Name: Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj protokół chirurgiczny do obrazowania wapnia in vivo w głębokich strukturach mózgu myszy. Ta metoda umożliwia rejestrację aktywności setek neuronów u swobodnie poruszających się zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161, and UG3NS115608.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li>
<li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li>
<li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie informują o żadnych sprzecznych interesach finansowych.

Centralnym pytaniem w neurobiologii jest zrozumienie, w jaki sposób dynamika i obwody neuronalne kodują i przechowują informacje oraz jak są zmieniane w chorobach mózgu. Za pomocą miniskopowego systemu obrazowania Ca2+ in vivo, można jednocześnie monitorować aktywność neuronalną z kilkuset neuronów w lokalnym mikroukładzie z poziomu swobodnie zachowującego się zwierzęcia. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół chirurgiczny dotyczący iniekcji wirusa i implantacji soczewek GRIN w celu przygotowania gryzoni do głębokiego obrazowania mózgu in vivo Ca 2+ za pomocą specjalnie opracowanego systemu rejestracji miniskopu. Tabela 1 przedstawia porównanie naszego systemu miniskopowego z innymi dostępnymi na rynku i wykonanymi na zamówienie systemami miniskopowymi 7,8,9,10,11,13,25,26. Warto zauważyć, że implantacja soczewki GRIN przy użyciu obecnego protokołu chirurgicznego jest kompatybilna z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych i dwufotonowych w celu głębokiego obrazowania mózgu in vivo wapnia.
Od wstrzyknięcia wirusa do pozyskania danych za pomocą miniskopowego obrazowania wapnia in vivo , cała procedura eksperymentalna trwa co najmniej 2 miesiące. Jest to skomplikowany i pracochłonny proces. Ostateczny sukces eksperymentu zależy od wielu czynników, w tym właściwego doboru GECI, dokładnego wstrzyknięcia wirusa w docelowy obszar mózgu, wystarczającej ekspresji wirusa w pożądanej populacji neuronalnej, implantacji soczewki GRIN dokładnie w pożądanym miejscu, odpowiedniej rekonwalescencji po operacjach, a także od tego, czy po operacji wystąpi ciężki stan zapalny i czy operacje poważnie wpływają na zachowanie zwierzęcia, i tak dalej.
Dwa krytyczne etapy obejmują stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantację soczewki GRIN. W celu demonstracyjnym przeprowadzono stereotaktyczną mikroiniekcję w mysim mPFC, z wirusem związanym z adenowirusem (AAV1) kodującym GCaMP6f pod kontrolą promotora CaMKII, który selektywnie znakuje neurony piramidowe w mPFC. Wybrano GCaMP6f, ponieważ jest to jeden z najszybszych i najbardziej czułych wskaźników wapnia o czasie połowicznego rozpadu wynoszącym 71 ms15. Ponadto ekspresja wirusa AAV GCaMP6f jest długotrwała (tj. kilka miesięcy), co czyni ją idealną do wykonywania powtarzalnych obrazowań Ca2 + in vivo przez długi czas w badaniach podłużnych na mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych27. Obecny protokół chirurgiczny można dostosować do celowania w różne populacje komórek w dowolnym innym regionie mózgu. Różne dostępne narzędzia wirusowe umożliwiają selektywne znakowanie określonych populacji neuronów w pożądanym regionie mózgu w pożądanym wieku. Ponadto naukowcy mogą wykorzystać system rekombinacji Cre-LoxP i różne dostępne modele myszy transgenicznych do przeprowadzania modyfikacji genetycznych i badania wyników behawioralnych i obwodów neuronalnych28,29.
Unikalną cechą prezentowanego protokołu jest to, że przed implantacją soczewki GRIN (o średnicy 1 mm) wykonano automatyczną aspirację tkanki mózgowej warstwa po warstwie. Osiąga się to za pomocą igły o sile 27 G podłączonej do systemu próżniowego, sterowanej przez specjalnie skonstruowane ramię robota i oprogramowanie23. Opierając się na naszym doświadczeniu, metoda ta generuje jednolitą powierzchnię, z którą soczewka GRIN może się zetknąć i powoduje mniejsze uszkodzenia sąsiedniej tkanki niż ręczna aspiracja tkanek23. Z tego powodu zabieg ten przynosi oczywistą zaletę w przypadku soczewek GRIN o stosunkowo większej średnicy (np. 1 mm). Jednak aspiracja tkanek może nie być konieczna do wszczepienia soczewki GRIN o mniejszej średnicy (0,5 mm lub 0,25 mm). Zamiast tego można go sadzić bezpośrednio wzdłuż toru prowadzącego wykonanego za pomocą igły 30 G21.
