobiec parowaniu wody i uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego z mini bioreaktorami na wytrząsarce orbitalnej. Uprawiaj organoidy z prędkością obrotową 70-75 obr./min.</li>
	<li>W dniu 16 przygotować pożywkę C (Tabela 4).</li>
	<li>Przenieść organoidy do probówki o pojemności 15 ml. Przez 5 minut pozwól im opaść na dno, odessać supernatant, dodać 5 ml pożywki C. Włóż organoidy z powrotem do mini bioreaktorów. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie zgubić sferoid, które są przezroczyste i ledwo widoczne.</li>
	<li>Kuluj sferoidy w podłożu C przez dwa tygodnie, odświeżając podłoże co dwa dni. Pod koniec tych dwóch tygodni pozostaw około 100 sferoid na mini bioreaktor do następnej uprawy. Zamrozić nadmiar sferoid w podłożu zamrażającym w ciekłym azocie.</li>
	<li>W 30 dniu przygotować pożywkę D (Tabela 5).</li>
	<li>Zmień podłoże uprawowe na podłoże D, które jest podłożem do dojrzewania. Odświeżaj podłoże uprawowe co 2-3 dni przez trzy tygodnie, a następnie użyj podłoża D bez BDNF i GDNF.</li>
</ol>

<ol><li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside+out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).</li>
<li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li>
<li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li>
<li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li>
<li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li>
<li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li>
<li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li>
<li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+Is+the+mother+of+invention%E2%80%9D+or+inexpensive%2C+reliable%2C+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region%E2%80%93specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li>
<li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li>
<li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned%2C+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820(2021).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids%E2%80%94challenges+to+establish+a+brain+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790(2021).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół składa się z dwóch kluczowych etapów, które pozwalają na wygenerowanie wysokiej jakości organoidów o jednolitej wielkości. Po pierwsze, organoidy wyrastają ze sferoidów, które są prawie identyczne pod względem liczby komórek i dojrzałości komórek. Po drugie, domowe bioreaktory zapewniają każdemu organoidowi jednolite środowisko, w którym organoidy nie tłoczą się ani nie sklejają ze sobą.
Jakość komórki i stan dojrzewania komórki są niezbędne do wykonania protokołu. Bardzo ważn...

