Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Nasza metoda preparacji pozwala na precyzyjną izolację komorowej niszy neurogennej, a zatem doskonale nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy. Główną zaletą tej metody preparacji jest to, że jest precyzyjna, wydajna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek, a jednocześnie jest kompatybilna ze spektrometrią mas do analizy proteomu. W tym protokole wyodrębniamy neurogenną niszę komory z mózgu myszy, ale metoda ta może być również stosowana u innych gatunków oraz w różnych stanach zdrowia i choroby.

Technika ta może wymagać pewnego treningu, zwłaszcza w przypadku cięć skalpelem podczas odsłaniania i ekstrakcji komorowej niszy neurogennej. Po eutanazji 8-10-tygodniowej myszy czarnej C57 / 6 samców, wyekstrahuj mózg przez ręczną sekcję i umieść go w naczyniu hodowlanym zawierającym lodowatą pożywkę do sekcji.

Za pomocą skalpela usuń opuszkę węchową, wykonując proste cięcie koronalne między opuszką węchową a wewnętrznym biegunem kory. Następnie usuń przedni biegun kory, wykonując cięcie koronalne, upewniając się, że boczne komory są widoczne w płaszczyźnie koronalnej. Następnie za pomocą nożyczek otwórz obie boczne komory od góry, zaczynając od odcinka strzałkowego od powierzchni kory do światła komory.

Wydłuż to cięcie w kształcie litery C zgodnie ze zgięciem komorowym. Następnie połącz końce ogonowe lewego i prawego nacięcia strzałkowego, stosując dodatkowe cięcie koronalne. Następnie usuń korę i ciało modzelowate pokrywające ściany komory przyśrodkowej.

Jeśli tkanka jest przyczepiona do ścian komory przyśrodkowej, wykonaj dodatkowe nacięcia lub unieś korę i ciało modzelowate nożyczkami, aby usunąć tkankę. Następnie za pomocą kleszczy należy usunąć korę i ciało modzelowate pokrywające komory boczne. Za pomocą kleszczy ostrożnie rozłóż ściany komór i usuń splot naczyniówkowy.

Następnie umieść mózg na szklanym szkiełku i umieść szkiełko na suchym lodzie, aby zamrozić mózg ze ścianami komór w konfiguracji otwartej. Przed sekcją upewnij się, że mózg jest przymocowany do płytki mocującej kriostat w tylnej części mózgu za pomocą podłoża do zamrożenia tkanek. Dodatkowo upewnij się, że żadne podłoże nie ma kontaktu z przodem mózgu, zwłaszcza w komorach.

Następnie wytnij odcinki koronalne mózgu o grubości od 50 do 100 mikrometrów aż do końca komory bocznej i zamontuj sekcje na szkiełkach podstawowych. Umieść szkiełka podstawowe na suchym lodzie pod mikroskopem preparacyjnym. Podnieś plastry z suchego lodu na 15 do 30 sekund, aby uzyskać krótkie, niepełne rozmrożenie, dzięki czemu zwarta mielina prążkowia będzie widoczna jako gęste białe kropki.

Następnie, za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela, oddziel strefę podwyściółkową od sąsiedniego prążkowia i przenieś ją jako cały kawałek lub podzielony na dwie do czterech części do probówki mikrowirówkowej za pomocą krawędzi schłodzonego skalpela. Następnie zrób to samo dla strefy przyśrodkowej komory. Związane z mieliną, glikoproteinowo-dodatnie wewnętrzne kapsułki prążkowia zostały zidentyfikowane w próbkach całościowych, ale rzadko w próbkach z kriosekcji i sekcji za pomocą immunohistochemii.

Zanieczyszczenie prążkowia w próbkach całościowych potwierdzono poprzez wzbogacenie białek mieliny w strefie podwyściółkowej w porównaniu z próbkami kory somato-czuciowej. W przeciwieństwie do tego, porównania tych białek markerowych mieliny w próbkach z kriosekcji i preparacji nie wykazały istotnych różnic w próbkach strefy podwyściółkowej i kory somato-czuciowej. Porównując wyniki spektrometrii mas między kriosekcją a mikrodysekcją wychwytu laserowego, mikrodysekcja wychwytu laserowego dała około połowę mniej ilościowo oznaczonych białek, chociaż czas pobierania tkanek był około dwa razy dłuższy.

Analiza głównych składowych ujawnia, że istnieje większa zmienność między próbkami pobranymi za pomocą mikrodysekcji wychwytu laserowego, przedstawionej jako kwadraty, niż wśród próbek pobranych za pomocą kriosekcji, przedstawionej jako koła. Test wzbogacania adnotacji 2D między kriosekcją a mikrodysekcją laserową dla stref wyściółki podwyściółkowej i przyśrodkowej ujawnił podobne wzbogacenie zarówno w metodach, jak i regionach dla białek związanych z przestrzenią zewnątrzkomórkową. Kriosekcja-sekcja zapewnia bardziej wiarygodną identyfikację i kwantyfikację neurogenezy w białkach macierzy zewnątrzkomórkowej związanych ze strefą podwyściółkową.

W przypadku tenascyny-C tylko kriosekcja wykazała wzbogacenie w strefie podwyściółkowej w porównaniu ze strefą wyściółki przyśrodkowej. Upewnij się, że sekcje mózgu na szkiełkach nie zostaną całkowicie rozmrożone. Ogólnie rzecz biorąc, dobrze jest przećwiczyć kroki procedury preparacji, aby uzyskać spójny wynik.

Metoda preparacji może być również stosowana z innymi metodami analizy białek, które mogą łatwo wykryć białka o bardzo niskiej obfitości, takie jak czynniki wzrostu i cytokiny. Ta metoda mikrodysekcji pozwoliła nam zidentyfikować nowy regulator neurogenezy i wierzymy, że pozwoli innym zidentyfikować inne regulatory neurogenezy w różnych kontekstach.