Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Nasz zespół badawczy opracowuje technologie i protokoły dla mikroskopii krioelektronowej i kriotomografii elektronowej. Opracowaliśmy protokoły mikrowzorcowania siatek TEM w celu kierowania wzrostem i pozycjonowaniem komórek w eksperymentach z krio-ET. Krioelektronowa tomografia całych komórek służy do wytwarzania struktur kompleksów makromolekularnych o rozdzielczości nanometrowej w komórkach zachowanych w natywnym zamrożonym stanie uwodnionym.

Mikrowzorce mogą zwiększyć przepustowość eksperymentów z krio-ET dla całych komórek, kriokorelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych i kriogenicznego mielenia wiązką jonów. Liczba i rozmieszczenie komórek na siatkach EM mają kluczowe znaczenie dla badań krio-ET w całych komórkach. Protokół ten zapewnia szybką, powtarzalną i szeroko adaptowalną metodę kierowania wzrostem komórek na siatkach EM poprzez mikrowzorzec.

Badacz powinien swobodnie korzystać z pipet, pęsety, podstawowych technik hodowli komórkowych oraz fluorescencyjnych i transmisyjnych mikroskopów elektronowych. Podczas tworzenia wzoru po raz pierwszy użyj dobrze znanej kombinacji typu komórek i ECM i przetestuj je na szkiełkach nakrywkowych lub szalkach MatTek. Członkami zespołu badawczego zaangażowanymi w opracowanie tego protokołu są: dr

Brian Sibert, pan Joseph Kim i dr Jae Yang. Aby rozpocząć, przenieś kratki do uchwytu do przygotowania siatki i rozładowuj żar kratki stroną węglową do góry. Następnie przenieś kratki stroną węglową do góry na czyste szkiełko lub szkiełko nakrywkowe z zachowaniem co najmniej jednego centymetra odstępu między kratkami.

Pobrać pipety z 10 mikrolitrów 0,05 poli-L-lizyny na każdą siatkę i inkubować siatki w wilgotnej komorze przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji umyj każdą siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami 0,1 molowego HEPES-u o pH 8,5. Inkubuj siatkę w każdym praniu przez 30 sekund, a następnie usuń większość płynu z kratki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki.

Po ostatnim praniu pozostaw każdą siatkę w 15 mikrolitrach 0,1 molowej HEPES. Następnie należy przygotować roztwór PEG-SVA i natychmiast zastąpić roztwór HEPES na kratkach 10 mikrolitrami roztworu PEG-SVA, a następnie inkubować kratki w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę. Po inkubacji umyj każdą siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami sterylnej wody, inkubując siatkę w każdym praniu przez 30 sekund.

Po ostatnim praniu pozostaw każdą kratkę w 15 mikrolitrach wody. Umieść jedną mikrolitrową kroplę wody na środku nowego czystego szkiełka nakrywkowego, a następnie ostrożnie przenieś siatkę z kropli wody o pojemności 15 mikrolitrów do kropli na nowym szkiełku nakrywkowym stroną z włókna węglowego do góry. Następnie ostrożnie umieść szablon PDMS nad siatką, utrzymując siatkę wyśrodkowaną i minimalizując kontakt szablonu z folią węglową siatki.

Następnie dodaj jeden mikrolitr żelu PLPP na siatkę i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatką w ciemne miejsce do wyschnięcia. Żel wyschnie w ciągu 15 do 30 minut.

W przypadku tworzenia mikrowzorów otwórz oprogramowanie z widokiem Brightfield na żywo z mikroskopu. Aby zaprojektować nowy szablon dla początkowego uruchomienia, wybierz opcję Dodaj zwrot z inwestycji i wybierz okrąg o średnicy 3 000 mikrometrów. Ustaw okrągły ROI nad siatką, korzystając z obrazu Brightfield na ekranie jako przewodnika, a następnie naciśnij Zablokuj, aby zabezpieczyć ROI.

Po zablokowaniu zwrotu z inwestycji w miejscu wybierz Dodaj wzór i wybierz odpowiedni wzór. Korzystając z opcji replikacji, wygeneruj kopie początkowego wzorca, aby utworzyć kwadratowy region siatki osiem na osiem. W razie potrzeby dostosuj odstępy i kąt, aby wyrównać wzory z kwadratami siatki.

Umieść wzór w jednym z rogów siatki. Następnie zduplikuj wzór i umieść kopię w każdym z czterech rogów siatki, przesuwając stolik mikroskopu w razie potrzeby dla każdego regionu. Użyj opcji replikacji, aby zmodyfikować kwadratowy region siatki o wymiarach osiem na osiem w kwadratowy region siatki o wymiarach dwa na osiem, który ma zostać umieszczony po obu stronach środka.

