Name: Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę mikrowzorowania siatek TEM do bezpośredniego pozycjonowania komórek w kriotomografii elektronowej całej komórki. Ta technika zwiększa przepustowość badań cryo-ET i umożliwia obrazowanie struktur komórkowych w stanie natywnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jill Wildonger, dr Sihui Z. Yang i pani Josephine W. Mitchell z Wydziału Biochemii Uniwersytetu Wisconsin, Madison za hojne podzielenie się elav-Gal4, UAS-CD8::GFP szczep muchy (Bloomington stock center, #5146). Chcielibyśmy również podziękować dr Aurélienowi Duboinowi, panu Laurentowi Siquierowi i pani Marie-Charlotte Manus z Alvéole oraz panu Serge'owi Kaddourze z Nanoscale Labs za ich hojne wsparcie podczas tego projektu. Praca ta była częściowo wspierana przez University of Wisconsin w Madison, Wydział Biochemii Uniwersytetu Wisconsin w Madison oraz granty publicznej służby zdrowia R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 i U24 GM139168 dla E.R.W. i R01 AI150475 dla P.W.S. z NIH. Część tych badań była wspierana przez grant NIH U24 GM129547 i przeprowadzona w PNCC w OHSU i dostępna za pośrednictwem EMSL (grid.436923.9), DOE Office of Science User Facility sponsorowanego przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych. Jesteśmy również wdzięczni za korzystanie z urządzeń i oprzyrządowania w Centrum Badawczym Cryo-EM na Wydziale Biochemii Uniwersytetu Wisconsin w Madison.

<ol><li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li>
<li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li>
<li>Bäuerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fernández-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159(2021).</li>
<li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li>
<li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue%3A+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biolology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li>
<li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIE-scope%2C+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB%2FSEM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919(2019).</li>
<li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li>
<li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li>
<li>Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li>
<li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li>
<li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237(2021).</li>
<li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251(2021).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li>
<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li>
<li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916(2016).</li>
<li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CorRelator%3A+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709(2021).</li>
<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736(2018).</li>
<li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li>
<li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957(2021).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography%3A+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716(2021).</li>
<li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+micropatterning%3A+methods%2C+effects%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li>
<li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li>
<li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li>
<li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633(2020).</li>
<li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowoczesne, zaawansowane mikroskopy elektronowe i pakiety oprogramowania obsługują teraz usprawnione automatyczne gromadzenie danych cryo-EM i cryo-ET, dzięki czemu w ciągu kilku dni można namierzyć i zobrazować setki do tysięcy pozycji.32,33,34,35. Jednym z istotnych czynników ograniczających przepływy pracy z użyciem krio-ET dla całych komórek było uzyskanie wystarczającej liczby możliwych do zebrania celów na siatkę. Ostatnio wiele grup opracowało protokoły dla siatek mikrowzorcowych dla cryo-EM, a jedną z zalet jest poprawa wydajności zbierania danych 16,17,18. W tym miejscu przedstawiono protokół użycia dostępnego na rynku systemu mikrowzorców do mikrotworzenia siatek TEM do badań krio-ET pierwotnych neuronów Drosophila i hodowanych ludzkich linii komórkowych (niezakażonych lub zakażonych RSV). Ten system mikrowzorców jest wszechstronny, a wiele kroków można zoptymalizować i dostosować do konkretnych celów eksperymentalnych. Użytkownik z doświadczeniem w TEM i mikroskopii fluorescencyjnej może szybko nabrać wprawy w przygotowywaniu siatek i mikrowzorcach. Przy starannej praktyce dobre wyniki powinny być osiągalne po kilku iteracjach. Poniżej omówiono niektóre z dostępnych opcji, rozważania dotyczące użytkowników, potencjalne korzyści i przyszłe zastosowania mikrowzorcowania dla cryo-EM.
