Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki
September 13th, 2021
Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.
Nasz zespół badawczy opracowuje technologie i protokoły dla mikroskopii krioelektronowej i kriotomografii elektronowej. Opracowaliśmy protokoły mikrowzorcowania siatek TEM w celu kierowania wzrostem i pozycjonowaniem komórek w eksperymentach z krio-ET. Krioelektronowa tomografia całych komórek służy do wytwarzania struktur kompleksów makromolekularnych o rozdzielczości nanometrowej w komórkach zachowanych w natywnym zamrożonym stanie uwodnionym.
Mikrowzorce mogą zwiększyć przepustowość eksperymentów z krio-ET dla całych komórek, kriokorelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych i kriogenicznego mielenia wiązką jonów. Liczba i rozmieszczenie komórek na siatkach EM mają kluczowe znaczenie dla badań krio-ET w całych komórkach. Protokół ten zapewnia szybką, powtarzalną i szeroko adaptowalną metodę kierowania wzrostem komórek na siatkach EM poprzez mikrowzorzec.
Badacz powinien swobodnie korzystać z pipet, pęsety, podstawowych technik hodowli komórkowych oraz fluorescencyjnych i transmisyjnych mikroskopów elektronowych. Podczas tworzenia wzoru po raz pierwszy użyj dobrze znanej kombinacji typu komórek i ECM i przetestuj je na szkiełkach nakrywkowych lub szalkach MatTek. Członkami zespołu badawczego zaangażowanymi w opracowanie tego protokołu są: dr
Brian Sibert, pan Joseph Kim i dr Jae Yang. Aby rozpocząć, przenieś kratki do uchwytu do przygotowania siatki i rozładowuj żar kratki stroną węglową do góry. Następnie przenieś kratki stroną węglową do góry na czyste szkiełko lub szkiełko nakrywkowe z zachowaniem co najmniej jednego centymetra odstępu między kratkami.
Pobrać pipety z 10 mikrolitrów 0,05 poli-L-lizyny na każdą siatkę i inkubować siatki w wilgotnej komorze przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji umyj każdą siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami 0,1 molowego HEPES-u o pH 8,5. Inkubuj siatkę w każdym praniu przez 30 sekund, a następnie usuń większość płynu z kratki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki.
Po ostatnim praniu pozostaw każdą siatkę w 15 mikrolitrach 0,1 molowej HEPES. Następnie należy przygotować roztwór PEG-SVA i natychmiast zastąpić roztwór HEPES na kratkach 10 mikrolitrami roztworu PEG-SVA, a następnie inkubować kratki w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę. Po inkubacji umyj każdą siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami sterylnej wody, inkubując siatkę w każdym praniu przez 30 sekund.
Po ostatnim praniu pozostaw każdą kratkę w 15 mikrolitrach wody. Umieść jedną mikrolitrową kroplę wody na środku nowego czystego szkiełka nakrywkowego, a następnie ostrożnie przenieś siatkę z kropli wody o pojemności 15 mikrolitrów do kropli na nowym szkiełku nakrywkowym stroną z włókna węglowego do góry. Następnie ostrożnie umieść szablon PDMS nad siatką, utrzymując siatkę wyśrodkowaną i minimalizując kontakt szablonu z folią węglową siatki.
Następnie dodaj jeden mikrolitr żelu PLPP na siatkę i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatką w ciemne miejsce do wyschnięcia. Żel wyschnie w ciągu 15 do 30 minut.
W przypadku tworzenia mikrowzorów otwórz oprogramowanie z widokiem Brightfield na żywo z mikroskopu. Aby zaprojektować nowy szablon dla początkowego uruchomienia, wybierz opcję Dodaj zwrot z inwestycji i wybierz okrąg o średnicy 3 000 mikrometrów. Ustaw okrągły ROI nad siatką, korzystając z obrazu Brightfield na ekranie jako przewodnika, a następnie naciśnij Zablokuj, aby zabezpieczyć ROI.
Po zablokowaniu zwrotu z inwestycji w miejscu wybierz Dodaj wzór i wybierz odpowiedni wzór. Korzystając z opcji replikacji, wygeneruj kopie początkowego wzorca, aby utworzyć kwadratowy region siatki osiem na osiem. W razie potrzeby dostosuj odstępy i kąt, aby wyrównać wzory z kwadratami siatki.