Pozostaw środkowe cztery kwadraty siatki bez wzoru. Dla każdego wzorca, w razie potrzeby dostosować całkowitą dawkę. 30 milidżuli na milimetr kwadratowy to dobry punkt wyjścia.

W obszarze Opcje zaawansowane wykonaj iterację, dopasowując kąt, położenie, odstęp między wzorkami i ich stosunek, aby poprawić wyrównanie wzoru do kwadratów siatki. Przesuń stolik mikroskopu, aby zmienić obszar siatki na wyświetlaczu Brightfield. Po umieszczeniu szablonu i wzorów odznacz wszystkie regiony oprócz jednego w panelu sterowania oprogramowania.

Użyj stolika mikroskopu, aby przejść do tego obszaru i skup się na folii węglowej. Kliknij ikonę gałki ocznej w panelu sterowania, aby wyłączyć wyświetlanie nakładki wzoru. Gdy siatka jest ostra, zamknij migawkę Brightfield i naciśnij ikonę Odtwórz w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć proces tworzenia wzoru, który można monitorować na żywo.

Powtarzaj ten krok, aż wszystkie regiony zostaną utworzone we wzorze. Na koniec należy zdjąć szkiełko nakrywkowe z siatką z mikroskopu i natychmiast dodać 10 mikrolitrów sterylnego PBS na siatkę. Po 10 minutach usuń szablon pęsetą, a następnie umyj siatkę trzykrotnie 15 mikrolitrami PBS i pozostaw każdą siatkę w PBS w ciemnym miejscu.

Przygotuj 15 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej dla każdej siatki, a następnie zastąp PBS z każdej siatki 15 mikrolitrami macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubuj siatkę w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę. Po inkubacji przemyć każdą siatkę pięciokrotnie 15 mikrolitrami sterylnego PBS, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim praniu pozostaw każdą siatkę w PBS.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wykryj fluorofor w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostaje nienaruszona. Komórki HeLa wysiane na mikrowzorzystych i niewzorzystych siatkach TEM są widoczne przez barwienie fluorescencyjne przy użyciu testu żywotności komórek opartego na kalceinie AM i etydynie-1. Wykorzystując mieszaną macierz zewnątrzkomórkową kolagenu i fibrynogenu, komórki HeLa łatwo przylegają do wzorców w całej siatce.

Ogólna morfologia komórek, które rozszerzyły się wzdłuż wzoru, jest podobna do morfologii komórek wyhodowanych na niewzorzystych siatkach. Obraz w jasnym polu komórek BEAS-2B zakażonych wirusem RSV 18 godzin po wysiewie pokazuje adhezję i wzrost komórek wzdłuż centralnego obszaru wzoru. Większość zainfekowanych komórek jest umieszczona wzdłuż centralnego obszaru gradientu o większej gęstości.

Warianty RSV znajdują się blisko peryferii zakażonych komórek BEAS-2B hodowanych na siatkach z mikrowzorami. W tomogramach zidentyfikowano wiele białek strukturalnych RSV, w tym nukleokapsyd i białko fuzyjne wirusa. Na mikrowzorzystych siatkach neurony Drosophila z panneuronalną ekspresją GFP można łatwo śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej ze względu na znakowanie fluorescencyjne i ich lokalizację w mikrowzorcach.

Neurony na niewzorzystych siatkach mogą być również śledzone za pomocą sygnalizacji GFP za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak zlokalizowanie ich w mikroskopii krioelektronowej staje się trudne ze względu na szczątki komórkowe i zanieczyszczenie pożywką. Ze względu na wymiary ciała komórki neuronalnej i wydłużone neuryty, serie pochyleń krio-tomografii elektronowej są zbierane wzdłuż cieńszych obszarów komórek przy większym powiększeniu.

Błona komórkowa neuronów, mitochondria, mikrotubule, włókna aktynowe, struktury pęcherzykowe i makrocząsteczki, takie jak rybosomy, są dobrze rozdzielone w montażach obrazów o większym powiększeniu i przekrojach przez tomogram 3D. Podobne cechy subkomórkowe obserwuje się na podstawie tomogramów 3D neuronów bez wzoru. Nakładanie szablonu na siatkę i dodawanie żelu PLPP jest najbardziej wrażliwym krokiem, który może mieć wpływ na wyniki wzoru i należy go wykonywać ostrożnie.

Cryo-CLEM może być używany do lokalizowania celów zainteresowania w komórkach w celu zbierania danych Cryo-ET. Cryo-FIB-SEM może być używany do rozrzedzania komórek na obszarach, które w przeciwnym razie byłyby zbyt grube do zbierania danych.