Name: Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę oceny produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu izotopowego znacznika glukozy i GCMS. Technika ta pozwala dokładnie zmierzyć metabolizm glukozy w różnych stanach metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty szkoleniowe z Departamentu Położnictwa i Ginekologii, Baylor College of Medicine (ALG) oraz grant badawczy R-01 (Grant # DK114689) dla CSB, SC i JM z National Institutes of Health.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Baylor College of Medicine.
1. Przygotowanie [6,6-2 H 2]glukozy
<ol>
	<li>Na dzień przed zabiegiem należy przygotować znacznik glukozy ze stabilnego izotopu w soli fizjologicznej. W tym eksperymencie [6,6-2 H2] glukoza została użyta jako znacznik do pomiaru wskaźnika pojawiania się glukozy w osoczu. 
	UWAGA: W tym eksperymencie mierzono produkcję glukozy na czczo i w warunkach bogatych w glukozę, więc izotop glukozy przygotowano w dwóch różnych preparatach. Przygotować roztwory w taki sposób, aby końcowa dawka do infuzji była bliska odpowiednio 1 mg/(kg·min) i 2 mg/(kg·min). Stężenia te zostały zoptymalizowane w kilku wcześniejszych badaniach pilotażowych.</li>
	<li>Przygotować pierwszy zaparz z samą glukozą [6,6-2 H2] jako znacznikiem reprezentującym stan na czczo poprzez rozpuszczenie sterylnej i wolnej od pirogenów [6,6-2 H2] glukozy w sterylnym 0,9% roztworze chlorku sodu.</li>
	<li>Przygotuj drugi infuzyjny napar, rozpuszczając zarówno znacznik glukozy [6,6-2 H2] wraz z nieizotopową glukozą (~20 mg/kg·min) w sterylnym 0,9% roztworze chlorku sodu, aby symulować stan karmienia. 
	UWAGA: W niniejszym eksperymencie zastosowano infuzję [6,6-2 H2] glukozy o stałej szybkości w (~) 1,08 mg/(kg·min) (stan na czczo) i (~) 1,9 mg/kg·min (stan bogaty w glukozę). Aby naśladować "stan bogaty w glukozę", szybkość infuzji D-glukozy ustalono na (~) 18,8 mg/(kg·min).</li>
	<li>Po przygotowaniu roztworów sterylnie przefiltrować roztwory filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed infuzją podgrzać roztwory do temperatury pokojowej. Załaduj roztwory do wstępnie oznakowanych strzykawek o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Ustawić pompę w taki sposób, aby ułatwić infuzję pierwszego wlewu o stałej szybkości (w stanie podstawowym) zawierającego tylko znacznik, a następnie zaprogramować pompę na infuzję izotopu ze stałą szybkością w dawce 150 μl/h przez 3 godziny.</li>
	<li>Pod koniec 3-godzinnego okresu na czczo wymienić pierwszą strzykawkę z infuzją na drugą strzykawkę infuzyjną zawierającą znacznik izotopowy i D-glukozę (dla symulowanego stanu karmienia) i przygotować infuzję na początkowe 15 minut w dawce 600 μl/h. Ustawić pompę na infuzję ze stałą szybkością 150 μl/h przez dodatkowe 3 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentów infuzyjnych
<ol>
	<li>Wyjmij myszy z ich domowych klatek i umieść je w klatkach na czczo na 3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. W tym eksperymencie wykorzystano 4-miesięczne samice myszy ze szczepu C57BL/6J. 
	UWAGA: Ta procedura nie wymaga znieczulenia przed lub w trakcie zabiegu ze względu na jej minimalnie inwazyjny charakter.</li>
	<li>Zmontuj sprzęt do trzymania w klatkach, grupując myszy w określoną liczbę myszy na pompę insulinową. Umieść ścianki działowe na płaskiej, stabilnej podstawie, aby zrobić indywidualne boksy dla myszy. Ważne jest, aby mieć dostęp do cewnika do żyły ogonowej, aby infuzja mogła przebiegać, dlatego upewnij się, że w dolnej części drzwi klatki znajduje się wcięcie. 
	UWAGA: Klatki pokazane na filmie zostały wykonane specjalnie na potrzeby tego eksperymentu. Klatki są przezroczyste i wykonane z pleksi. Istnieje płaska, stabilna podstawa (standardowe wyposażenie klatkowe), na której znajdują się przegrody. Ta konfiguracja składa się z kilku elementów, aby umożliwić łatwą konfigurację w kilku różnych środowiskach, w zależności od wysokości stołu i potrzeb eksperymentatora. Drzwi do klatki przesuwają się, aby się zamknąć i mają wycięcie na dole, aby umożliwić zmieszczenie ogona.</li>
	<li>Zmontować strzykawki o pojemności 1 ml zawierające 1 ml infuzji podstawowej, a następnie podłączyć do rurki pompy infuzyjnej za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 0,28 mm x 0,61 mm.</li>
	<li>Przygotować pompę infuzyjną, ustawiając dawkę na 150 μl/h, która jest dawką podstawową.</li>
	<li>Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 48 °C.</li>
	<li>Przygotuj stację wprowadzania cewnika przylegającą do łaźni wodnej zawierającą igły 30 G 0,5 cala, rurkę silastyczną 0,3 mm ID x 0,64 mm i przezroczystą taśmę transporową o średnicy 1 cala.</li>
	<li>Po 3 godzinach postu rozpocznij proces wprowadzania cewnika, który jest szczegółowo opisany poniżej.</li>
</ol>
3. Wprowadzenie cewnika
<ol>
	<li>Wybierz jedną mysz i umieść ją w bezpiecznym uchwycie z dostępem do ogona. Przykładem tego, czego użyć, jest butelka przecięta na pół z wycięciem na ogon. Umieść uchwyt na płaskiej podstawie. Umieść kawałek taśmy na bliższej części ogona, aby zapewnić miejsce na wprowadzenie cewnika bardziej dystalnie. 
	UWAGA: Rodzaj taśmy wybrany do tego zadania musi mieć umiarkowaną wytrzymałość i przyczepność. W tym eksperymencie użyto uniwersalnej, papierowej taśmy do etykietowania, ponieważ jest łagodna i łatwa do odklejenia.</li>
	<li>Przygotuj cewnik (igła 30 G przymocowana do rurki silastycznej 0,3 mm, a PE-10 był sterylizowany gazem), podłączając go do strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej sterylne płukanie solą fizjologiczną w heparynizacji. Delikatnie przepłukać cewnik.</li>
	<li>Przynieś mysz do łaźni wodnej i włóż ogon do łaźni wodnej na około 30-45 s. Pomaga to rozszerzyć unaczynienie ogona w celu umieszczenia cewnika.</li>
	<li>Wprowadzenie cewnika należy wykonać w sterylnych warunkach. Po ogrzaniu ogona oczyść go chusteczkami benzalkoniowymi i umieść mały miedziany, bezzębny zacisk aligatora, który został wcześniej wyprofilowany do kształtu ogona, jako opaskę uciskową na bliższym końcu ogona. Wizualizuj boczną żyłę ogonową pod szkłem powiększającym, a następnie ostrożnie włóż cewnik do żyły ogonowej i wyjmij igłę. Delikatnie przepłukać roztwór, aby zapewnić drożność cewnika.</li>
	<li>Owiń kawałek 1-calowej taśmy transpore wokół miejsca wprowadzenia, aby zabezpieczyć cewnik. Zdejmij małą opaskę uciskową z ogona.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do infuzji i pierwsza infuzja
<ol>
	<li>Umieść mysz w indywidualnej klatce i zamknij drzwi przesuwne, upewniając się, że ogon wystaje przez wycięcie i pozostaje na zewnątrz klatki.</li>
	<li>Umieść dodatkowy kawałek taśmy na całym cewniku i ogonie, aby przymocować go do płyty podstawy klatki. Do tego kroku użyto uniwersalnej kolorowej taśmy etykietowej.</li>
	<li>Odłącz płukanie od cewnika do żyły ogonowej i umieść mały zacisk na rurki silastycznej cewnika, aby zapobiec przepływowi wstecznemu podczas podłączania przewodu infuzyjnego od pompy.</li>
