Name: Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Naucz się metody kriosekcji do precyzyjnej izolacji niszy neurogenicznej komór mózgowych myszy. Technika ta umożliwia głęboką ilościową analizę proteomu z minimalnym uszkodzeniem tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy serdecznie podziękować Mathiasowi Mannowi za umożliwienie nam przeprowadzenia dużej części eksperymentów w jego laboratorium, Fabianowi Coscia za pomoc w analizie LCM i proteomu, Tatianie Simon-Ebert za rozbiory wierzchołków oraz Korbinianowi Mayrowi i Igorowi Paronowi za ich pomoc techniczną. Z wdzięcznością dziękujemy za dofinansowanie przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych dla MG (SFB870, TFR274), UE (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC "NeuroCentro" dla MG), grant podoktorski Szwedzkiego Towarzystwa Badań Medycznych (SSMF, dla JK) oraz fundacje i fundusze KI (2020-01351, dla JK).

Wszystkie procedury eksperymentalne w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Niemiec i Unii Europejskiej i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz rząd Górnej Bawarii (Regierung von Oberbayern). Do eksperymentów wykorzystano tylko samce myszy C57Bl6 w wieku 8-10 tygodni.
1. Przygotowanie mózgu myszy (~ 15 min na mysz)
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę preparacyjną, dodając 5 ml 1 M HEPES (końcowe stężenie 10 mM) do 500 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS). 
	UWAGA: Czas przechowywania pożywki preparacyjnej (+4 °C) nie powinien przekraczać 2 tygodni.</li>
	<li>Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i ostrożnie przeprowadź sekcję mózgu. 
	UWAGA: Podczas badania ECM zaleca się, aby tkanka była niezmodyfikowana. Zwichnięcie szyjki macicy sprawia, że czas rozwarstwienia jest jak najkrótszy, zapobiegając w ten sposób w jak największym stopniu autotrawieniu enzymatycznemu po śmierci. Jeśli usunięcie krwi ma kluczowe znaczenie dla pytania badawczego, po prostu wykonaj transfuzję myszy za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przed usunięciem mózgu.</li>
	<li>Wyodrębnij mózg przez ręczną sekcję i umieść go w naczyniu hodowlanym zawierającym lodowato pożywkę do preparacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B - 1). 
	UWAGA: Trzymaj mózgi w podłożu preparacyjnym na lodzie przez cały czas sekcji.</li>
	<li>Usuń opuszkę węchową (OB) za pomocą skalpela (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B - 2) za pomocą prostego cięcia koronalnego między OB a przednim biegunem kory.</li>
	<li>Usuń przedni biegun kory za pomocą skalpela, używając cięcia koronalnego, aby boczne komory były widoczne w płaszczyźnie koronalnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B - 3). 
	UWAGA: Upewnij się, że cięcie koronalne jest wykonane ~5 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego; w przeciwnym razie część rostralna SSE/MEZ zostanie utracona.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek otwórz obie boczne komory od góry, zaczynając od odcinka strzałkowego od powierzchni kory do światła komory, i wydłuż to cięcie w kształcie litery C zgodnie ze zgięciem komory (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B - 4).</li>
	<li>Połącz końce ogonowe lewego i prawego nacięcia strzałkowego za pomocą dodatkowego cięcia koronalnego nożyczkami. 
	UWAGA: Trzy nacięcia tworzą teraz trapez i ułatwią usunięcie kory i ciała modzelowatego w następnym kroku.</li>
	<li>Usuń korę i ciało modzelowate pokrywające komory boczne za pomocą kleszczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B - 5). Następnie usuń korę i ciało modzelowate, które pokrywają ściany przyśrodkowej komory. Tutaj wykonaj dodatkowe nacięcia, jeśli tkanka jest przyczepiona do ścian komory przyśrodkowej, lub po prostu podnieś korę i ciało modzelowate nożyczkami, aby usunąć tkankę.</li>
	<li>Ostrożnie rozłóż ściany komór za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B - 6). Usuń splot naczyniówkowy za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Całkowite usunięcie splotu naczyniówkowego jest ważne, aby uniknąć zakłóceń w następujących etapach sekcji i uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia próbek z SSE/MEZ.</li>
	<li>Umieść mózg na szklanym szkiełku i umieść szklane szkiełko na suchym lodzie, aby zamrozić mózg. Utrzymuj ściany komór w konfiguracji otwartej. 
	UWAGA: Należy zapewnić wystarczającą odległość między bocznymi i przyśrodkowymi ścianami komory, aby ułatwić precyzyjną i wyłączną sekcję SEZ i MEZ. Jeśli tkanka skurczy się z powrotem do zamkniętej konfiguracji, użyj kleszczy, aby przymocować ścianki w żądanej pozycji podczas zamrażania. Unikanie uszkodzeń SSE/MEZ. Spróbuj przyłożyć minimalną siłę, głównie na górną krawędź otwartych komór.</li>
</ol>
2. Podział przygotowanego mózgu (~ 15 min na mysz)
<ol>
	<li>Wytnij odcinki koronalne mózgu o grubości 50-100 μm do końca komory bocznej za pomocą kriostatu i zamontuj skrawki na szkiełkach podstawowych. Upewnij się, że mózg jest przymocowany do płytki mocującej kriostat w tyłomózgowiu za pomocą pożywki OCT i że żaden OCT nie styka się z przodomózgowiem, zwłaszcza w komorach. 
	UWAGA: Pożywka OCT będzie zakłócać pomiary MS. Jeśli jednak tkanka zostanie wykorzystana do testu na przeciwciała, nie ma potrzeby wykluczania pożywki OCT. Nie zaleca się stosowania szkiełek z szkła powlekanego. Szkiełka powlekane wywierają zbyt dużą siłę adhezyjną na tkankę, utrudniając w ten sposób przemieszczanie się próbki tkanki z szkiełek do probówki mikrowirówkowej w kolejnych krokach.</li>
</ol>
3. Sekcja z wolnej ręki wycinków mózgu (~ 30 min na mysz)
<ol>
	<li>Umieść szkiełka podstawowe z wycinkami mózgu na suchym lodzie pod mikroskopem preparacyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C - 1).</li>
	<li>Przygotuj probówki do mikrowirówek na suchym lodzie i upewnij się, że probówki pozostają na suchym lodzie przez co najmniej 1 minutę, aby były wystarczająco zimne przed przeniesieniem próbki. 