Oprócz dwóch krytycznych kroków omówionych powyżej, wiele innych czynników musi być dokładnie rozważonych, aby operacja zakończyła się sukcesem. (1) Wszystkie narzędzia, które mają kontakt z mózgiem, powinny być wysterylizowane, aby zapobiec infekcji. (2) Wszystkie kroki chirurgiczne muszą być wykonane, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu, aby zapobiec dalszemu zapaleniu i nadmiernemu tworzeniu się tkanki bliznowatej. (3) Należy dokładnie rozważyć dawki znieczulenia podawane początkowo i utrzymywane podczas zabiegu, zwłaszcza te podawane dootrzewnowo. Dawki znieczulenia mogą być modyfikowane w zależności od różnych szczepów myszy, ponieważ niektóre mogą być bardziej wrażliwe. (4) Stan myszy musi być stale monitorowany podczas operacji. Wreszcie, (5) myszy muszą być regularnie monitorowane po operacji, ponieważ po operacji może wystąpić wiele powikłań.
Chociaż fragment tkanki mózgowej jest usuwany jednostronnie podczas etapu implantacji soczewki GRIN, nie zaobserwowaliśmy żadnych oczywistych deficytów zachowania 7,12. Waga miniskopu wynosi około 2 gramów, a kabel został specjalnie zaprojektowany, aby był lekki i aby mysz mogła go łatwo przenosić. Miniskop i kabel są mocowane do zwierzęcia tylko przed obrazowaniem in vivo i odłączane po obrazowaniu. Cały proces obrazowania trwa zwykle nie dłużej niż 30 minut. Dlatego te oprzyrządowanie nie przeszkadza myszy w swobodnym zachowywaniu się. Etapy instalacji i deinstalacji miniskopu wymagają krótkiego znieczulenia (mniej niż 2 minuty) izofluranem w celu unieruchomienia zwierząt. Zazwyczaj pozwalamy myszy dojść do siebie po krótkiej ekspozycji na izofluran przez 30 minut przed wykonaniem obrazowania in vivo. Wykonywaliśmy miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo raz w tygodniu przez kilka tygodni, nie zauważając żadnego wpływu na zdrowie myszy i zachowania społeczne myszy12.
Jednym z głównych ograniczeń obecnego systemu rejestracji miniskopowej jest konieczność podłączenia mikroskopu do kabla w celu akwizycji danych. Obecność kabla czasami ogranicza wydajność zadania myszy i ogranicza nagrywanie jednego zwierzęcia na raz. Ostatnio opracowano miniskop bezprzewodowy25,26. Zwiększy to wydajność zadań i umożliwi jednoczesne obrazowanie in vivo wielu zwierząt w grupie. Co więcej, opracowanie bardziej czułych GECI o spektralnie rozdzielalnych długościach fal w połączeniu z dwukolorowym miniskopem stworzy bardziej ekscytujące możliwości dla badań neurobiologicznych.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Wewnątrzkomórkowa sygnalizacja Ca2+ jest niezbędnym regulatorem wzrostu, proliferacji, różnicowania, migracji, transkrypcji genów, wydzielania i apoptozy1. W neuronach sygnalizacja Ca2 + jest precyzyjnie kontrolowana, ponieważ jej przestrzenno-czasowy wzorzec jest związany z kluczowymi funkcjami, takimi jak pobudliwość błony, uwalnianie neuroprzekaźników i plastyczność synaptyczna2.
Obrazowanie wapnia in vivo jest potężną techniką, która może być wykorzystana do dekodowania reprezentacji obwodów neuronowych elementarnych do normalnych zachowań zwierząt, identyfikowania nieprawidłowych aktywności neuronalnych w zwierzęcych modelach zaburzeń mózgu i odkrywania potencjalnych celów terapeutycznych, które mogą normalizować te zmienione obwody. Dwa popularne systemy obrazowania wapnia in vivo to dwufotonowa laserowa skaningowa mikroskopia fluorescencyjna 3,4,5,6 oraz miniaturyzowana mikroendoskopia montowana na głowie (miniscope)7,8,9,10,11,12,13. Konwencjonalna mikroskopia dwufotonowa oferuje imponujące korzyści, takie jak lepsza rozdzielczość, niższy poziom szumów i mniejsze fotowybielanie; Jednak zwierzęta doświadczalne muszą mieć unieruchomioną głowę, co ogranicza badania zachowania, które można przeprowadzić3,4,5,6. Z kolei system miniskopów montowany na głowie jest mały i przenośny, dzięki czemu można badać szeroką gamę testów behawioralnych przy użyciu swobodnie zachowujących się zwierząt7,8,9,10,11,12,13.