Jednym z ważnych czynników branych pod uwagę przy stosowaniu cryo-ET na całych komórkach jest wybór siatki EM. Siatki EM składają się z dwóch części: ramy siatkowej (lub wspornika konstrukcyjnego) i folii (lub folii), która jest ciągłą lub dziurawą powierzchnią folii, na której będą rosły komórki. Siatki miedziane są powszechnie stosowane do krio-EM białek i izolowanych kompleksów. Nie nadają się jednak do krio-ET całokomórkowych ze względu na cytotoksyczność miedzi. Zamiast tego złota siatka jest powszechnie stosowana w tomografii komórkowej. Inne opcje obejmują nikiel lub tytan, które mogą zapewniać korzyści w porównaniu ze złotem, takie jak zwiększona sztywność16. Siatki EM są dostępne z różnymi wymiarami siatki, aby obsługiwać szereg zastosowań. Większe rozmiary oczek zapewniają więcej miejsca na wzrost komórek między prętami siatki i więcej obszarów, które można zbierać w serii pochylania, choć kosztem zwiększonej ogólnej kruchości próbki. Najczęściej stosowaną folią jest perforowany lub dziurawy amorficzny węgiel, taki jak Quantifoils lub siatki C-flat. Cele biologiczne mogą być obrazowane albo przez otwory w węglu, albo przez węgiel przezroczysty elektronowo. Siatki takie jak R 2/1 lub R 2/2, w których otwory mają szerokość 2 μm i są oddalone od siebie odpowiednio o 1 i 2 μm, zapewniają dużą liczbę otworów, a tym samym dużą liczbę potencjalnych obszarów do gromadzenia danych. Jednak niektóre komórki mogą lepiej rosnąć i rozszerzać się na bardziej jednolitych powierzchniach, takich jak siatki R 1,2/20 lub ciągły węgiel. W przypadku dalszego przetwarzania próbki za pomocą mielenia wiązką jonów (cryo-FIB), folia jest usuwana poprzez mielenie, co zmniejsza obawy o ciągłą obecność folii znajdującej się pod spodem. Podobnie jak w przypadku siatki, dostępne są również folie z innych materiałów, przy czym przedstawiony tutaj protokół wzoru jest równie odpowiedni dla siatek SiO2 . Powszechnie stosowane siatki obejmują złote siatki Quantifoil, ciągły węgiel lub siatkę SiO2 o oczkach 200 (odstęp ~ 90 μm między prętami siatki) do krio-ET dla całych komórek.
Podczas projektowania wzoru należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Większość tych decyzji zależy od typu komórki i celu eksperymentu. Dobrym punktem wyjścia jest wybór wzoru, który jest zbliżony do kształtu i wymiarów komórek w hodowli. Wiele badań wykazało znaczący wpływ kształtu wzoru na wzrost komórek i układ cytoszkieletu 13,36,37. Należy zachować szczególną ostrożność podczas projektowania wzoru, jeśli mogłoby to spowodować zmianę interesującego go celu. Przetestowano kilka wzorców dla każdego typu komórek, aby określić, które wzorce sprzyjają adhezji i wzrostowi komórek. Elastyczność systemu mikrowzorców pozwala na testowanie wielu wzorców na jednej siatce i zmianę wzorców dla różnych siatek w ramach jednego eksperymentu. Większe wzory (~50-90 μm), takie jak te zastosowane tutaj, zwiększają prawdopodobieństwo, że wiele komórek przylega do jednego obszaru wzoru i pozwala komórkom rozszerzać się i wydłużać po adhezji. Bardziej ograniczone wzorce (20-30 μm) mogą być odpowiednie w eksperymentach, w których izolacja komórek jest bardziej krytyczna niż ekspansja komórek, takich jak eksperymenty z mieleniem wiązki jonów (cryo-FIB). W przypadku zastosowań tomograficznych może być konieczne rozważenie wpływu osi wychylenia. Jeśli wzór jest umieszczony w taki sposób, że wszystkie komórki rosną równolegle do siebie w jednym kierunku, możliwe jest, że wszystkie komórki będą prostopadłe do osi nachylenia po załadowaniu na stolik mikroskopu, co spowoduje niższą jakość danych.
Na siatkach bez wzoru komórki często preferencyjnie przylegają do pasków siatki, gdzie nie mogą być zobrazowane przez TEM. Nawet na wzorzystych siatkach często obserwuje się, że komórki są umieszczone w rogach kwadratów siatki, częściowo zarówno na wzorzystej folii węglowej, jak i na pasku siatki. Ostatnio zastosowano mikrowzory, aby celowo umieścić część komórki nad paskiem siatki18. Można to uwzględnić w eksperymentach, w których nie jest krytyczne, aby całe obrzeże komórki znajdowało się na folii. Może to być szczególnie ważne w przypadku komórek, które mogą rosnąć większe niż pojedynczy kwadrat siatki, takich jak neurony pierwotne rosnące przez wiele dni.