	UWAGA: Używaj probówek do mikrowirówek wysokiej jakości, ponieważ niektóre probówki niskiej jakości mogą zrzucać plastik na kolejnych etapach trawienia tkanek związanych z pomiarami MS.</li>
	<li>Podnieś plastry z suchego lodu na 15-30 s, aby uzyskać krótkie, niepełne rozmrożenie i sprawić, że zwarta mielina prążkowia będzie widoczna jako gęste białe kropki. 
	UWAGA: Zlokalizowanie granicy między SSE a prążkowiem staje się wykonalne (Rysunek 1C - 2, patrz Rysunek 2A dla wykluczenia mieliny i porównania z metodą wholemount). Jeśli rozmrażanie trwa zbyt długo, proces ten można przyspieszyć, naciskając palec pokryty rękawicą na przeciwną stronę szkiełka podstawowego. Jednak ten manewr należy ćwiczyć, ponieważ łatwo dochodzi do nadmiernego rozmrażania.</li>
	<li>Oddzielić SSE za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela od sąsiedniego prążkowia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D).</li>
	<li>Przenieś SSE jako cały kawałek lub podzielony na 2-4 części do probówki mikrowirówkowej za pomocą krawędzi schłodzonego skalpela. Jeżeli tkanka ma być wykorzystana do innego rodzaju analizy niż stwardnienie rozsiane, należy przenieść próbkę tkanki do odpowiedniego pojemnika (np. płytki 96-dołkowej). 
	UWAGA: Przecięcie całkowicie zamrożonej tkanki może doprowadzić do jej szybkiego oderwania się i odpadnięcia ze szkiełka. Przecięcie całkowicie rozmrożonej tkanki prowadzi do rozpadu tkanki. Upewnij się, że tkanka nie jest ani całkowicie zamrożona, ani całkowicie rozmrożona.</li>
</ol>

<ol><li>Goodman, T., Hajihosseini, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+tanycytes-masters+and+servants+of+metabolic%2C+neuroendocrine%2C+and+neurogenic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 387(2015).</li>
<li>Chaker, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+neurogenesis+persists+in+the+aging+brain+and+is+controlled+by+energy-sensing+IGF-I+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway.</a> Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).</li>
<li>Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hippocampal+neurogenesis%3A+a+coming-of-age+story%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story.</a> Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).</li>
<li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+origin%2C+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+neurogenesis+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain.</a> PloS One. 9 (11), 111453(2014).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+and+three-dimensional+organization+of+the+subventricular+germinal+zone+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).</li>
<li>Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+ventricular-subventricular+zone+%28V-SVZ%29+and+olfactory+bulb+%28OB%29+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820(2016).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+microglia+on+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63 (8), 1394-1405 (2015).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
<li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfates+are+required+for+fibroblast+growth+factor-2-dependent+proliferation+and+maintenance+in+neural+stem+cells+and+for+epidermal+growth+factor-dependent+migration+of+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny.</a> Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).</li>
<li>Mercier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractones%3A+extracellular+matrix+niche+controlling+stem+cell+fate+and+growth+factor+activity+in+the+brain+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).</li>
<li>Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+brain+neurogenic+zones+revisited%3A+fractones+and+the+fibroblast%2Fmacrophage+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network.</a> Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).</li>
<li>Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractone+bulbs+derive+from+ependymal+cells+and+their+laminin+composition+influence+the+stem+cell+niche+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone.</a> Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+for+brain+and+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair.</a> eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+modeling+and+therapy+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).</li>
<li>Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+to+neural+stem+cells+by+a+chemical+cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail.</a> Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).</li>
<li>Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+reactivation+and+reprogramming+of+neural+stem+cells+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair.</a> Methods. 133, 3-20 (2018).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-mediated+conversion+of+NG2+glia+into+induced+neurons+in+the+injured+adult+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).</li>
<li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li>
<li>Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+conversion+of+SVZ-derived+committed+neuronal+precursors+after+ectopic+grafting+into+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).</li>
<li>Lepko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-derived+miR-204+regulates+the+number+of+quiescent+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain.</a> EMBO Journal. 38 (17), 100481(2019).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li>
<li>Angelidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+the+aging+lung+mapped+by+single+cell+transcriptomics+and+deep+tissue+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 963(2019).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+adult+neural+stem+cell+niche+proteome+identifies+key+regulators+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938(2010).</li>
<li>Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-less+nano-fractionator+for+high+sensitivity%2C+high+coverage+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Perez-Riverol, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRIDE+database+and+related+tools+and+resources+in+2019%3A+improving+support+for+quantification+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).</li>
<li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344 (6181), 319-324 (2014).</li>
<li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+brain+region-resolved+mouse+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Kerever, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+extracellular+matrix+structures+in+the+neural+stem+cell+niche+capture+the+neurogenic+factor+fibroblast+growth+factor+2+from+the+extracellular+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu.</a> Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+neurogenesis+decline+in+the+subventricular+zone+is+associated+with+specific+cell+cycle+regulation+changes+in+activated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells.</a> Scientific Reports. 6, 21505(2016).</li>
<li>Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+rejuvenation+of+neural+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches.</a> Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).</li>
<li>Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+environment%3A+at+the+interface+of+aging+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis.</a> Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).</li>
<li>Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dentate+neurogenesis+after+brain+injury+undermines+long-term+neurogenic+potential+and+promotes+seizure+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).</li>
<li>Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+hypoxia-ischemia+in+rat+elicits+a+region-specific+neurotrophic+response+in+SVZ+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26(2020).</li>
<li>Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+as+neural+stem+or+progenitor+cells%3A+In+vivo+lineage%2C+In+vitro+potential%2C+and+Genome-wide+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis.</a> Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).</li>
<li>Kernie, S. G., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+neurogenesis+after+focal+Ischemic+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury.</a> Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).</li>
<li>Pous, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+induces+neural+stem+cell+differentiation+into+astrocytes+in+the+subventricular+zone+via+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling.</a> Nature Communications. 11 (1), 630(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów

Metoda CSD umożliwiła precyzyjną ekstrakcję tkanki SSE i wygenerowanie wiarygodnego proteomu o znacznej głębokości przy użyciu MS. CSD wykazuje wyraźną przewagę w porównaniu z rozwarstwieniem całościowym pod względem znacznie zmniejszonego zanieczyszczenia prążkowia próbek SSE i wzbogacenia białek zewnątrzkomórkowych. Ponieważ możliwe jest również wykrycie podobnej liczby białek w pojedynczych próbkach (~6,500 białek na próbkę) za pomocą CSD i rozbioru całościowego, dodatkowy czas na CSD jest wart wysiłku. LCM zapewnia bardziej precyzyjną sekcję SEZ, ale osiągnął niższą głębokość proteomu, z zaledwie 3500 białkami na próbkę, pomimo stosowania tego samego protokołu MS co CSD (dopasowanie biblioteki i kwantyfikacja bez znaczników). Co ważne, zmienność była znacznie większa, prawdopodobnie ze względu na ośmiokrotnie dłuższy czas przygotowania próbki. PCA próbek otrzymanych za pomocą LCM i CSD ujawnia wyraźne rozdzielenie obu metod z ciasnymi klastrami specyficznymi dla regionu, silnie oddzielonymi od siebie. W przeciwieństwie do tego, próbki LCM wykazywały bardziej rozproszony rozkład, co prawdopodobnie częściowo wynika z długości przygotowania. Nie jest jasne, czy zebranie znacznie większej liczby próbek w dłuższym okresie dałoby proteom o takiej samej wytrzymałości i głębokości jak LCM. Obliczając oszacowanie, zebranie podobnej objętości próbki, jak w przypadku CSD, zajęłoby 5-8 razy więcej czasu w przypadku LCM, a nawet do 15 razy dłużej, gdyby uwzględniono próbki dostarczone do bibliotek widm peptydowych, a większość z nich w warunkach rozmrażania. Ponadto, biorąc pod uwagę dodatkowe zaburzenia tkanki niezbędne do LCM (barwienie tła, rozwarstwienie laserowe), LCM zapewnił niewielki, jeśli w ogóle, zysk w stosunku do CSD. W związku z tym CSD można uznać za bardziej odpowiednie do badań nad proteomem zewnątrzkomórkowym, w szczególności dla SSE.