Umieść wzór w jednym z rogów siatki. Następnie zduplikuj wzór i umieść kopię w każdym z czterech rogów siatki, przesuwając stolik mikroskopu w razie potrzeby dla każdego regionu. Użyj opcji replikacji, aby zmodyfikować kwadratowy region siatki o wymiarach osiem na osiem w kwadratowy region siatki o wymiarach dwa na osiem, który ma zostać umieszczony po obu stronach środka.
Pozostaw środkowe cztery kwadraty siatki bez wzoru. Dla każdego wzorca, w razie potrzeby dostosować całkowitą dawkę. 30 milidżuli na milimetr kwadratowy to dobry punkt wyjścia.
W obszarze Opcje zaawansowane wykonaj iterację, dopasowując kąt, położenie, odstęp między wzorkami i ich stosunek, aby poprawić wyrównanie wzoru do kwadratów siatki. Przesuń stolik mikroskopu, aby zmienić obszar siatki na wyświetlaczu Brightfield. Po umieszczeniu szablonu i wzorów odznacz wszystkie regiony oprócz jednego w panelu sterowania oprogramowania.
Użyj stolika mikroskopu, aby przejść do tego obszaru i skup się na folii węglowej. Kliknij ikonę gałki ocznej w panelu sterowania, aby wyłączyć wyświetlanie nakładki wzoru. Gdy siatka jest ostra, zamknij migawkę Brightfield i naciśnij ikonę Odtwórz w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć proces tworzenia wzoru, który można monitorować na żywo.
Powtarzaj ten krok, aż wszystkie regiony zostaną utworzone we wzorze. Na koniec należy zdjąć szkiełko nakrywkowe z siatką z mikroskopu i natychmiast dodać 10 mikrolitrów sterylnego PBS na siatkę. Po 10 minutach usuń szablon pęsetą, a następnie umyj siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami PBS i pozostaw każdą siatkę w PBS w ciemnym miejscu.
Przygotuj 15 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej dla każdej siatki, a następnie zastąp PBS z każdej siatki 15 mikrolitrami macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubuj siatkę w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę. Po inkubacji przemyć każdą siatkę pięciokrotnie 15 mikrolitrami sterylnego PBS, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim praniu pozostaw każdą siatkę w PBS.
Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wykryj fluorofor w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostaje nienaruszona. Komórki HeLa wysiane na mikrowzorzystych i niewzorzystych siatkach TEM są widoczne przez barwienie fluorescencyjne przy użyciu testu żywotności komórek opartego na kalceinie AM i etydynie-1. Wykorzystując mieszaną macierz zewnątrzkomórkową kolagenu i fibrynogenu, komórki HeLa łatwo przylegają do wzorców w całej siatce.
Ogólna morfologia komórek, które rozszerzyły się wzdłuż wzoru, jest podobna do morfologii komórek wyhodowanych na niewzorzystych siatkach. Obraz w jasnym polu komórek BEAS-2B zakażonych wirusem RSV 18 godzin po wysiewie pokazuje adhezję i wzrost komórek wzdłuż centralnego obszaru wzoru. Większość zainfekowanych komórek jest umieszczona wzdłuż centralnego obszaru gradientu o większej gęstości.
Warianty RSV znajdują się blisko peryferii zakażonych komórek BEAS-2B hodowanych na siatkach z mikrowzorami. W tomogramach zidentyfikowano wiele białek strukturalnych RSV, w tym nukleokapsyd i białko fuzyjne wirusa. Na mikrowzorzystych siatkach neurony Drosophila z panneuronalną ekspresją GFP można łatwo śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej ze względu na znakowanie fluorescencyjne i ich lokalizację w mikrowzorcach.
Neurony na niewzorzystych siatkach mogą być również śledzone za pomocą sygnalizacji GFP za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak zlokalizowanie ich w mikroskopii krioelektronowej staje się trudne ze względu na szczątki komórkowe i zanieczyszczenie pożywką. Ze względu na wymiary ciała komórki neuronalnej i wydłużone neuryty, serie pochyleń krio-tomografii elektronowej są zbierane wzdłuż cieńszych obszarów komórek przy większym powiększeniu.
Błona komórkowa neuronów, mitochondria, mikrotubule, włókna aktynowe, struktury pęcherzykowe i makrocząsteczki, takie jak rybosomy, są dobrze rozdzielone w montażach obrazów o większym powiększeniu i przekrojach przez tomogram 3D. Podobne cechy subkomórkowe obserwuje się na podstawie tomogramów 3D neuronów bez wzoru. Nakładanie szablonu na siatkę i dodawanie żelu PLPP jest najbardziej wrażliwym krokiem, który może mieć wpływ na wyniki wzoru i należy go wykonywać ostrożnie.