Istnieje wiele narzędzi, które można wykorzystać do zaprojektowania wzoru. W tym przypadku wzór był ograniczony do mniej niż 800 pikseli w dowolnym wymiarze, dzięki czemu wzór można obrócić pod dowolnym kątem i nadal mieścić się w maksymalnym obszarze, który można utworzyć w jednej projekcji za pomocą tego systemu mikrowzorów. Dzięki temu użytkownik może obracać wzór w celu prawidłowej orientacji z siatką, niezależnie od orientacji siatki na mikroskopie. W tym miejscu siatka została podzielona na sześć obszarów wzoru. Przede wszystkim umożliwia to regulację ostrości między różnymi obszarami siatki. W szczególności złote kratki są bardzo plastyczne i mogą nie układać się całkowicie płasko na szkle. Właściwa ostrość jest niezbędna do uzyskania czystych, wyrafinowanych rezultatów wzoru. Korzystając z wzorów podzielonych na segmenty, należy dokonać tylko niewielkich korekt pozycji wzoru, jeśli siatka nieznacznie się przesunie podczas procesu tworzenia wzorów, chociaż zwykle nie stanowi to problemu w przypadku używania żelu PLPP z szablonami PDMS. Wreszcie, cztery środkowe kwadraty siatki pozostały niewzorzec. Dzięki temu użytkownik jest w stanie wyraźnie zidentyfikować środek siatki, co jest bardzo przydatne w eksperymentach z obrazowaniem korelacyjnym.
Oprogramowanie do tworzenia wzorów dla tego systemu mikrowzorów, Leonardo, ma również bardziej zaawansowane funkcje, takie jak zszywanie i możliwość importowania wzorów w formacie PDF, które wykraczają poza zakres tego protokołu. Oprogramowanie to obejmuje również wykrywanie mikrostruktury i automatyczne pozycjonowanie wzorców, które można wykorzystać na siatkach TEM. Ta funkcja jest najbardziej przydatna, gdy siatka jest bardzo płaska i można ją tworzyć bez konieczności dostosowywania ostrości między różnymi obszarami.
Wybór białka ECM może mieć znaczący wpływ na adhezję i ekspansję komórek. Wiadomo, że niektóre komórki ulegają zmianom fizjologicznym, gdy są hodowane na określonych podłożach38. Przetestowano wiele białek i stężeń ECM pod kątem każdego nowego typu komórek w oparciu o wcześniejsze prace opisane w literaturze. Laminina, fibrynogen, fibronektyna i kolagen są szeroko stosowane w hodowlanych komórkach i mogą być używane jako punkt wyjścia, jeśli inne dane nie są dostępne. Należy jednak również wziąć pod uwagę inne białka ECM, jeżeli powszechnie stosowane białka ECM nie nadają komórkom odpowiednich właściwości przylegania. Było to szczególnie prawdziwe w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila , ponieważ wysokie stężenie roślinnej lektyny konkanawaliny A było niezbędne do prawidłowego przylegania komórek. Kompatybilność adhezji komórkowej i wzrostu z ECM można przetestować poprzez narysowanie wzoru na szklanych szalkach lub szkiełkach przed przejściem do siatek TEM. To podejście polegające na wstępnej selekcji jest efektywne czasowo i kosztowo, jeśli konieczne jest zbadanie dużej liczby kombinacji. Włączenie fluorescencyjnie sprzężonego białka ECM jest cenne dla oceny sukcesu i jakości modelowania.
Wysiewanie komórek jest jednym z najważniejszych etapów dla cryo-ET dla całych komórek, zarówno z mikrowzorcami, jak i bez 6,16,39. W przypadku pierwotnych Drosophila lub innych neuronów, które są kruche, niestabilne w zawiesinie i mogą mieć ograniczoną ilość, preferowane są metody pojedynczego wysiewu zamiast monitorowanego, sekwencyjnego siewu komórek. Pojedynczy etap wysiewu przy zoptymalizowanej gęstości komórek, jak opisano w protokole dla neuronów Drosophila, jest realną opcją dla większości typów komórek. Możliwe jest jednak również wysiewanie komórek na substrat przy niższym stężeniu początkowym i dodawanie większej liczby komórek w monitorowany sposób, jak opisano tutaj i w innej literaturze18. To sekwencyjne rozsiewanie może w niektórych przypadkach zapewnić bardziej spójne wyniki. Podobnie jak w przypadku standardowej hodowli komórkowej, należy zawsze zachować ostrożność, aby utrzymać żywotność komórek i zminimalizować zlepianie się komórek podczas izolacji.