Warto zauważyć, że jeśli obszar zainteresowania jest mniejszy niż SSE (np. badając tylko warstwę komórek wyściółki), podejście odręczne pozostaje w tyle za dokładnością LCM. Na przykład użycie CSD do oddzielenia warstwy wyściółkowej od warstwy podwyściółkowej jest trudne, ponieważ warstwa wyściółki ma tylko średnicę komórki, a rozgraniczenie w kierunku warstwy podwyściółkowej nie jest widoczne gołym okiem w świeżo zamrożonej tkance. W związku z tym LCM będzie lepszym wyborem niż CSD, jeśli precyzyjna sekcja w skali poniżej 50 μm jest ważniejsza niż nienaruszona tkanka lub utrzymanie krótkiego czasu sekcji. Jednak w przypadku regionów o szerokości 50 μm i większej precyzja CSD jest porównywalna z precyzją LCM do analizy białek ECM.
CSD już okazał się użyteczny, przyczyniając się do badania funkcjonalnej roli ECM w niszy neurogennej25. W związku z tym dalsze stosowanie CSD w SSE do różnych badań białek i proteomu (a nawet sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra) może prowadzić do wykrycia dalszych regulatorów neurogenezy, markerów aktywacji komórek macierzystych i głębszego zrozumienia fizjologii niszy komórek macierzystych SSE. Biorąc pod uwagę spadek neurogenezy w starzejącej się SSE37, zwięzła analiza zmian ECM w SSE u starszych i młodych myszy może pomóc w zrozumieniu dokładnych niszowych mechanizmów sprzyjających rozwojowi i utrzymaniu NSC 38,39. Ponadto wpływ stanu zapalnego i urazów na neurogenezę SSE jest dobrze znany 40,41,42,43. Wzbogacenie fibrynogenu pochodzenia krwiopochodnego w SSE po korowym uszkodzeniu mózgu i jego wpływ na astroglejogenezę i powstawanie blizn w SSE44 podkreśla potencjalny wpływ zmian mikrośrodowiska wywołanych traumą na fizjologię komórek macierzystych SSE. W związku z tym badanie proteomu SEZ-ECM w związku z uszkodzeniem mózgu za pomocą CSD może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów, za pomocą których urazy i stany zapalne wpływają na neurogenezę. Co ważne, metoda ta może mieć również zastosowanie w niszach neurogennych ludzkiego mózgu w zdrowiu i chorobie, ponieważ świeżo zamrożone tkanki często można uzyskać w wyniku operacji. Ponadto, biorąc pod uwagę różnice gatunkowe w neurogenezie dorosłych, fascynujące byłoby również zastosowanie metody CSD do innych gatunków, np. w połączeniu z neurogenezą prążkowia. Ponadto, dzięki innym metodom wykrywania białek, różnice w lokalnie wytwarzanych czynnikach wzrostu mogą być dokładnie i efektywnie badane za pomocą CSD dla SSE i MEZ (np. ELISA).
Wreszcie, procedura sekcji może być potencjalnie zmodyfikowana w celu dokładnej ekstrakcji innych obszarów mózgu, również w przypadku pytań badawczych niezwiązanych z neurogenezą. Na przykład CSD obejmuje krótki etap półrozmrażania, podczas którego zbita mielina jest widoczna jako białe obszary różniące się od bardziej przezroczystej resztkowej tkanki mózgowej. Przy prostej modyfikacji metody, cecha ta pozwoliłaby na precyzyjną sekcję tylko zwartej tkanki mielinowej ciała modzelowatego, która mogłaby zostać poddana analizie proteomicznej zmian związanych z urazem. Sugestią modyfikacji protokołu, która pozwoliłaby na rozwarstwienie ciała zrogowaciałego, jest pominięcie kroków 1.5-1.9 protokołu i przejście bezpośrednio do przygotowania odcinków koronalnych zamiast otwierania komór w celu udostępnienia SSE i MEZ. Następnie ułóż skrawki na suchym lodzie, na krótko podnieś i częściowo rozmroź plastry, a następnie po prostu usuń ciało modzelowate skalpelem. Preparat ten powinien być teraz gotowy do każdej analizy wymagającej skutecznego wypreparowania natywnej tkanki ciała modzelowatego.
Podsumowując, w pracy przedstawiono metodę mikrodyssekcji, która może być wykorzystana do wiarygodnej analizy proteomu niszy neurogennej komorowej. Dane te podkreślają kompatybilność i użyteczność metody CSD wraz z analizą proteomiczną mikrośrodowiska SSE opartą na państwach członkowskich. Połączenie precyzji, wydajności i minimalnych zaburzeń tkanek sprawia, że CSD jest cennym rozszerzeniem istniejących metod.