Modele pochodzące z ludzkiego iPSC są szeroko stosowane w badaniach nad zaburzeniami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi1. W ciągu ostatniej dekady trójwymiarowe modele tkanki mózgowej, tak zwane organoidy mózgowe, zasadniczo uzupełniały tradycyjne hodowle neuronów 2D2. Organoidy do pewnego stopnia podsumowują architekturę 3D embrionalnego mózgu i umożliwiają bardziej precyzyjne modelowanie. Opublikowano wiele protokołów generowania organoidów reprezentujących różne obszary mózgu: kora mózgowa3,4,5, móżdżek6, śródmózgowie, przodomózgowie, podwzgórze7,8,9, oraz hippocampus10. Istnieje wiele przykładów wykorzystania organoidów do badania chorób ludzkiego układu nerwowego11. Ponadto organoidy zostały zaimplementowane w odkrywaniu leków12 i wykorzystane w badaniach chorób zakaźnych, w tym SARS-Cov-213,14.
Organoidy mózgowe mogą osiągać do kilku milimetrów średnicy. Tak więc wewnętrzna strefa organoidu może cierpieć z powodu niedotlenienia lub niedożywienia i ostatecznie stać się martwicza. Dlatego wiele protokołów zawiera specjalne bioreaktory8, shakery lub systemy mikroprzepływowe15. Urządzenia te mogą wymagać dużych ilości drogich pożywek do hodowli komórkowych. Ponadto koszt takiego sprzętu jest zwykle wysoki. Niektóre bioreaktory składają się z wielu części mechanicznych, co utrudnia ich sterylizację w celu ponownego użycia.
Większość protokołów cierpi na "efekt wsadowy"16, co generuje znaczną zmienność wśród organoidów uzyskanych z identycznych iPSC. Ta zmienność utrudnia testowanie leków lub badania przedkliniczne wymagające jednolitości. Wysoka wydajność organoidów wystarczająca do wyselekcjonowania organoidów o jednolitej wielkości może częściowo rozwiązać ten problem.
Czynnikiem czasu jest również istotny problem. Matsui i in. (2018) wykazali, że organoidy mózgowe potrzebują co najmniej sześciu miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość17. Trujillo i in. (2019) wykazali również, że aktywność elektrofizjologiczna występuje w organoidach dopiero po sześciu miesiącach uprawy18. Ze względu na długi czas dojrzewania organoidów, naukowcy często wprowadzają nowe różnicowanie przed zakończeniem poprzedniego. Wiele równoległych procesów różnicowania wymaga dodatkowych wydatków, sprzętu i przestrzeni laboratoryjnej.
Niedawno opracowaliśmy mini bioreaktor, który głównie rozwiązuje wyżej wymienione problemy19. Ten domowy bioreaktor składa się z szalki Petriego o bardzo niskiej przyczepności lub nieobrobionej z plastikowym pokrętłem pośrodku. To plastikowe pokrętło zapobiega stłoczeniu organoidów i ich sklejaniu się w środku szalki Petriego, co jest spowodowane obracaniem się shakera. W artykule opisano, w jaki sposób ten niedrogi i prosty mini bioreaktor domowej roboty umożliwia generowanie wysokiej jakości organoidów mózgowych w dużych ilościach.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>24-dołkowa płytka hodowlana z mikrodołkami</td></tr><tr><td>Suplement B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Suplement neuronalny B</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200 mM L-alanylo-L-glutamina</td></tr><tr><td>Ludzki BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki FGF-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy KnockOut</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>Zamiennik surowicy</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>Pliripotencjalne podłoże z komórek macierzystych</td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Podstawowa pożywka do utrzymania komórek nerwowych</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Środki przeciwdrobnoustrojowe</td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>EMD Millipore</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS Dorsomorphin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-466</td><td>Dorsomorphin</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS</td><td>SB431542 Miltenyi Biotec</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versen roztwór</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td>0,48 mM EDTA w PBS</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanolu</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Organoid mózgowy pochodzący z iPSC jest obiecującą technologią do modelowania in vitro patologii układu nerwowego i badań przesiewowych leków. Ta technologia pojawiła się niedawno. Jest wciąż w powijakach i ma pewne ograniczenia, które nie zostały jeszcze rozwiązane. Obecne protokoły nie pozwalają na uzyskanie organoidów wystarczająco spójnych dla odkrywania leków i badań przedklinicznych. Dojrzewanie organoidów może trwać nawet rok, co zmusza naukowców do uruchomienia wielu procesów różnicowania jednocześnie. Nakłada to na laboratorium dodatkowe koszty w zakresie powierzchni i wyposażenia. Ponadto organoidy mózgowe często mają w środku strefę martwiczą, która cierpi z powodu niedoboru składników odżywczych i tlenu. W związku z tym większość obecnych protokołów wykorzystuje system krążenia pożywki hodowlanej w celu poprawy odżywiania.
Tymczasem, nie ma tanich systemów dynamicznych ani bioreaktorów do hodowli organoidów. W artykule opisano protokół produkcji organoidów mózgowych w kompaktowych i niedrogich mini bioreaktorach domowej roboty. Protokół ten pozwala na uzyskanie wysokiej jakości organoidów w dużych ilościach.

Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmował pięć pośrodków, w których iPSC różnicowały się w organoidy mózgu przez co najmniej miesiąc. Różnicowanie rozpoczęto, gdy iPSC osiągnęły 75-90% konfluencji (Rysunek 2A,B). Pierwsze oznaki różnicowania w kierunku neuronów zaobserwowano w 10-11 dniu hodowli iPSC w pośrodku A, gdy komórki zaczęły skupiać się w tzw. „rozetki” (Rysunek 2C). W dniach 14-15 iP...