Kiedy po raz pierwszy zaczynasz przygodę z mikrowzorami, istnieje kilka potencjalnych pułapek, które są szkodliwe dla końcowego wyniku. Staranne obchodzenie się z siatką i sterylna technika, równomierne rozprowadzenie żelu PLPP, właściwa dawka i skupienie podczas modelowania oraz utrzymanie żywotności komórek przed wysiewem to jedne z najważniejszych czynników decydujących o sukcesie. Listę niektórych potencjalnych problemów oraz ich rozwiązań zebrano w tabeli 1.
Siatki z mikrowzorami mogą być używane do pomocy w pozycjonowaniu komórek w celu ustalenia stałej gęstości komórek w całej siatce oraz do pozycjonowania obszarów zainteresowania w obszarach odpowiednich do zbierania serii pochylenia16,18. Rozmieszczenie i pozycjonowanie komórek może być wykorzystane jako markery odniesienia do korelacji w eksperymentach krio-CLEM, zmniejszając potrzebę stosowania delikatnych siatek szukacza i fluorescencyjnych markerów odniesienia. Należy jednak zauważyć, że takie markery referencyjne mogą być nadal przydatne do korelacji dokładności submikrometrowej29,40. Co więcej, równomierny rozkład izolowanych komórek jest również bardzo korzystny w eksperymentach z mieleniem wiązką jonów (cryo-FIB) w celu maksymalizacji liczby komórek, z których można wyciąć lamelę16.
Dodanie mikrowzorców do przepływów pracy krio-EM spowoduje wymierną poprawę przepustowości danych i potencjalnie umożliwi przeprowadzenie nowych eksperymentów. Wraz z dalszym wdrażaniem i rozwojem tej techniki, bardziej zaawansowane zastosowania mikrowzorów, w tym gradienty ECM, wielokrotne osadzanie ECM i składanie mikrostruktur, jeszcze bardziej rozszerzą możliwości cryo-ET w zakresie badania celów i procesów biologicznych w pełnym kontekście komórkowym.

Wraz z rozwojem, rozszerzeniem i wszechstronnością mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), naukowcy przebadali szeroki zakres próbek biologicznych w stanie zbliżonym do natywnego od makromolekularnej (~1 nm) do wysokiej (~2 A) rozdzielczości. Techniki krio-EM i dyfrakcji elektronów jednocząsteczkowych najlepiej stosować odpowiednio do oczyszczonych makrocząsteczek w roztworze lub w stanie krystalicznym1,2. Natomiast krioelektronowa tomografia (cryo-ET) jest wyjątkowo przydatna do niemal natywnych badań strukturalnych i ultrastrukturalnych dużych, heterologicznych obiektów, takich jak bakterie, wirusy pleomorficzne i komórki eukariotyczne3. W cryo-ET trójwymiarowe (3D) informacje uzyskuje się poprzez fizyczne przechylenie próbki na stoliku mikroskopu i uzyskanie serii obrazów przez próbkę pod różnymi kątami. Obrazy te, lub serie pochylenia, często obejmują zakres +60/-60 stopni w krokach co jeden do trzech stopni. Seria pochylenia może być następnie obliczeniowo zrekonstruowana w objętość 3D, znaną również jako tomogram4.
Wszystkie techniki krio-EM wymagają, aby próbka była osadzona w cienkiej warstwie amorficznego, niekrystalicznego, szklistego lodu. Jedną z najczęściej stosowanych technik kriofiksacji jest zamrażanie wgłębne, w którym próbka jest nakładana na siatkę EM, osuszana i szybko zanurzana w ciekłym etanie lub mieszaninie ciekłego etanu i propanu. Technika ta jest wystarczająca do witryfikacji próbek o grubości od <100 nm do ~10 μm, w tym hodowanych komórek ludzkich, takich jak HeLa cells5,6. Grubsze próbki, takie jak mini-organoidy lub biopsje tkanek, o grubości do 200 μm, mogą być zeszklone przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem7. Jednak ze względu na zwiększone rozpraszanie elektronów w grubszych próbkach, grubość próbki i lodu dla cryo-ET jest ograniczona do ~0,5 - 1 μm w transmisyjnych mikroskopach elektronowych 300 kV. W związku z tym krio-ET dla całych komórek wielu komórek eukariotycznych jest ograniczony do obrzeży komórek lub przedłużeń komórek, chyba że stosuje się dodatkowe etapy przygotowania próbki, takie jak kriosekcja8 lub mielenie wiązki jonów skupionych9,10,11.