Ponieważ neurogeneza jest ograniczona w mózgu dorosłego, różne strategie naprawy ośrodkowego układu nerwowego znacznie skorzystałyby na lepszym zrozumieniu podstaw wymiany neuronów u dorosłych. Gryzonie pomogły nam zrozumieć podstawowe mechanizmy neurogenezy poporodowej, chociaż należy zauważyć, że neurogeneza dorosłych jest w dużym stopniu zależna od gatunku. U myszy istnieją trzy nisze dorosłych nerwowych komórek macierzystych (NSC). Podwzgórze jest niszą NSC dla dorosłych o potencjale neurogennym1,2, podczas gdy ciągła neurogeneza dorosłych jest głównie ograniczona do hipokampa3 i SSE bocznych ścian komór bocznych4,5,6. SSE jest największym regionem rozrodczym zawierającym NSC (komórki typu B), które przekształcają się w neuroblasty (komórki typu A) za pośrednictwem komórek progenitorowych wzmacniających tranzyt (komórki typu C). SSE zawiera 20-35% komórek typu B, 1-15% komórek typu C, 1-30% komórek typu A i 25-50% komórek wyściółki7. SSE charakteryzuje się złożoną mikroarchitekturą, z komórkami śródbłonka, komórkami mikrogleju i komórkami wyściółki znajdującymi się w niszy komórek macierzystych i wpływającymi na nią8,9,10. Chociaż neurony są rzadkie w SSE, aksony emanujące z odległych źródeł, takich jak prążkowie, brzuszny obszar nakrywki lub podwzgórze, docierają i wpływają na komórki typu B4. Unikalną cechą tej niszy komórek macierzystych jest oddzielenie miejsca proliferacji od miejsca różnicowania. Po proliferacji neuronalne komórki progenitorowe migrują na kilka milimetrów z SSE do opuszki węchowej, gdzie ostatecznie różnicują się w neurony i integrują się z istniejącymi wcześniej obwodami neuronalnymi. Badania nad wewnętrznymi programami komórkowymi związanymi z neurogenezą dostarczyły już wiedzy ważnej dla eksperymentalnych terapeutycznych strategii przeprogramowania i przeszczepiania komórek15,16,17,18,19,20. Jednak sygnały zewnętrzne komórki również regulują neurogenezę, a środowisko tkankowe może determinować neurogenny los komórek macierzystych11,12,14,21,22,23. W związku z tym kluczowe znaczenie ma badanie mikrośrodowiska nisz neurogennych i jego interakcji z komórkami macierzystymi.
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) i inne wydzielane białka stanowią dużą część mikrośrodowiska. Do dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji podejście proteomiczne jest lepiej odpowiednie niż podejście transkryptomiczne do określenia składu ECM ze względu na niską korelację między transkryptomem a poziomami białka dla ECM24,25. Ponadto istnieją istotne dowody na to, że niszowe regulatory w SSE nie są wytwarzane wyłącznie przez komórki zasiedlające samą niszę. Bardziej odległe miejsca, takie jak splot naczyniówkowy, wydzielają sygnały modulacyjne przekazywane do komórek macierzystych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego22,23. Badanie proteomu niszowego może pomóc w identyfikacji regulatorów niszowych obecnych w nisze niezależnie od ich miejsca produkcji, biorąc pod uwagę, że znaczna część mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego jest składana przez białka.
Aby pobrać mysią strefę komorową do bezstronnej analizy proteomicznej, wymagana jest metoda o wysokiej precyzji, polegająca na uchwyceniu cienkiej wstęgi przykomorowej o grubości ok. 50 μm zawierającej komórki macierzyste, z wyłączeniem tkanki sąsiedniego prążkowia. Co więcej, zaburzenia tkanek podczas sekcji muszą być zminimalizowane w celu analizy mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego, ponieważ rozpuszczalne białka, w tym czynniki wzrostu lub cytokiny, mogą być łatwo wypłukiwane. Chociaż możliwa jest analiza widm masowych utrwalonej tkanki, wymagany środek, taki jak paraformaldehyd, zmniejszy głębokość identyfikacji białka i może wprowadzić modyfikacje potranslacyjne. Powszechna selekcja SSE, np. w celu pobrania komórek do analizy sortowania komórek aktywowanej fluorescencją, usuwa całą SSE za pomocą nożyczek26. Ta standardowa sekcja jest szybka przy minimalnych zaburzeniach tkanek. Nie można jednak uniknąć zanieczyszczenia prążkowia próbek. I odwrotnie, LCM ma wyjątkową zaletę w postaci doskonałej precyzji precyzji sekcji. Jednak LCM może powodować zaburzenia tkanek, na przykład z powodu barwienia tła lub denaturacji białek spowodowanej laserem. Aby połączyć mocne strony rozwarstwienia całego układu i LCM, opracowano nowatorską metodę kompatybilną ze stwardnieniem rozsianym, zwaną kriosekcją (CSD) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-D). CSD umożliwia ekstrakcję SSE i rozwarstwienie SSE przyśrodkowych ścian komór bocznych (MEZ), które są idealnym, w większości nieneurogennym regionem kontrolnym dla SSE (patrz protokół). Niszowy proteom uzyskany w wyniku połączenia CSD i najnowocześniejszych metod MS okazał się przydatny do charakterystyki i identyfikacji nowych regulatorów w tej niszy dla dorosłych NSC25. W związku z tym metoda ta będzie przydatna do określenia składu białkowego tkanek SSE.

<table><tbody><tr><td>Kriostat CM3050S</td><td>Mikroskop</td> preparacyjny Leica <td></td><td></td></tr> Kleszcze <tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr 5SF, bardzo cienka końcówka Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>nr kat. 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli z CaCl2 i MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>nr kat. 24020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>nr kat. 15630</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>RS Francja</td><td>nr kat. BPB018</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock, PCR clean 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>nr kat. 0030123344</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, Vannas-Tubingen 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>nr kat. 15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe skalpele chirurgiczne</td><td>B. Braun</td><td>nr kat. 5518083</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>nr kat. 633180</td><td></td></tr><tr><td> Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor przeciwciała drugorzędowe (488, 555) (1/1,000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>nr kat. A-11001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>nr kat. D9542</td><td></td></tr><tr><td>świnka morska poliklonalna anty-DCX 1:500</td><td>Millipore</td><td>nr kat. AB2253,</td><td></td></tr> <tr><td>mysi monoklonalny anty-GFAP 1:500</td><td>Sigma</td><td>nr kat. G3893</td><td></td></tr><tr><td>mysi monoklonalny anty-MAG 1:400</td><td>Millipore</td><td>nr kat. MAB1567</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism wersja 9</td><td>GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>Perseus Wersja 1.6.10.50</td><td>Instytut Biochemii Maxa-Plancka, Monachium, Bawaria, Niemcy</td><td></td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do obrazowania ZEN</td>, <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

Podwyściółkowa nisza neurogenna składa się z wstęgi przykomorowej ściany bocznej komory bocznej. Strefa podwyściółkowa (SSE) to cienki i wyraźny obszar narażony na działanie komór i płynu mózgowo-rdzeniowego. Wyodrębnienie tej niszy pozwala na analizę mikrośrodowiska neurogennych komórek macierzystych. Jednak ekstrakcja małych tkanek do analizy proteomu jest wyzwaniem, zwłaszcza w celu utrzymania znacznej głębokości pomiaru i osiągnięcia niezawodnej odporności. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano nową metodę zwaną kriosekcją i rozwarstwieniem (CSD), łączącą wysoką precyzję z minimalnymi zaburzeniami tkanek. Metoda jest kompatybilna z najnowocześniejszymi metodami spektrometrii mas (MS), które pozwalają na wykrycie nisko występujących regulatorów niszowych. W badaniu tym porównano dane dotyczące CSD i jego proteomu z metodą i danymi uzyskanymi za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) i standardowej sekcji całościowej. Metoda CSD doprowadziła do dwukrotnego zwiększenia głębokości kwantyfikacji w czasie krótszym niż połowa czasu przygotowania w porównaniu z LCM, a jednocześnie wyraźnie przewyższyła precyzję precyzji sekcji całkowitej sekcji. W związku z tym CSD jest lepszą metodą zbierania SSE do analizy proteomu.