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Do tej pory organoidy mózgowe różnicowane z pluripotencjalnych komórek macierzystych są modelem 3D in vitro najbardziej zbliżonym do rodzimej ludzkiej tkanki mózgowej. Ponadto organoidy mózgowe nadają się równie dobrze do modelowania różnych patologii ośrodkowego układu nerwowego, testowania substancji farmakologicznie czynnych, a także do stosowania w medycynie regeneracyjnej. Tymczasem technologia ta jest wciąż w początkowej fazie rozwoju.Protokół można podzielić na dwie grupy w zależności od sposobu pozyskiwania kruszyw oraz dalszej uprawy ze zróżnicowaniem. Pierwszy z nich obejmuje protokół i schematy różnicowania, różniące się czasem uprawy i induktorami różnicowania z późniejszym dojrzewaniem organoidów w wytrząsarce w specjalnych urządzeniach o niskiej przyczepności, takich jak rurki lub płytki rynkowe. Kolejną grupą jest użycie specjalnych bioreaktorów.Analiza różnych protokołów wykazała, że organoidy powinny być hodowane w warunkach z krążącą pożywką. Jednak brak prostych i niedrogich systemów do uzyskiwania organoidów o standardowym rozmiarze i morfologii wymaga opracowania takich urządzeń do skalowania procesu. W niniejszej pracy opisujemy naszą metodę pozyskiwania i testowania prostych i niedrogich mini bioreaktorów, które umożliwiają uzyskanie dużych ilości wysokiej jakości organoidów.Pokrój sterylne 15-mililitrowe probówki wirówkowe na pierścienie o wysokości 7 lub 8 milimetrów. Autoklaw pierścieni. Rozbij niskie skupiska na poddanych działaniu środka lub mikrobiologicznych szalkach Petriego na okruchy.Rozpuść około 1 grama okruchów plastiku w 10 mililitrach chloroformu przez noc, aby przygotować płynny plastik. Zrób plastikową gałkę na środku sterylnej 6-centymetrowej szalki Petriego o bardzo niskiej przyczepności. Istnieją dwa równie odpowiednie sposoby.Po pierwsze, umieść autoklaw w plastikowym pierścieniu na środku i nałóż pół mililitra płynnego plastiku do wnętrza pierścienia. Drugi, bez żadnych plastikowych pierścieni, upuść pół mililitra płynnego plastiku na środek szalki Petriego. Pozostaw naczynia otwarte na 2 lub 3 godziny w okapie z przepływem laminarnym, aż do całkowitego wyschnięcia.Hoduj indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w pożywce dla pluripotencjalnych komórek macierzystych, do 75 lub 90% konfluencji na 35-milimetrowych szalkach Petriego, wstępnie pokrytych matrycą rozpuszczoną w zimnym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle i pożywce Fisher-12. Przygotować podłoże A plus zamiennik surowicy. Hoduj indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przez 1 dzień w pożywce z wymianą surowicy.Zmienić pożywkę dla pluripotencjalnych komórek macierzystych na pożywkę zastępczą dla surowicy w dniu zero różnicowania. Przygotować pożywkę A.Zmienić pożywkę na pożywkę A w 2. dniu różnicowania. Hoduj komórki w podłożu A przez 2 tygodnie, odświeżając podłoże na szalkach Petriego co 2 dni.W dniu 14 rozpocznij tworzenie sferoidy za pomocą specjalnej 24-dołkowej płytki hodowlanej, która zawiera około 1 200 mikrodołków w każdym dołku. Przygotuj 24-dołkową płytkę hodowlaną z mikrodołkami. Dodać do każdej studzienki 1 mililitr pożywki A, krótko odwirować przy 1,300 g przez 5 minut w wirniku z wahliwym wiadrem wyposażonym w uchwyt na płytkę.Sprawdź, pod mikroskopem, czy w mikrostudzienkach nie ma pęcherzyków. Przygotuj podłoże B.Usuń podłoże z szalki Petriego. W celu oderwania komórek potraktuj komórki 1,5 mililitra roztworu EDTA przygotowanego na PBS.Kontroluj oderwanie komórek pod mikroskopem. Zbierz komórkę do 15-mililitrowej tuby. Dodaj 5 mililitrów zmieszanej pożywki Dulbecco i Fisher do probówki w kierunku komórek.Wirować przy 200 g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 mililitrach pożywki B. Przenieść zawiesinę komórek zawierającą 1 miliard komórek do każdej studzienki 24-dołkowej płytki z mikrodołkami. Delikatnie pipetować komórki w górę i w dół kilka razy i krótko odwirować 100 g przez 1 minutę, aby uchwycić komórki w mikrostudzienkach.Kontroluj pod mikroskopem, czy ogniwa są równomiernie rozmieszczone w mikrostudzienkach. Inkubować płytkę przez noc w celu agregacji komórek w sferoidach. Następnego ranka, 15 dnia, sprawdź pod mikroskopem jakość sferoid, które są przezroczyste i gładkie, jeśli są zdrowe.Ostrożnie zbierz sferoidy z każdej studzienki do 15-mililitrowej probówki, pozostaw sferoidy do wytrącenia grawitacyjnego przez 2 i 3 minuty, a następnie usuń supernatant. Dodać do sferoid 2 mililitry matrycy, rozmrożonej i ex tempore na lodzie. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Aby zmyć nadmiar matrycy, dodać do probówki 8 mililitrów pożywki B. Delikatnie odpipetować, a następnie odwirować probówkę przez 1 minutę przy 100 g. Usunąć supernatant. Dodać do probówki 20 mililitrów pożywki B, delikatnie pipetować, a następnie podzielić zawiesinę sferoidalną między mini bioreaktory.Następnie umieść mini bioreaktory na 15-centymetrowej szalce Petriego, która zapobiega parowaniu wody i zanieczyszczeniom. Umieść szalkę Petriego z mini bioreaktorami na wytrząsarce orbitalnej. Uprawiaj organoidy z prędkością rotacji 70, 75 obr./min.W dniu 16 przygotuj pożywkę C. Przenieś organoid do 50 mililitrowej probówki. Przez 5 minut pozwól im opaść na dno. Odessać supernatant i dodać 5 mililitrów pożywki C. Ponownie połączyć organoidy w mini bioreaktorach.Kuloidy uprawiać w podłożu C przez 2 tygodnie, odświeżając podłoże co 2 dni. W ciągu tych 2 tygodni wybierz około 100 sferoid na mini bioreaktory do następnej uprawy. W 30 dniu przygotuj podłoże D. Zmień podłoże uprawowe na podłoże D, które jest podłożem do dojrzewania.Odświeżaj podłoże uprawowe co 2 lub 3 dni przez 3 tygodnie. Następnie użyj pożywki D rozpuszczonej w F i GDNF. Po 1 miesiącu nieprzerwanej uprawy na podłożu A i B uzyskuje się organoidy standaryzowane pod względem wielkości i morfologii.W miarę wzrostu muszą częściej zmieniać podłoże, zwiększa się również do 4 razy w tygodniu. Po 2 miesiącach uprawy osiągają średnicę 4 i 5 milimetrów. A po kolejnym miesiącu, 5 i 6 milimetrach i wzrost ustaje.Rysunek przedstawia wygląd enzymu organoidowego, przezroczyste skrawki pomalowane hematoksyliną i eozyną. Analiza immunohistochemiczna przez 1 miesiąc wykazuje obecność skupisk SOX2 dodatnich komórek progenitorowych, w tym wewnątrz części centralnej. Na obrzeżach organoidów kwaśne białko fibrylarne glejowe, białko związane z mikrotubulami 2 i dodatnia hydrolaza tiazynowa.Komórki są skoncentrowane, co odpowiada dojrzałej formie neuronów. W niektórych przypadkach skupiska bieli na obszarze nekrotycznym tworzą się w centralnej części. Wskazuje to na ograniczenie tego protokołu w celu uzyskania większych organoidów.Najprawdopodobniej czynnikiem ograniczającym wzrost jest szybkość dyfuzji składników odżywczych i tlenu. Różne podłoża i typy komórek sferoidów oraz testowanie naszego systemu pod kątem niektórych rodzajów organoidów. Dużo mózgu i siatkówki, połączone organoidy z komórek raka wątroby i mezenchymalnych komórek macierzystych, połączone organoidy z mezenchymalnych wezwań macierzystych przez kapitał blast oraz różnicowanie hematopoetycznych komórek macierzystych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i organoidów jelitowych.Czy był zmienny w początkowym składzie komórek? Czynniki różnicujące, hodowla i pożywka, macierz zewnątrzkomórkowa, a być może także skład mieszaniny gazów, szybkość obrotu platformy i inne parametry. Możliwe będzie uzyskanie organoidu o tym samym kształcie, wielkości lub modelu morfologii w różnych narządach i tkankach.Zastosowanie mini bioreaktorów zaproponowanych w tej pracy.