Ograniczeniem wielu eksperymentów z obrazowaniem krio-ET na całych komórkach jest przepustowość zbierania danych12. W przeciwieństwie do krio-EM-pojedynczej cząstki, gdzie tysiące izolowanych cząstek można często obrazować z pojedynczego kwadratu siatki TEM, komórki są duże, rozproszone i muszą być hodowane w wystarczająco niskiej gęstości, aby umożliwić zachowanie komórek w cienkiej warstwie szklistego lodu. Często obszar zainteresowania jest ograniczony do określonej funkcji lub podobszaru komórki. Dodatkowym ograniczeniem przepustowości jest skłonność komórek do wzrostu w obszarach, które nie nadają się do obrazowania TEM, takich jak na paskach siatki TEM lub w ich pobliżu. Ze względu na nieprzewidywalne czynniki związane z hodowlą komórkową na siatkach TEM, konieczne jest osiągnięcie postępu technologicznego w celu poprawy dostępności próbek i przepustowości do pozyskiwania danych.
Mikrowzorzec substratu z przylegającymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest dobrze znaną techniką mikroskopii świetlnej żywych komórek do kierowania wzrostem komórek na sztywnych, trwałych i optycznie przezroczystych powierzchniach, takich jak szkło i inne podłoża do hodowli tkankowych13,14. Mikrowzory zostały również wykonane na miękkich i/lub trójwymiarowych (3D) powierzchniach. Takie techniki pozwoliły nie tylko na precyzyjne pozycjonowanie komórek; Wspierali również tworzenie sieci wielokomórkowych, takich jak wzorzyste obwody komórek nerwowych15. Wprowadzenie mikrowzorców do cryo-ET nie tylko zwiększy przepustowość, ale może również otworzyć nowe badania nad badaniem złożonych i dynamicznych mikrośrodowisk komórkowych.
Ostatnio, kilka grup zaczęło stosować techniki mikrowzorcowania na siatkach TEM za pomocą wielu podejść16,17. W tym miejscu opisano zastosowanie techniki fotomodelowania bez maski dla siatek TEM przy użyciu systemu mikromodelowania Alvéole PRIMO, który charakteryzuje się bezdotykowym wzornictwem o wysokiej rozdzielczości. W tym systemie mikrowzorcowania na wierzch podłoża nakładana jest warstwa przeciwporostowa, a następnie nakładany jest fotokatalizator i ablacja warstwy przeciwporostowej w zdefiniowane przez użytkownika wzory za pomocą lasera UV. Białka ECM można następnie dodać do wzorców dla odpowiedniej hodowli komórkowej. Metoda ta została wykorzystana przez kilka grup do badań krio-ET nabłonka barwnikowego siatkówki-1 (RPE1), nerki psa Madin-Darby-II (MDCKII), ludzkiego fibroblastu napletka (HFF) i linii komórek śródbłonka16,17,18. Ten system mikrowzorów jest kompatybilny z wieloma podłożami warstw przeciwporostowych, a także z płynnym lub żelowym odczynnikiem fotokatalizatora. Można wybierać różne białka ECM i dostosowywać je do specyfiki linii komórkowej, zapewniając użytkownikowi wszechstronność.
Mikrowzorcowanie zostało z powodzeniem zastosowane w wielu projektach w laboratorium19. W tym miejscu przedstawiono protokół mikrowzorców, w tym specyficzne adaptacje do badania hodowanych komórek HeLa, komórek BEAS-2B zakażonych syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) oraz pierwotnych neuronów larwalnych Drosophila melanogaster20.