Po wykonaniu powyższych kroków próbki tkanek w probówkach do mikrocentryfugi są gotowe i odpowiednie do przygotowania próbek do MS. Po przygotowaniu próbek uzyskano ok. 5-7 μg peptydów na próbkę z SEZ lub MEZ od jednej myszy. Ostateczna ilość peptydów może jednak zależeć od zastosowanej metody przygotowania do MS. W poniższych porównaniach proteomów głębokość identyfikacji i kwantyfikacji białek (500-1 000 białek na próbkę) została zwiększona poprzez obliczeniowe dopasowanie widm peptydowych do bibliotek widm peptydowych stworzonych dla każdego regionu tkanki25,27. Należy zauważyć, że zastosowana tutaj metoda bezstratnego nanofrakcjonowania do tworzenia bibliotek widm peptydowych nie jest obecnie dostępna komercyjnie. Surowe dane MS analizowano przy użyciu oprogramowania MaxQuant28, osiągając dokładność masy w zakresie części na miliard (ppb)29. Środowisko MaxQuant umożliwia dopasowanie między seriami pomiarów MS. Zawartość białek oznaczono za pomocą algorytmu kwantyfikacji bezetykietowej (label-free quantification)30. Barwienie immunohistochemiczne wykonano na świeżo zamrożonych tkankach zgodnie z wcześniej opisanym protokołem25 (patrz Tabela materiałów).
Kriosekcjonowanie i mikrodysekcja 
Kompletne obszary SEZ i MEZ dorosłych myszy (n = 4) uzyskano metodą CSD (patrz Rysunek 1 oraz protokół). Korę somatosensoryczną (Cx) wypreparowano za pomocą nożyczek chirurgicznych. W analogiczny sposób wypreparowano tkanki od dodatkowych 4 myszy; jednakże wypreparowaną tkankę złączono w jedną próbkę na region w celu stworzenia biblioteki proteomowej (10 923 zidentyfikowanych białek), co miało na celu zwiększenie liczby identyfikacji i kwantyfikacji białek w poszczególnych próbkach25. W czterech pojedynczych próbkach (średnia ± SD) skwantyfikowano 6 673 ± 317,4 białek w SEZ oraz 6 747 ± 37,7 w MEZ. Wszystkie dane proteomiczne z MS zdeponowano w konsorcjum ProteomeXchange za pośrednictwem repozytorium partnerskiego PRIDE31, a numer dostępu dla opisanych tutaj proteomów to ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Porównanie z sekcją całego preparatu 
Sekcję całego preparatu przeprowadzono zgodnie ze standardowym protokołem26. Sekcja całego preparatu ujawniła podobną liczbę białek (około 6 000 dla SEZ i 6 000 dla Cx, n = 4 na grupę) w porównaniu do CSD25. Jednym z zamierzonych usprawnień wynikających z zastosowania CSD dla SEZ, zamiast protokołu sekcji całego preparatu, jest ograniczenie potencjalnego zanieczyszczenia tkanką prążkowia. W próbkach SEZ zanieczyszczonych tkanką z innego regionu, wykryte białka kandydackie nie mogą zostać przypisane do konkretnego regionu, ponieważ znaczne wzbogacenie może wynikać zarówno z regionu zainteresowania, jak i z zanieczyszczenia. W badaniu immunohistochemicznym w próbkach z sekcji całego preparatu zidentyfikowano dodatnie pod względem glikoproteiny związanej z mieliną (MAG) bogate w mielinę torebki wewnętrzne prążkowia, co rzadko występowało w próbkach CSD (Rycyna 2A). Zanieczyszczenie prążkowiem w próbkach z sekcji całego preparatu można było potwierdzić, identyfikując wzbogacenie białek mieliny w SEZ w porównaniu do próbek istoty szarej (GM) kory somatosensorycznej (Cx) (Rycina 2B). Należy zauważyć, że duże części GM kory Cx, zwłaszcza górne warstwy Cx, są niemielinizowane32.
Ponieważ duże pęczki włókien przechodzą przez prążkowie, zanieczyszczenie przez ten region doprowadziło do wzbogacenia w białka mieliny w porównaniu z Cx. Białkami mieliny wykorzystanymi jako markery zanieczyszczenia prążkowiem w próbkach SEZ były: podstawowe białko mieliny (MBP), glikoproteina związana z mieliną (MAG), proteolipidowe białko 1 (Plp1) oraz 2',3'-cykliczna nukleotydowa 3'-fosfodiesteraza (Cnp). Wszystkie białka markerowe mieliny były znacząco wzbogacone w SEZ w porównaniu z Cx. Odwrotnie, porównania czterech białek markerowych mieliny w zestawie danych CSD nie wykazały istotnych różnic podczas porównywania SEZ z Cx (Rysunek 2B). Dane proteomiczne prążkowia33 wspierają hipotezę, że wzbogacenie w białka mieliny w próbkach SEZ pobranych podczas sekcji całego narządu było spowodowane zanieczyszczeniem tkanką prążkowia. Zatem metoda CSD w znacznym stopniu zapobiegła zanieczyszczeniu tkanką prążkowia (bogatą w mielinę zwartą) w porównaniu z sekcją całego narządu.