Cryo-CLEM może być używany do lokalizowania celów zainteresowania w komórkach w celu zbierania danych Cryo-ET. Cryo-FIB-SEM może być używany do rozrzedzania komórek na obszarach, które w przeciwnym razie byłyby zbyt grube do zbierania danych.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę kierowania adhezją komórek i ich wzrostem na siatkach EM do mikroskopii kryoelektronowej. Poprzez zastosowanie warstwy antyosadu i osadzanie białek macierzy pozakomórkowej w określonych wzorach, naukowcy mogą ulepszyć pozycjonowanie komórek do badań obrazowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikroskopia kryoelektronowa
- Adhezja komórek
- Techniki mikromodelowania
Tło
- Tomografia kryoelektronowa całych komórek zapewnia wysokorozdzielcze obrazy struktur komórkowych.
- Mikromodelowanie może poprawić efektywność kryo-ET i pokrewnych technik obrazowania.
- Rozmieszczenie komórek na siatkach EM jest kluczowe dla pomyślnego obrazowania.
- Ten protokół został zaprojektowany, aby być szybki i przystosowany do różnych typów komórek.
Cel badania
- Opracowanie metody umożliwiającej kierowanie wzrostu komórek na siatkach EM.
- Poprawa wydajności kryo-ET i pokrewnych technik obrazowania.
- Ułatwienie badań struktur komórkowych w stanie naturalnym.
Stosowane metody
- Przygotowanie siatek EM z warstwą antyosadową.
- Zastosowanie białek macierzy pozakomórkowej w wzorowane obszary.
- Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej do walidacji.
- Mikromodelowanie za pomocą oprogramowania do projektowania określonych wzorów na siatkach.
Główne wyniki
- Komórki HeLa przyczepiały się do mikrowzorowane siatek, co wykazało efektywne pozycjonowanie komórek.
- Barwienie fluorescencyjne potwierdziło pomyślne modelowanie i żywotność komórek.
- Morfologia komórek na wzorcowych siatkach była podobna do tej na siatkach niewzorowane.
- Protokół umożliwia efektywne badania struktur komórkowych za pomocą kryo-ET.
Wnioski
- Ten protokół mikromodelowania jest efektywny w kierowaniu wzrostu komórek na siatkach EM.
- Metoda zwiększa potencjał wysokorozdzielczego obrazowania struktur komórkowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne typy komórek i kombinacje ECM.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Micropatterning of TEM grids for whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) addresses a critical bottleneck in high-resolution cellular imaging by enabling precise control over cell positioning and distribution. This capability enhances the reliability and throughput of cryo-ET workflows, supporting robust structural biology and mechanistic studies in early discovery and translational research. The approach is broadly adaptable, facilitating integration with advanced imaging modalities and complex experimental systems relevant to biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of macromolecular complexes in native cellular environments for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving physiological cell states during imaging.
- Improves predictive confidence in structural and pathway analyses by standardizing cell positioning.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of reproducible, patterned biological samples for downstream imaging workflows.
- Enhances assay standardization and scalability by controlling cell adhesion and morphology on grids.
- Enables reliable evaluation of compound effects on cellular ultrastructure in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Supports studies of host-pathogen interactions and multicellular systems with disease relevance.
- Maintains translational continuity by integrating with cryo-CLEM and cryo-FIB for advanced sample preparation.
- Provides risk-adjusted advancement by enabling high-content, quantitative imaging of cellular phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This micropatterning protocol positions itself at the interface of discovery biology and advanced imaging, bridging early mechanistic studies with preclinical model validation.
- Discovery Biology: Directs hypothesis-driven analysis of cellular architecture and macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sample preparation for high-throughput imaging assays.
- Analytics: Provides robust spatial and morphological readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease-modeling workflows through integration with correlative imaging techniques.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated use across diverse cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in sample preparation for imaging workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and cross-program applicability in R&D pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, micropatterning, and advanced microscopy techniques.
- Demands access to fluorescence and transmission electron microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of pattern design and ECM selection for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of cell types and experimental models with appropriate validation.
- Patterning sensitivity and grid handling are critical for consistent outcomes and should be carefully managed.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:25
Preparation of Grids for Patterning and Application of the Anti-fouling Layer
2:50
Applying PLPP Gel
3:33
Micropatterning
6:11
Deposition of Extracellular Matrix (ECM) Proteins
6:54
Results: Micropatterning to Direct Cell Positioning within Whole-cell Cryo-electron Tomography
9:17
Conclusion