<table><tbody><tr><td>0,1% (w/v) Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m filtry strzykawkowe Membrana PVDF</td><td>Genesee</td><td>25-240</td><td></td></tr><tr><td>22x60-1 Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>5/15 Pęseta</td><td>EMS (Dumont)</td><td>0203-5/15-PO</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (100X)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Komórki BEAS-2B</td><td>ATCC</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, bydlęcy</td><td>ThermoFisher ( Gibco)</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>C11254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher (Decon Labs)</td><td>22-032-600</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z ludzkiego osocza, Alexa Fluor 647 Sprzężony</td><td>ThermoFisher ( Invitrogen)</td><td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Białko bydlęce, Plasma</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>VWR</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do przygotowania siatki</td><td>EMS</td><td>71175-01</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>Hemacytometr ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher (SKC, Inc.)</td><td></td><td></td>22600100</tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC172572500</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Fisher (Sigma Aldrich)</td><td>NC0520015</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Bio</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC212595000</td><td></td></tr><tr><td>Leica-DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Można dostosować za pomocą przystawek do kamery, stolika i obiektywu</td></tr><tr><td>Leonardo</td><td>Alv&eacute; </td><td></td> ole <td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td></tr> <tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Fisher (Supply Solutions)</td><td>50-100-3280</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw żywotności/cytotoksyczności</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Hammamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stage</td><td>M&auml; RZH&AUML; użytkownik Wetzlar</td><td>00-24-599-0000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC207802500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher (Alfa Aesar)</td><td>AAA1603736</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Szablony PDMS</td><td>nanoscaleLABS</td><td></td><td>PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td></tr> <tr><td>PEG-SVA</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PEG-SVA-1GR</td><td>mPEG-Succinimidyl Valerianian, MW 5,000</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Fisher (Research Products International Corp)</td><td>50-213-641</td><td></td></tr><tr><td>Paski pH</td><td>Fisher (Millipore Sigma)</td><td>M1095350001</td> Można <td>również użyć sondy pH</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PLPP-GEL-300UL</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td></tr> <tr><td>PRIMO</td><td>Alv&eacute; </td><td></td> ole <td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td></tr> <tr><td>pSynkRSV-I19F (BAC zawierający antygenomiczne cDNA RSV A2-mK+ )</td><td>BEI Resources</td><td>NR-36460</td><td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td></tr><tr><td>Siatki Quantifoil</td><td>EMS (Quantifoil)</td><td>Q2100AR1</td><td>2 &mikro; m otwory rozstawione co 1 i mikro; m od siebie, dostępne są inne wymiary</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>RSV A2-mK+</td><td>patrz wpis dla pSynkRSV-19F-Opisany</td><td></td> <td>w Hotard et al. [22]. Może być wygenerowany z pSynkRSV-ll9F</td></tr><tr><td>Schneider's Media</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td><td></td><td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td></tr> <tr><td>Pęseta prosta</td><td>EMS (Dumont)</td><td>72812-D</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Avantor</td><td>4097-04</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>T8032-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy Titan Krios</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>300kV, z kamerą bezpośredniego detektora elektronów i filtrem energii</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Rewolwer/Rotator</td><td>lampowy Fisher (Thermo Scientific)</td><td>11676341</td><td></td></tr><tr><td>UAS: mcD8: GFP Szczep muchy</td><td>Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5146</td><td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td></tr></tbody></table>

mikrowzorce transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tomografia krioelektronowa całych komórek (cryo-ET) to potężna technologia, która jest używana do wytwarzania struktur o rozdzielczości nanometrowej makrocząsteczek obecnych w kontekście komórkowym i zachowanych w stanie zbliżonym do natywnego zamrożonego i uwodnionego. Istnieją jednak wyzwania związane z hodowlą i/lub przyleganiem komórek do siatek TEM w sposób odpowiedni do tomografii przy jednoczesnym zachowaniu komórek w ich stanie fizjologicznym. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący wykorzystania mikrowzorców do kierowania i promowania wzrostu komórek eukariotycznych na siatkach TEM. Podczas mikrowzorcowania wzrost komórek jest kierowany poprzez osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w określonych wzorach i pozycjach na folii siatki TEM, podczas gdy inne obszary pozostają pokryte warstwą przeciwporostową. Elastyczność w doborze powłoki powierzchniowej i projektowania wzoru sprawia, że mikrotworzenie wzorów ma szerokie zastosowanie w szerokim zakresie typów komórek. Mikrowzorce są przydatne do badań struktur w obrębie pojedynczych komórek, a także do bardziej złożonych systemów eksperymentalnych, takich jak interakcje gospodarz-patogen lub zróżnicowane społeczności wielokomórkowe. Mikrowzorce można również zintegrować z wieloma dalszymi procesami pracy cryo-ET dla całych komórek, w tym z korelacyjną mikroskopią świetlną i elektronową (cryo-CLEM) oraz mieleniem wiązki jonów (cryo-FIB).