Obiektywna analiza proteomu tkanek niedysocjowanych może ujawnić interesujące białka zewnątrzkomórkowe. Dzięki ulepszonej dyssekcji z wykorzystaniem CSD, białka związane z przestrzenią zewnątrzkomórkową były znacznie bardziej wzbogacone w próbkach w porównaniu do próbek pobranych metodą wholemount (Rysunek 2C, test wzbogacenia adnotacji). Metody CSD oraz dyssekcja wholemount wykazują porównywalne wzbogacenie terminów ontologii genów (GO) „extracellular vesicular exosome” oraz „extracellular region part”. Jednakże termin GO „Matrisome-associated” jest nieco bardziej wzbogacony w CSD niż w dyssekcji wholemount. W związku z tym, enzym sieciujący ECM oraz niedawno odkryty regulator neurogenezy, transglutaminaza-2 (Tgm2), okazały się wzbogacone w SEZ w porównaniu do Cx przy zastosowaniu CSD25. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono różnic między próbkami SEZ i Cx pobranymi metodą dyssekcji wholemount (Rysunek 2D). Dane proteomiczne prążkowia33 wspierają hipotezę, że wykrycie regulatora neurogenezy Tgm2 w dyssekcji wholemount było utrudnione przez kontaminację tkanką prążkowia. Zatem, ogólnie rzecz biorąc, cryo-section-dissection jest skutecznym, a zarazem niezbędnym ulepszeniem standardowej dyssekcji w celu analizy proteomu specyficznego dla niszy.
Porównanie z mikrodyssekcją laserową (LCM) 
Przednią połowę SEZ oraz MEZ od 3 dorosłych myszy pobrano do analizy LCM (Rysunek 3A ). Ogólnie rzecz biorąc, metoda LCM wykazuje pewne wady, szczególnie w odniesieniu do perturbacji tkanki i wydajności. Aby zwizualizować obszar zainteresowania pod mikroskopem sekcyjnym, konieczne jest barwienie tła, co może prowadzić do wypłukania małych lub rozpuszczalnych białek zainteresowania, np. czynników wzrostu, cytokin lub regulatorów ECM, takich jak enzymy. Ponadto preparaty na szkiełkach spędzają różną ilość czasu w temperaturze pokojowej podczas usuwania laserem. Co więcej, sam laser może denaturować analizowane białka.
CSD wykazuje znaczną przewagę nad LCM pod względem czasu i wysiłku niezbędnego do przeprowadzenia dyssekcji: krok 1 protokołu musi być wykonany analogicznie zarówno dla CSD, jak i LCM; bez tego kroku ściany komór pozostają zrośnięte, co utrudnia oddzielenie próbek MEZ i SEZ. Biorąc pod uwagę, że przekroje CSD (100 µm) są 6-7 razy grubsze niż maksymalna grubość34 przekrojów LCM (15 µm), krok 2 (wycinanie sekcji mózgu) i krok 3 (usuwanie MEZ i SEZ z każdego przekroju czołowego) zajmą w przypadku LCM co najmniej 6-7 razy więcej czasu. Niezbędne barwienie tła i konfiguracja mikroskopu laserowego pochłoną dodatkowy czas. W niniejszym przypadku pobranie 50% SEZ i MEZ od 3 zwierząt metodą LCM trwało trzykrotnie dłużej niż pobranie 100% SEZ i MEZ od 4 zwierząt metodą CSD, co stanowi ośmiokrotną przewagę prędkości CSD. Podsumowując, LCM nie tylko wymaga znacznego dodatkowego nakładu pracy, ale tkanka jest również poddawana znacznie dłuższemu okresowi manipulacji i zmian temperatury, co może wpłynąć na dynamikę i wiarygodność danych generowanych w późniejszych analizach.
Wyniki MS dla CSD porównano z wynikami uzyskanymi za pomocą laserowej mikrodysekcji (LCM). Oba zestawy danych dopasowano do biblioteki proteomicznej utworzonej poprzez połączenie próbek CSD. Średnio metodą LCM zidentyfikowano odpowiednio 3 441 ± 270,0 oraz 3 613 ± 238,7 pojedynczych białek w SEZ i przyśrodkowej strefie komorowej (Rysunek 3B). Ze względu na znaczną różnicę w identyfikacji białek, analiza głównych składowych (PCA) wykazała wyraźną separację w zależności od metody dysekcji (składowa 1: 62,7%, nie pokazano). Składowa 2 wykazała największą separację dla SEZ i MEZ wśród próbek LCM (8,5%, Rysunek 3C). Składowa 3 również wydaje się oddzielać LCM i CSD; jednakże różnica ta może wynikać z różnic metodycznych, a nie z liczby zidentyfikowanych białek (6,4%). Niemniej jednak ogólna separacja regionalna pozostała uderzająco wyraźna dla danych z krio-dysekcji i była znacznie lepsza niż dla LCM. Ta rozbieżność w dynamice danych może wynikać z różnego czasu przebywania preparatów w temperaturze pokojowej podczas dysekcji laserowej lub większej podatności małych ilości tkanki na zmienność w późniejszych protokołach proteomicznych i pomiarach spektrometrii mas.
W celu poszukiwania różnic w profilu proteomu ECM przeprowadzono test wzbogacenia adnotacji 2D pomiędzy CSD a LCM dla SEZ i MEZ (Rysunek 3D). Obliczenie względnego wzbogacenia terminów GO pomiędzy próbkami LCM a CSD umożliwia porównanie względnej dynamiki proteomu klastrów białek ECM między obiema metodami, pomimo nierównej ilości tkanki i różnic w protokole sekcji. Wykresy wykazują dobrą korelację pomiędzy LCM a CSD. Adnotacje „extracellular region part” oraz „extracellular membrane-bound organelle” są podobnie wzbogacone w obu metodach i regionach. Zatem zwiększony nakład czasu przy LCM nie wydaje się być rekompensowany względnie wyższą czułością w odniesieniu do białek związanych z ECM. Zamiast tego CSD zapewnia bardziej wiarygodną identyfikację/kwantyfikację przy porównaniu danych z próbek dla białek ECM związanych z neurogenezą i SEZ: Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6 oraz Tenacin-C (Tnc) (Rysunek 3E). W przypadku TnC, mimo że zostało ono skwantyfikowane we wszystkich próbkach, tylko CSD wykazało wzbogacenie dla SEZ w porównaniu do MEZ. Niemniej jednak białka błony podstawnej związane z SEZ: Nidogen-1 (Nid1), Laminin subunit beta-2 (Lamb2) oraz basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein (Hspg2)35 wykazały jeszcze silniejsze wzbogacenie w SEZ (w porównaniu do MEZ) w próbkach LCM niż w próbkach CSD (nie pokazano). Zatem CSD może dostarczać próbki tkankowe, które zapewniają dokładny i głęboki ilościowy proteom do charakteryzacji SEZ w rozsądnym czasie, bez obaw o naruszenie integralności tkanki lub utratę białek.