	<li>Po bezpiecznym połączeniu zdjąć zacisk i przepłukać roztworem gruntującym, który składa się z infuzji. Upewnij się, że roztwór jest przezroczysty w rurce i nie jest zabarwiony krwią.</li>
	<li>Należy zanotować czas rozpoczęcia infuzji, aby upewnić się, że trwa ona przez łączny czas około 3 godzin. Jeśli jednocześnie używanych jest wiele klatek, należy je rozłożyć w czasie, aby skutecznie zarządzać czasem infuzji.</li>
	<li>Po stwierdzeniu, że linie infuzyjne działają prawidłowo, zdejmij osłonę z myszy. Umieść standardową ściółkę wokół myszy.</li>
	<li>Infuzję należy rozpocząć od pierwszego infuzji zawierającej znacznik i uruchamiać ją w sposób ciągły przez 3 godziny. Przez cały czas trwania infuzji należy nadal sprawdzać samopoczucie myszy, a także linie infuzyjne. Upewnij się, że przewód infuzyjny jest odpowiednio zabezpieczony i że nie ma wycieków z punktów podłączenia przewodów.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Po zakończeniu pierwszej infuzji należy przerwać infuzję, założyć zacisk na rurkę sylastyczną na cewniku, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. Delikatnie wyjmij myszy z ich pomieszczeń, nie naruszając cewnika, w celu pobrania krwi. Umieść je w miejscu w pobliżu klatek do pobrania krwi. W tym eksperymencie myszy przeszły nakłucie żyły policzków za pomocą lancetu o średnicy 4 mm.</li>
	<li>Zbierz ~75 μL krwi do żądanej fiolki. Aby odbiałościć próbki w ramach przygotowań do spektrometrii mas, dodać około 15 μl krwi do 500 μl acetonu. Pozostałą krew można wykorzystać do sprawdzenia poziomu glukozy we krwi za pomocą glukometru i/lub odwirować w celu oddzielenia osocza do przyszłych testów hormonalnych.</li>
</ol>
6. Drugi napar
<ol>
	<li>Usunąć infuzje z pomp strzykawkowych, odłączając rurkę od strzykawek i zastąpić ją drugim infuzatem, zawierającym znacznik wraz z glukozą. Powtórz kroki od 4.2 do 4.7, używając infuzji glukozy izotopowej bogatej w glukozę.
	<ol>
		<li>Aby osiągnąć stan ustalony, należy uruchomić bolus drugiego infuzjatu w dawce 600 μl/h przez 15 minut. Zanotować czas rozpoczęcia dla każdej grupy klatek. Szybkość infuzji należy zmniejszyć do 150 μl/h, aby uzyskać 3 godziny całkowitego czasu infuzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 5.1 i 5.2.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę infuzyjną i delikatnie wyjmij cewnik do żyły ogonowej, uciskaj miejsca cewnika, aż krwawienie ustanie, a następnie wróć myszy do ich domowych klatek.</li>
	<li>Dokładnie zdezynfekuj klatkę za pomocą standardowego mydła i wody. 
	UWAGA: Jest to procedura przetrwania. Myszy można zwrócić do klatek i w razie potrzeby trzymać do dalszych doświadczeń. Zaleca się, aby nie przeprowadzać dalszych badań przez co najmniej tydzień po tej procedurze, aby zapewnić odpowiedni dobrostan zwierząt.</li>
</ol>
7. Spektrometria mas
<ol>
	<li>Wyślij próbki do spektrometrii mas.</li>
	<li>Analizy
	<ol>
		Zmierz wzbogacenie izotopowe [6,6-2 H2]glukozy za pomocą chromatografii gazowej - spektrometrii mas (GCMS) przy użyciu pochodnej pentaoctanu21,22.<li> Krótko mówiąc, metoda ta polega na przygotowaniu pochodnej pentaoctanu glukozy, a następnie analizie próbki za pomocą GCMS 20,22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenia
	<ol>
		<li>Wszystkie pomiary kinetyczne należy wykonywać w warunkach stanu ustalonego. Całkowity wskaźnik pojawiania się glukozy w osoczu (glukoza Ra) obliczono na podstawie wzbogacenia M+2 glukozy [6,6-2 H2] w osoczu przy użyciu ustalonych równań rozcieńczania izotopów21. W warunkach stanu stacjonarnego zakłada się, że szybkość pojawiania się glukozy jest równa szybkości zanikania glukozy. Szybkość endogennej produkcji glukozy (mg/(kg·min)) (GPR) = glukozaRa - glukoza egzogenna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li>
<li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li>
<li>Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group
. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li>
<li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome%3A+etiology%2C+pathogenesis+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li>
<li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction%3A+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li>
<li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic-pituitary%2C+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li>
<li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li>
<li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li>
<li>Højlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li>
<li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li>
<li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance%2C+polycystic+ovary+syndrome%2C+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+peripheral+insulin+resistance%2C+independent+of+obesity%2C+in+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li>
<li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li>
<li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li>
<li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+%26%2334%3Bmild%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bsevere%26%2334%3B+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &#34;mild&#34; and &#34;severe&#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li>
<li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538(2019).</li>
<li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+reproductive%2C+metabolic%2C+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li>
<li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Connections%22%5BJournal%5D)">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li>
<li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%26%2334%3Btrue%26%2334%3B+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6%2C6-dideuteroglucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Measurement of &#34;true&#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li>
<li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood.+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li>
<li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917(2014).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious%2C+unrestrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188(2011).</li>
<li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739(2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li>
<li>Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metabolism%22%5BJournal%5D)">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hiperglikemia i nieprawidłowy metabolizm/homeostaza glukozy to cechy PCOS. Poziom glukozy we krwi jest utrzymywany przez połączenie glukozy z diety i produkcji glukozy poprzez glikogenolizę i glukoneogenezę oraz glikogenezę, pod kontrolą hormonów i enzymów. Produkcja glukozy w wątrobie jest hamowana przez obecność zwiększonego poziomu glukozy we krwi. W zaburzeniach nieprawidłowego metabolizmu glukozy regulacja zahamowania produkcji glukozy jest zaburzona, co prowadzi do hiperglikemii. Podczas gdy wiele badań wy...

Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest częstym zaburzeniem występującym u 12%-20% kobiet w wieku rozrodczym1,2. Jest to złożona choroba skutkująca zmiennymi fenotypami obejmującymi policystyczne jajniki, nieregularne miesiączki i kliniczne lub laboratoryjne dowody hiperandrogenemii, i jest zwykle diagnozowana, gdy kobieta spełnia dwa z trzech kryteriów3. Dominującym aspektem PCOS i kluczowym czynnikiem w jego patogenezie są zaburzenia metaboliczne, które występują u kobiet cierpiących na tę chorobę. Kobiety z PCOS częściej występują w insulinooporności, nietolerancji glukozy, otyłości i zespole metabolicznym3,4,5,6. Insulinooporność jest nie tylko przejawem choroby, ale uważa się, że przyczynia się do jej patogenezy poprzez nasilenie działania hormonu luteinizującego w jajniku, prowadząc w ten sposób do zwiększonej produkcji androgenów7,8. Uważa się, że insulinooporność ma kilka możliwych źródeł, ale badania sugerują, że może być spowodowana nieprawidłowymi wzorcami sygnalizacji receptora insuliny9,10. W badaniach oceniano insulinooporność u pacjentów z PCOS przy użyciu złotego standardu techniki hiperinsulinemiczno-euglikemicznej klamry11,12,13,14,15. Kobiety z PCOS, niezależnie od BMI, mają wyższy poziom insulinooporności w porównaniu z grupą kontrolną. Kontrola insuliny nad produkcją glukozy jest upośledzona w zaburzeniach insulinooporności prowadzących do nadmiernej produkcji glukozy. Na przykład pacjenci z cukrzycą mają zwiększone wskaźniki glukoneogenezy i upośledzoną supresję glikogenolizy16. Ponadto zaobserwowano upośledzone zahamowanie produkcji glukozy u szczurów z cukrzycą17. Chociaż badania klamrowe mogą dać pomiar insulinooporności, niewiele badań nad PCOS koncentruje się na bezpośrednim pomiarze produkcji glukozy na czczo i po posiłku. Wymaga to zastosowania nieradioaktywnej infuzji izotopowego znacznika glukozy i pomiaru za pomocą spektrometrii mas.
Modele zwierzęce były szeroko wykorzystywane w badaniach nad PCOS. Zarówno szczupłe, jak i otyłe mysie modele PCOS zostały stworzone przez podawanie androgenów prenatalnie, przed okresem dojrzewania lub po okresie dojrzewania18. Modele PCOS u gryzoni wykazują również różnice metaboliczne w porównaniu z ich odpowiednimi kontrolami. Poprzednie dane z naszego laboratorium wykazały nieprawidłowe testy tolerancji glukozy (GTT) w modelach myszy PCOS (szczupłych i otyłych), zgodnie z literaturą na temat PCOS u ludzi19. Wykorzystanie szczupłego i otyłego modelu zwierzęcego pozwala na dalsze badania różnic metabolicznych. W szczególności model ten umożliwia ocenę szybkości produkcji glukozy bezpośrednio przy użyciu izotopowych znaczników glukozy. Jednym z najczęściej stosowanych stabilnych izotopowych znaczników glukozy jest [6,6-2H2]glukoza. Wzbogacenie w glukozę [6,6-2H2] można zmierzyć za pomocą pochodnej pentaoctanu, jak opisano wcześniej20.
W tym badaniu, naszym celem było zmierzenie tempa produkcji glukozy w wątrobie na czczo i w stanie bogatym w glukozę u myszy PCOS za pomocą izotopowego wlewu glukozy. Techniki te można zastosować w szerokim zakresie eksperymentów obejmujących kinetykę glukozy.