brain-organoid-generation-from-induced-pluripotent-stem-cells-home

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę generowania organoidów ludzkiego mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pokazuje, w jaki sposób neurosfera tworzy warstwę neuroektodermalną, która hamuje tworzenie się innych listków zarodkowych. Neurosfery są osadzone w matrycy żelowej 3D i tworzą zawiązki neuronabłonkowe. Podczas inkubacji z pożywkami organoidowymi te pąki neuroepitelialne różnicują się w określone obszary mózgu, co powoduje tworzenie dojrzałych organoidów mózgowych.

Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film demonstruje technikę generowania dojrzałych organoidów móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą jednorazowego bioreaktora 3D. Bioreaktor ułatwia tworzenie agregatów iPSC, które następnie poddawane są działaniu szeregu pożywek hodowlanych wzbogaconych w czynniki wzrostu i chemokiny, które indukują różnicowanie agregatów iPSC w dojrzałe organoidy móżdżku. Następnie organoidy są zbierane i kriokonserwowane do dalszej analizy.

Wytwarzanie dojrzałych organoidów móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu bioreaktorów jednorazowego użytku

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół wytwarzania organoidów mózgowych z iPSC przy użyciu domowych mini bioreaktorów. Ta metoda umożliwia uzyskanie dużych ilości wysokiej jakości organoidów do modelowania chorób OUN.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

Przeglądaj więcej filmów