Statystyka 
Testy statystyczne, testy wzbogacenia adnotacji 2D oraz analiza PCA zostały przeprowadzone w środowisku Perseus. Białka włączono do analizy, jeśli dla każdej metody wykryto prawidłową wartość w co najmniej jednej próbce. Porównania obfitości i liczby białek zwizualizowano przy użyciu oprogramowania do analizy danych (patrz Tabela materiałów). Do porównań białek zastosowano kontrolę odsetka fałszywych odkryć (FDR) opartą na permutacjach (FDR ustawiono na 0,05, 250 randomizacji). W przypadku testów wzbogacenia adnotacji 2D36, wyświetlone terminy GO są istotnie wzbogacone (FDR ustawiono na 0,02 przy użyciu metody kontroli FDR Benjamini-Hochberga).
<img alt="Proces sekcji mózgu z identyfikacją SEZ/MEZ; schemat i wyniki mikroskopowe dla neurogenezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metoda sekcji mrożonych przekrojów (Cryo-Section-Dissection). (A) Przegląd obszaru zainteresowania: komora boczna z neurogenną strefą SEZ i nieneurogenną strefą MEZ. Neuroblasty wybarwione immunocytochemicznie na Dcx. (B) Etapy usuwania OB, bieguna przedniego, kory oraz ciała modzelowatego powyżej komór i splotów naczyniowych: 1. umieszczenie w medium do sekcji, 2. usunięcie OB, 3. usunięcie bieguna przedniego kory, 4. nacięcia strzałkowe górnej części komory, 5. usunięcie górnej części komory, 6. rozszerzenie ścian komory. (C) Coronalne przekroje o grubości 100 µm świeżomrożonego mózgu myszy, (1.) przed i (2.) po usunięciu ścian komory za pomocą schłodzonego skalpela. Paski skali = 4 mm (D) Barwienie przekroju coronalnego komory bocznej (GFAP: zielony; DAPI: niebieski), pokazujące SEZ i MEZ wypreparowane metodą CSD. Paski skali = 300 µm (A), 200 µm (D). Skróty: CSD = cryo-section dissection; SEZ = subependymal zone; MEZ = medial ependymal zone; Dcx = Doublecortin; OB = olfactory bulb; GFAP = glial fibrillary acidic protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda CSD, wykres zawartości białek mieliny, SEZ vs. sekcja całego preparatu, mikrografia MAG, barwienie DAPI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wyższa precyzja dysekcji w przypadku sekcji mrożonej w porównaniu do sekcji całego preparatu. (A) Obraz immunohistochemiczny próbki SEZ uzyskanej metodą sekcji całego preparatu (lewo). Obecność tkanki prążkowia bogatej w mielinę jest uwidoczniona poprzez barwienie przeciwko MAG (zielony). Barwienie SEZ wyizolowanej metodą CSD (prawo). W metodzie CSD prawie cała mielina prążkowia (barwienie przeciwko MAG, zielony) jest wykluczona z paska próbek. Jądra komórkowe uwidoczniono za pomocą DAPI (niebieski). (B) Porównanie wzbogacenia markerów mieliny w SEZ vs. Cx w przypadku sekcji całego preparatu (MBP: p = 0.0074; MAG: p = 0.0016; Plp1: p = 0.0011; CNP: p = 0.0029) oraz CSD (MBP: p = 0.0667; MAG: p = 0.0236; Plp1: p = 0.3420; CNP: p = 0.1842). (C) Test wzbogacenia adnotacji 2D porównujący próbki SEZ z sekcji całego preparatu i SEZ z metody CSD. Terminy GO extracellular space oraz Matrisome-associated są bardziej wzbogacone w danych CSD niż w danych z sekcji całego preparatu. (D) Zawartość białka regulatora NSC Tgm225 przedstawiona dla sekcji całego preparatu i metody CSD. Tgm2 jest znacząco wzbogacone w SEZ w porównaniu do Cx w metodzie CSD (CSD: p = 0.0029; Wholemount: p = 0.1775). Dla B i D: Jako odniesienie, dane proteomiczne z pracy Sharma et al.33 z pomiarami prążkowia i kory przedstawione dla odpowiadających białek wykazanych w próbkach z sekcji całego preparatu i CSD. Paski skali = 200 µm (A). Skróty: CSD = cryo-section dissection (sekcja mrożona); SEZ = subependymal zone (strefa podependymała); MAG = myelin-associated glycoprotein; Cx = somatosensory cortex (kora somatosensoryczna); MBP = myelin basic protein; Plp1 = proteolipid-protein 1; CNP = 2',3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase; GO = gene ontology; NSC = neural stem cell (neuralna komórka macierzysta); Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LFQ = label-free quantitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie precyzji dyssekcji: LCM vs CSD; analiza proteomu, porównanie danych, wyniki MEZ SEZ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Poprawa ilościowego oznaczania białek zewnątrzkomórkowych przy użyciu dyssekcji z przekrojów mrożonych (CSD) w porównaniu do LCM. (A) Barwienie fioletem krezylowym komory bocznej przed i po laserowej mikrodysekcji SEZ i MEZ (lewo). Dla porównania, nacięcie CSD obszarów SEZ i MEZ (prawo). Paski skali = 150 µm. (B) Porównanie liczby wykrytych białek w próbkach SEZ i MEZ uzyskanych metodą CSD i LCM. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (C) Analiza głównych składowych próbek SEZ i MEZ z porównaniem CSD i LCM (składowa 2: 8,5% wariancji; składowa 3: 6,4%). (D) 2D analiza wzbogacenia adnotacji dla obszarów MEZ (góra) i SEZ (dół) wyizolowanych za pomocą dyssekcji z przekrojów mrożonych i laserowej. Terminy GO extracellular organelle oraz extracellular region part są znacząco wzbogacone (czerwone kropki). (E) Obfitość zewnątrzkomórkowych białek markerowych związanych z SEZ w obszarach SEZ i MEZ dla LCM (Tnc: p = 0,3789) oraz próbek CSD (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Skróty: CSD = cryo-section dissection; LCM = laser-capture-microdissection; SEZ = subependymal zone; MEZ = medial ependymal zone; GO = gene ontology; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 calcium-binding protein A6; THBS4 = thrombospondin-4; LFQ = label-free quantitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Sekcja kriogeniczna pozwala na świeże, zamrożone przygotowanie największej niszy neurogennej w mysim mózgu do głębokiej ilościowej analizy proteomu. Metoda jest precyzyjna, skuteczna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek. Dlatego idealnie nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy, a także innych narządów, regionów i gatunków.