<table><tbody><tr><td>0,9% roztwór chlorku sodu</td><td>McKesson</td><td>275595</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka z końcówką BD Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>75846-756</td><td>Dwie strzykawki na zwierzę (jedna na izotopowy roztwór glukozy, jedna na izotopowy roztwór</td></tr> glukozy) <tr><td>1-calowa przezroczysta taśma transporowa</td><td></td><td>3M 70200400169</td><td></td></tr><tr><td>1-calowa taśma do etykietowania</td><td>Fisher</td><td>GS07F161BA</td><td>Brand to przykład</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml zawierająca płukanie solą fizjologiczną</td><td>McKesson</td><td>191-MIH-2235</td><td>Można również przygotować roztwór do płukania heparyny (10 jednostek/ml heparyny w 0,9% chlorku sodu)</td></tr><tr><td>5 mm Medipoint Goldenrod lancety dla zwierząt</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9891620</td><td>5 mm, jeśli zwierzę jest w wieku od 2 do 6 miesięcy</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane mieszadło z płytą grzejną</td><td>VWR</td><td>97042-602</td><td>Marka jest przykładem</td></tr><tr><td>Igły BD 27 o średnicy 0,5 cala</td><td>Magazyn zdrowia</td><td>A283952</td><td></td></tr><tr><td>Igły BD 30 o średnicy 0,5 cala</td><td>Medvet</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z polietylenu (PE) BD Intramedic 0,28 mm ID x 0,61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Rurka polietylenowa (PE) 0,28 mm ID x 0,61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka, 1000 ml</td><td></td><td></td><td>Dowolna marka</td></tr><tr><td>Granulki</td><td></td><td></td><td></td>do sadzenia</tr><tr><td>Przezroczyste szklane fiolki VOA z zamkniętą nakrętką</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-719-120</td><td>Do przechowywania acetonu i próbek krwi Miedziany</td></tr><tr><td>bezzębny zacisk aligatora do opaski uciskowej</td><td>Amazon</td><td></td><td>Any Brand; gładkie bezzębne zaciski aligatora wykonane z litej miedzi</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza >99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza (6,6-D2, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-349-PK</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silastyczna Dow Corning 0,3 mm ID x 0,64 mm OD</td><td>VWR</td><td>62999-042</td><td></td></tr><tr><td>Szkło powiększające</td><td>Amazon</td><td></td><td>Dowolna marka; podobny do LANCOSC Szkło powiększające z lekkim i podstawką</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>Ohaus Adventurer Pro</td><td>AV264C</td><td>Można użyć dowolnego podobnego modelu z dokładnością 0,0001 g</td></tr><tr><td>Butelka Nalgene, 500 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0158-12EA</td><td>Lub dowolna podobna marka; Przeciąć na pół (w tym pokrywę) i wyciąć wcięcie wielkości ogona w dolnej części</td></tr><tr><td>Pompa wielostrzykawkowa PHD Ultra</td><td>Aparat Harvarda</td><td>70-3024A</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz</td><td></td><td></td> pleksi <td>Dowolna marka; do stabilizacji myszy podczas wprowadzania cewnika</td></tr><tr><td>Arkusze i przekładki</td><td></td><td></td> z pleksi <td>Dowolna marka; Służy do trzymania myszy w klatkach podczas infuzji</td></tr></tbody></table>

ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest powszechną chorobą, która powoduje zaburzenia metabolizmu glukozy, takie jak insulinooporność i nietolerancja glukozy. Rozregulowany metabolizm glukozy jest ważnym objawem choroby i jest kluczem do jej patogenezy. Dlatego tak ważne są badania oceniające metabolizm glukozy w PCOS. Bardzo niewiele badań określiło ilościowo produkcję glukozy w wątrobie bezpośrednio w modelach PCOS przy użyciu nieradioaktywnych znaczników glukozy. W tym badaniu omawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące ilościowego oznaczania szybkości produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu PCOS poprzez pomiar wzbogacenia M + 2 glukozy [6,6-2 H2], stabilnego izotopowego znacznika glukozy, za pomocą chromatografii gazowej - spektrometrii mas (GCMS). Procedura ta polega na stworzeniu stabilnego izotopowego roztworu znacznika glukozy, zastosowaniu cewnika do żyły ogonowej i infuzji znacznika glukozy zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę u tej samej myszy w tandemie. Wzbogacenie [6,6-2H2]glukozy mierzy się za pomocą pochodnej pentaoctanu w GCMS. Technika ta może być stosowana w wielu różnych badaniach obejmujących bezpośredni pomiar szybkości produkcji glukozy w wątrobie.