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Nasz zespół badawczy opracowuje technologie i protokoły dla mikroskopii krioelektronowej i kriotomografii elektronowej. Opracowaliśmy protokoły mikrowzorcowania siatek TEM w celu kierowania wzrostem i pozycjonowaniem komórek w eksperymentach z krio-ET. Krioelektronowa tomografia całych komórek służy do wytwarzania struktur kompleksów makromolekularnych o rozdzielczości nanometrowej w komórkach zachowanych w natywnym zamrożonym stanie uwodnionym.Mikrowzorce mogą zwiększyć przepustowość eksperymentów z krio-ET dla całych komórek, kriokorelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych i kriogenicznego mielenia wiązką jonów. Liczba i rozmieszczenie komórek na siatkach EM mają kluczowe znaczenie dla badań krio-ET w całych komórkach. Protokół ten zapewnia szybką, powtarzalną i szeroko adaptowalną metodę kierowania wzrostem komórek na siatkach EM poprzez mikrowzorzec.Badacz powinien swobodnie korzystać z pipet, pęsety, podstawowych technik hodowli komórkowych oraz fluorescencyjnych i transmisyjnych mikroskopów elektronowych. Podczas tworzenia wzoru po raz pierwszy użyj dobrze znanej kombinacji typu komórek i ECM i przetestuj je na szkiełkach nakrywkowych lub szalkach MatTek. Członkami zespołu badawczego zaangażowanymi w opracowanie tego protokołu są: dr Brian Sibert, pan Joseph Kim i dr Jae Yang. Aby rozpocząć, przenieś kratki do uchwytu do przygotowania siatki i rozładowuj żar kratki stroną węglową do góry. Następnie przenieś kratki stroną węglową do góry na czyste szkiełko lub szkiełko nakrywkowe z zachowaniem co najmniej jednego centymetra odstępu między kratkami.Pobrać pipety z 10 mikrolitrów 0,05 poli-L-lizyny na każdą siatkę i inkubować siatki w wilgotnej komorze przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji umyj każdą siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami 0,1 molowego HEPES-u o pH 8,5. Inkubuj siatkę w każdym praniu przez 30 sekund, a następnie usuń większość płynu z kratki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki.Po ostatnim praniu pozostaw każdą siatkę w 15 mikrolitrach 0,1 molowej HEPES. Następnie należy przygotować roztwór PEG-SVA i natychmiast zastąpić roztwór HEPES na kratkach 10 mikrolitrami roztworu PEG-SVA, a następnie inkubować kratki w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę. Po inkubacji umyj każdą siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami sterylnej wody, inkubując siatkę w każdym praniu przez 30 sekund.Po ostatnim praniu pozostaw każdą kratkę w 15 mikrolitrach wody. Umieść jedną mikrolitrową kroplę wody na środku nowego czystego szkiełka nakrywkowego, a następnie ostrożnie przenieś siatkę z kropli wody o pojemności 15 mikrolitrów do kropli na nowym szkiełku nakrywkowym stroną z włókna węglowego do góry. Następnie ostrożnie umieść szablon PDMS nad siatką, utrzymując siatkę wyśrodkowaną i minimalizując kontakt szablonu z folią węglową siatki.Następnie dodaj jeden mikrolitr żelu PLPP na siatkę i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatką w ciemne miejsce do wyschnięcia. Żel wyschnie w ciągu 15 do 30 minut.W przypadku tworzenia mikrowzorów otwórz oprogramowanie z widokiem Brightfield na żywo z mikroskopu. Aby zaprojektować nowy szablon dla początkowego uruchomienia, wybierz opcję Dodaj zwrot z inwestycji i wybierz okrąg o średnicy 3 000 mikrometrów. Ustaw okrągły ROI nad siatką, korzystając z obrazu Brightfield na ekranie jako przewodnika, a następnie naciśnij Zablokuj, aby zabezpieczyć ROI.Po zablokowaniu zwrotu z inwestycji w miejscu wybierz Dodaj wzór i wybierz odpowiedni wzór. Korzystając z opcji replikacji, wygeneruj kopie początkowego wzorca, aby utworzyć kwadratowy region siatki osiem na osiem. W razie potrzeby dostosuj odstępy i kąt, aby wyrównać wzory z kwadratami siatki.Umieść wzór w jednym z rogów siatki. Następnie zduplikuj wzór i umieść kopię w każdym z czterech rogów siatki, przesuwając stolik mikroskopu w razie potrzeby dla każdego regionu. Użyj opcji replikacji, aby zmodyfikować kwadratowy region siatki o wymiarach osiem na osiem w kwadratowy region siatki o wymiarach dwa na osiem, który ma zostać umieszczony po obu stronach środka.Pozostaw środkowe cztery kwadraty siatki bez wzoru. Dla każdego wzorca, w razie potrzeby dostosować całkowitą dawkę. 