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Nasza metoda preparacji pozwala na precyzyjną izolację komorowej niszy neurogennej, a zatem doskonale nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy. Główną zaletą tej metody preparacji jest to, że jest precyzyjna, wydajna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek, a jednocześnie jest kompatybilna ze spektrometrią mas do analizy proteomu. W tym protokole wyodrębniamy neurogenną niszę komory z mózgu myszy, ale metoda ta może być również stosowana u innych gatunków oraz w różnych stanach zdrowia i choroby.Technika ta może wymagać pewnego treningu, zwłaszcza w przypadku cięć skalpelem podczas odsłaniania i ekstrakcji komorowej niszy neurogennej. Po eutanazji 8-10-tygodniowej myszy czarnej C57 / 6 samców, wyekstrahuj mózg przez ręczną sekcję i umieść go w naczyniu hodowlanym zawierającym lodowatą pożywkę do sekcji.Za pomocą skalpela usuń opuszkę węchową, wykonując proste cięcie koronalne między opuszką węchową a wewnętrznym biegunem kory. Następnie usuń przedni biegun kory, wykonując cięcie koronalne, upewniając się, że boczne komory są widoczne w płaszczyźnie koronalnej. Następnie za pomocą nożyczek otwórz obie boczne komory od góry, zaczynając od odcinka strzałkowego od powierzchni kory do światła komory.Wydłuż to cięcie w kształcie litery C zgodnie ze zgięciem komorowym. Następnie połącz końce ogonowe lewego i prawego nacięcia strzałkowego, stosując dodatkowe cięcie koronalne. Następnie usuń korę i ciało modzelowate pokrywające ściany komory przyśrodkowej.Jeśli tkanka jest przyczepiona do ścian komory przyśrodkowej, wykonaj dodatkowe nacięcia lub unieś korę i ciało modzelowate nożyczkami, aby usunąć tkankę. Następnie za pomocą kleszczy należy usunąć korę i ciało modzelowate pokrywające komory boczne. Za pomocą kleszczy ostrożnie rozłóż ściany komór i usuń splot naczyniówkowy.Następnie umieść mózg na szklanym szkiełku i umieść szkiełko na suchym lodzie, aby zamrozić mózg ze ścianami komór w konfiguracji otwartej. Przed sekcją upewnij się, że mózg jest przymocowany do płytki mocującej kriostat w tylnej części mózgu za pomocą podłoża do zamrożenia tkanek. Dodatkowo upewnij się, że żadne podłoże nie ma kontaktu z przodem mózgu, zwłaszcza w komorach.Następnie wytnij odcinki koronalne mózgu o grubości od 50 do 100 mikrometrów aż do końca komory bocznej i zamontuj sekcje na szkiełkach podstawowych. Umieść szkiełka podstawowe na suchym lodzie pod mikroskopem preparacyjnym. Podnieś plastry z suchego lodu na 15 do 30 sekund, aby uzyskać krótkie, niepełne rozmrożenie, dzięki czemu zwarta mielina prążkowia będzie widoczna jako gęste białe kropki.Następnie, za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela, oddziel strefę podwyściółkową od sąsiedniego prążkowia i przenieś ją jako cały kawałek lub podzielony na dwie do czterech części do probówki mikrowirówkowej za pomocą krawędzi schłodzonego skalpela. Następnie zrób to samo dla strefy przyśrodkowej komory. Związane z mieliną, glikoproteinowo-dodatnie wewnętrzne kapsułki prążkowia zostały zidentyfikowane w próbkach całościowych, ale rzadko w próbkach z kriosekcji i sekcji za pomocą immunohistochemii.Zanieczyszczenie prążkowia w próbkach całościowych potwierdzono poprzez wzbogacenie białek mieliny w strefie podwyściółkowej w porównaniu z próbkami kory somato-czuciowej. W przeciwieństwie do tego, porównania tych białek markerowych mieliny w próbkach z kriosekcji i preparacji nie wykazały istotnych różnic w próbkach strefy podwyściółkowej i kory somato-czuciowej. Porównując wyniki spektrometrii mas między kriosekcją a mikrodysekcją wychwytu laserowego, mikrodysekcja wychwytu laserowego dała około połowę mniej ilościowo oznaczonych białek, chociaż czas pobierania tkanek był około dwa razy dłuższy.Analiza głównych składowych ujawnia, że istnieje większa zmienność między próbkami pobranymi za pomocą mikrodysekcji wychwytu laserowego, przedstawionej jako kwadraty, niż wśród próbek pobranych za pomocą kriosekcji, przedstawionej jako koła. Test wzbogacania adnotacji 2D między kriosekcją a mikrodysekcją laserową dla stref wyściółki podwyściółkowej i przyśrodkowej ujawnił podobne wzbogacenie zarówno w metodach, jak i regionach dla białek związanych z przestrzenią zewnątrzkomórkową. Kriosekcja-sekcja zapewnia bardziej wiarygodną identyfikację i kwantyfikację neurogenezy w białkach macierzy zewnątrzkomórkowej związanych ze strefą podwyściółkową.W przypadku tenascyny-C tylko kriosekcja wykazała wzbogacenie w strefie podwyściółkowej w porównaniu ze strefą wyściółki przyśrodkowej. Upewnij się, że sekcje mózgu na szkiełkach nie zostaną całkowicie rozmrożone. Ogólnie rzecz biorąc, dobrze jest przećwiczyć kroki procedury preparacji, aby uzyskać spójny wynik.Metoda preparacji może być również stosowana z innymi metodami analizy białek, które mogą łatwo wykryć białka o bardzo niskiej obfitości, takie jak czynniki wzrostu i cytokiny. Ta metoda mikrodysekcji pozwoliła nam zidentyfikować nowy regulator neurogenezy i wierzymy, że pozwoli innym zidentyfikować inne regulatory neurogenezy w różnych kontekstach.

cryo-section-dissection-adult-subependymal-zone-for-accurate-deep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w zawiesinie różnicują się w ciała embrionalne (EB). W niniejszym materiale demonstrujemy, jak uzyskać wysokiej jakości krioprzekroje EB, które są przydatne do badania komórkowych i molekularnych aspektów embriogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu ich organizacji w formie agregatów.

Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.

Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Naucz się metody kriosekcji do precyzyjnej izolacji niszy neurogenicznej komór mózgowych myszy. Technika ta umożliwia głęboką ilościową analizę proteomu z minimalnym uszkodzeniem tkanek.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Przeglądaj więcej filmów