Korzystając z wcześniej opisanych równań rozcieńczania izotopowego, całkowity wskaźnik glukozy w osoczu (glucoseRa) obliczono na podstawie wzbogacenia M+2 [6,6-2H2glukozy w warunkach na czczo oraz w warunkach wysokiego stężenia glukozy z wykorzystaniem pochodnej pentaoctanu21W warunkach stanu stacjonarnego przyjmuje się, że szybkość pojawiania się glukozy jest równa szybkości jej zanikania. W grupie kontrolnej całkowita glukozaRa wynosiło 19,98 ± 2,53 mg...

To badanie opisuje bezpośredni pomiar produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu stabilnego izotopowego znacznika glukozy przez żyłę ogonową zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę w tandemie.

Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Celem tej procedury jest określenie produkcji glukozy w wątrobie w zespole policystycznych jajników lub mysim modelu PCOS. Rozregulowany metabolizm glukozy jest ważnym objawem PCOS i ma kluczowe znaczenie dla jego patogenezy. Dlatego tak ważne są badania oceniające metabolizm glukozy w PCOS.W tym badaniu omawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące ilościowego oznaczania szybkości produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu PCOS poprzez pomiar wzbogacenia M plus dwa sześciu sześciosześciokrotnie deuterowanych glukoz, stabilnego izotopowego znacznika glukozy, za pomocą chromatografii gazowej, spektrometrii mas lub GCMS. Procedura ta polega na stworzeniu stabilnego izotopowego roztworu znacznika glukozy, zastosowaniu cewnika do żyły ogonowej i infuzji znacznika glukozy zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę u tej samej myszy w tandemie. Na dzień przed zabiegiem należy przygotować znacznik glukozy ze stabilnego izotopu w soli fizjologicznej.W tym eksperymencie zmierzono produkcję glukozy podczas postu w warunkach bogatych w glukozę, więc izotop glukozy przygotowano w dwóch różnych preparatach. Znacznik przygotowano w sterylnych warunkach poprzez rozpuszczenie sterylnych i w

evaluation-hepatic-glucose-production-polycystic-ovary-syndrome-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Ten film pokazuje, jak przeprowadzić doustny test tolerancji glukozy na myszy laboratoryjnej.

Doustny test tolerancji glukozy (OGTT): pomiar metabolizmu glukozy u myszy

Ten artykuł opisuje sposób przygotowania i wstawiania granulek dihydrotestosteronu (DHT) do modelowania zespołu policystycznych jajników (PCOS) u myszy. Przykładowy protokół demonstruje procedurę na myszach wykorzystywanych do badań reprodukcyjnych i metabolicznych.

Leczenie podskórnego dihydrotestosteronu (DHT): mysi model zespołu policystycznych jajników (PCOS)

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Obecny artykuł opisuje generację i charakterystykę metaboliczną myszy karmionych dietą wysokotłuszczową jako model insulinooporności i otyłości wywołanej dietą. Ponadto zawiera szczegółowe protokoły do wykonywania doustnego testu tolerancji glukozy i testu tolerancji insuliny, monitorując zmiany metabolizmu glukozy w całym organizmie in vivo.

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT)

Opisujemy rozwój szczupłego modelu myszy podobnego do PCOS z granulką dihydrotestosteronu w celu zbadania patofizjologii PCOS i potomstwa z tych matek podobnych do PCOS.

Hiperandrogenny model myszy do badania zespołu policystycznych jajników

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Ten protokół wprowadza technikę indukowania modeli zespołu policystycznych jajników (PCOS) u myszy poprzez kontrolowane uwalnianie letrozolu za pomocą mini-pomp. W odpowiednim znieczuleniu minipompa została wszczepiona podskórnie, a PCOS został pomyślnie wywołany u myszy po pewnym czasie od uwolnienia minipompy.

Zmodyfikowana technika wywoływania zespołu policystycznych jajników u myszy

Poznaj metodę oceny produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu izotopowego znacznika glukozy i GCMS. Technika ta pozwala dokładnie zmierzyć metabolizm glukozy w różnych stanach metabolicznych.

Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Przeglądaj więcej filmów