30 milidżuli na milimetr kwadratowy to dobry punkt wyjścia.W obszarze Opcje zaawansowane wykonaj iterację, dopasowując kąt, położenie, odstęp między wzorkami i ich stosunek, aby poprawić wyrównanie wzoru do kwadratów siatki. Przesuń stolik mikroskopu, aby zmienić obszar siatki na wyświetlaczu Brightfield. Po umieszczeniu szablonu i wzorów odznacz wszystkie regiony oprócz jednego w panelu sterowania oprogramowania.Użyj stolika mikroskopu, aby przejść do tego obszaru i skup się na folii węglowej. Kliknij ikonę gałki ocznej w panelu sterowania, aby wyłączyć wyświetlanie nakładki wzoru. Gdy siatka jest ostra, zamknij migawkę Brightfield i naciśnij ikonę Odtwórz w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć proces tworzenia wzoru, który można monitorować na żywo.Powtarzaj ten krok, aż wszystkie regiony zostaną utworzone we wzorze. Na koniec należy zdjąć szkiełko nakrywkowe z siatką z mikroskopu i natychmiast dodać 10 mikrolitrów sterylnego PBS na siatkę. Po 10 minutach usuń szablon pęsetą, a następnie umyj siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami PBS i pozostaw każdą siatkę w PBS w ciemnym miejscu.Przygotuj 15 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej dla każdej siatki, a następnie zastąp PBS z każdej siatki 15 mikrolitrami macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubuj siatkę w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę. Po inkubacji przemyć każdą siatkę pięciokrotnie 15 mikrolitrami sterylnego PBS, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim praniu pozostaw każdą siatkę w PBS.Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wykryj fluorofor w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostaje nienaruszona. Komórki HeLa wysiane na mikrowzorzystych i niewzorzystych siatkach TEM są widoczne przez barwienie fluorescencyjne przy użyciu testu żywotności komórek opartego na kalceinie AM i etydynie-1. Wykorzystując mieszaną macierz zewnątrzkomórkową kolagenu i fibrynogenu, komórki HeLa łatwo przylegają do wzorców w całej siatce.Ogólna morfologia komórek, które rozszerzyły się wzdłuż wzoru, jest podobna do morfologii komórek wyhodowanych na niewzorzystych siatkach. Obraz w jasnym polu komórek BEAS-2B zakażonych wirusem RSV 18 godzin po wysiewie pokazuje adhezję i wzrost komórek wzdłuż centralnego obszaru wzoru. Większość zainfekowanych komórek jest umieszczona wzdłuż centralnego obszaru gradientu o większej gęstości.Warianty RSV znajdują się blisko peryferii zakażonych komórek BEAS-2B hodowanych na siatkach z mikrowzorami. W tomogramach zidentyfikowano wiele białek strukturalnych RSV, w tym nukleokapsyd i białko fuzyjne wirusa. Na mikrowzorzystych siatkach neurony Drosophila z panneuronalną ekspresją GFP można łatwo śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej ze względu na znakowanie fluorescencyjne i ich lokalizację w mikrowzorcach.Neurony na niewzorzystych siatkach mogą być również śledzone za pomocą sygnalizacji GFP za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak zlokalizowanie ich w mikroskopii krioelektronowej staje się trudne ze względu na szczątki komórkowe i zanieczyszczenie pożywką. Ze względu na wymiary ciała komórki neuronalnej i wydłużone neuryty, serie pochyleń krio-tomografii elektronowej są zbierane wzdłuż cieńszych obszarów komórek przy większym powiększeniu.Błona komórkowa neuronów, mitochondria, mikrotubule, włókna aktynowe, struktury pęcherzykowe i makrocząsteczki, takie jak rybosomy, są dobrze rozdzielone w montażach obrazów o większym powiększeniu i przekrojach przez tomogram 3D. Podobne cechy subkomórkowe obserwuje się na podstawie tomogramów 3D neuronów bez wzoru. Nakładanie szablonu na siatkę i dodawanie żelu PLPP jest najbardziej wrażliwym krokiem, który może mieć wpływ na wyniki wzoru i należy go wykonywać ostrożnie.Cryo-CLEM może być używany do lokalizowania celów zainteresowania w komórkach w celu zbierania danych Cryo-ET. Cryo-FIB-SEM może być używany do rozrzedzania komórek na obszarach, które w przeciwnym razie byłyby zbyt grube do zbierania danych.

micropatterning-transmission-electron-microscopy-grids-to-direct-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę mikrowzorowania siatek TEM do bezpośredniego pozycjonowania komórek w kriotomografii elektronowej całej komórki. Ta technika zwiększa przepustowość badań cryo-ET i umożliwia obrazowanie struktur komórkowych w stanie natywnym.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki (Wideo) | JoVE Journal

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Przeglądaj więcej filmów