Istnieją dwa wiodące wskaźniki Ca2+, wskaźniki chemiczne5,14 i genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECIs)15,16. Obrazowanie Ca2+ zostało ułatwione dzięki zastosowaniu wysoce czułych GECI dostarczanych z wektorami wirusowymi, które umożliwiają specyficzne znakowanie neuronów w docelowym obwodzie. Nieustanne wysiłki mające na celu zwiększenie czułości, długowieczności i zdolności do oznaczania nawet przedziałów subkomórkowych sprawiają, że GECI są idealne do różnych badań obrazowania wapnia in vivo17,18,19.
Rozpraszanie światła w tkance mózgowej podczas obrazowania ogranicza penetrację optyczną w głąb, nawet przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Jednak soczewka Gradient Index (GRIN) rozwiązuje ten problem, ponieważ soczewka GRIN może być bezpośrednio osadzona w tkankach biologicznych i przekazywać obrazy z głębokiego obszaru mózgu do obiektywu mikroskopu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych soczewek wykonanych z optycznie jednorodnego materiału i wymagających skomplikowanej powierzchni do ustawiania ostrości i tworzenia obrazów, działanie soczewki GRIN opiera się na stopniowej zmianie współczynnika załamania światła w materiale soczewki, która osiąga ostrość z płaską powierzchnią20. Soczewka GRIN może być produkowana o średnicy do 0,2 mm. Dlatego zminiaturyzowaną soczewkę GRIN można wszczepić do głębokiego mózgu, nie powodując zbyt dużych uszkodzeń.
W tym artykule przedstawiono kompletny protokół chirurgiczny dla głębokiego obrazowania wapnia w mózgu in vivo. W celu demonstracji opisujemy operacje mózgu ukierunkowane konkretnie na przyśrodkową korę przedczołową (mPFC) mózgu myszy oraz rejestrację obrazowania wapnia in vivo za pomocą specjalnie zbudowanego systemu miniskopowego opracowanego przez grupę dr Lina w National Institute on Drug Abuse (NIDA/IRP)7,12. Procedura eksperymentalna obejmuje dwie poważne operacje mózgu. Pierwszą operacją jest stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego wykazującego ekspresję GCaMP6f (GECI) w mPFC. Drugą operacją jest wszczepienie soczewki GRIN w ten sam obszar mózgu. Po powrocie do zdrowia po tych operacjach mózgu, kolejną procedurą jest przymocowanie uchwytu (podstawy) miniskopu do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego. In vivo (in vivo) Obrazowanie Ca2+ można wykonać w dowolnym momencie po zamontowaniu miniskopu na jego podstawie. Protokół chirurgiczny do wstrzykiwania wirusa i implantacji soczewek GRIN jest kompatybilny z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych i dwufotonowych do obrazowania wapnia w głębokim mózgu in vivo.

<table><tbody><tr><td>Frezy 0,6 mm i 1,2 mm</td><td>Technologia KF</td><td>8000037800</td><td>Do kraniotomii</td></tr><tr><td>Igła 27-G i 30-G</td><td>BD Igła PrecisionGlide</td><td>REF 305109 i REF305106</td><td>Do obu operacji</td></tr><tr><td>45 kleszczy kątowych</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>11251-35</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>7,5% roztwór jodu powidonu (Betadine)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>Płyn do dezynfekcji powierzchni</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L</td><td>GRIN środek do czyszczenia soczewek</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Maść antybiotykowa</td><td>HeliDerm Technology</td><td>81073087</td><td>Do wstrzykiwań wirusów</td></tr><tr><td>Lek przeciwzapalny (Ibuprofen)</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>Działa jako środek przeciwbólowy po operacjach</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do kodowania zachowań (Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>Do nagrywania zachowania</td></tr><tr><td>Mosiężna nakrętka sześciokątna</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td>Do przygotowania komutatora CSF</td></tr><tr><td></td><td>NIDA/IRP</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td>komponent systemu akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Zbiornik sprężonego tlenu i Caxbondioxide</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>Do soczewek GRIN implantacja</td></tr><tr><td>Zbiornik sprężonego tlenu</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>Bezprzewodowa wiertarka</td><td>Technologia KF</td><td>8000037800</td><td>Do kraniotomii</td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan</td><td>Henkel Coorporation</td><td># 1811182 Do</td><td>implantacji soczewek GRIN Kontroler</td></tr><tr><td>akwizycji danych</td><td>NIDA/IRP</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td>komponent akwizycji obrazu System</td></tr><tr><td>do transmisji danych</td><td>NIDA/IRP</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td>element systemu akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Zestaw cementu dentystycznego</td><td>C& B Metabond i katalizator</td><td>A00253revA306 i A00168revB306</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Zestaw cementu dentystycznego</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Do przygotowania żelu</td></tr><tr><td>dietetycznego</td> CSF <td>Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>Suplement diety do myszy,</td></tr><tr><td>soczewka GRINTECH</td><td></td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>Aby utrzymać ciepło ciała myszy podczas operacji</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>Znieczulenie miejscowe</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>Do przygotowania CSF</td></tr><tr><td>Mikrolitr strzykawka (Hamilton)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>Kontroler pompy mikrostrzykawkowej</td><td>World Precision Instrument</td><td>#178647</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>Miniskop</td><td>NIDA/IRP</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td><td>do obrazowania</td></tr><tr><td>Baza miniskopu</td><td>Protolabs</td><td>Specjalnie zaprojektowany Do</td><td>montażu podstawy</td></tr><tr><td>Ramię trzymające miniskop</td><td>NIDA/IRP</td><td>Zaprojektowany na zamówienie</td><td>Do montażu podstawy</td></tr><tr><td>Nasadka ochronna miniskopu</td><td>Protolabs</td><td>Specjalnie zaprojektowana</td><td>Do ochrony miniskopu</td></tr><tr><td>Sterownik z napędem silnikowym</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>Do montażu podstawy</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Puralube Vet Maść</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Okulistyczna probówka do PCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Zacisk zaciskowy</td><td>World Precision Instrument</td><td>14040</td><td>Do zaciskania rurki</td></tr><tr><td>Taśma politetrafluoroetylenowa (PTFE)</td><td>TegaSeal Taśma PTFE</td><td>A-A-58092</td><td>Do mocowania lunety miniScope do podstawy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>Do przygotowania aCSF</td></tr><tr><td>Ramię robotyczne</td><td>NIDA/IRP</td><td>Specjalnie zaprojektowane Do</td><td>implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>Do obu operacji</td></tr><tr><td>Śruba ustalająca</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>Do przykręcania mosiężnej nakrętki sześciokątnej w podstawie miniskopu</td></tr><tr><td>&nbsp; Rurki z gumy silikonowej, 0.062"ID, 1/8" OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>Do nawadniania aCSF</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td>Do przygotowania aCSF</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>Do przygotowania aCSF</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>Do przygotowania</td></tr><tr><td>CSF Stopień stereotaktyczny</td><td>KOPF</td><td>Model 962 Podwójny ultra precyzyjny stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>Do obu operacji</td></tr><tr><td>Sterylny wacik bawełniany</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td>Do obu operacji</td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>11251-35</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td></td><td>Szew Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>Do wstrzykiwań wirusów</td></tr><tr><td>&nbsp; Filtr strzykawkowy (0,22 &mikro; m)</td> <td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>Do filtrowania aCSF podczas implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Zawiesina wirusowa (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td><td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Miano: 2,8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr></tbody></table>

stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniaturowy mikroskop fluorescencyjny (miniskop) jest potężnym narzędziem do obrazowania in vivo wapnia od swobodnie zachowujących się zwierząt. Ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi wielofotonowymi systemami obrazowania wapnia: (1) kompaktowy; (2) lekkie; (3) przystępne cenowo; oraz (4) umożliwia nagrywanie swobodnie zachowujących się zwierząt. Protokół ten opisuje operacje mózgu w celu głębokiego obrazowania wapnia in vivo mózgu przy użyciu specjalnie opracowanego systemu rejestracji miniskopu. Procedura przygotowania składa się z trzech etapów, w tym: (1) stereotaktycznego wstrzyknięcia wirusa do pożądanego obszaru mózgu myszy w celu oznaczenia określonej podgrupy neuronów za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia; (2) wszczepienie soczewki o indeksie gradientu (GRIN), która może przekazywać obraz wapnia z głębokiego obszaru mózgu do systemu miniskopu; oraz (3) przymocowanie uchwytu miniskopu do czaszki myszy, gdzie miniskop można przymocować później. Aby wykonać obrazowanie wapnia in vivo, miniskop jest mocowany na uchwycie, a obrazy wapnia neuronów są zbierane wraz z jednoczesnymi zapisami zachowania. Obecny protokół chirurgiczny jest kompatybilny z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych i dwufotonowych do głębokiego obrazowania wapnia mózgu in vivo.

Rysunek 1 przedstawia schematyczną procedurę eksperymentalną, obejmującą iniekcję wirusa, implantację soczewki GRIN, mocowanie podstawy miniskopu do czaszki myszy oraz in vivo obrazowanie poziomu wapnia poprzez miniskop. Cała procedura trwa około 2 miesięcy. Rycina 2 przedstawia główne komponenty opisane w protokole dla miniskopu in vivo obrazowanie wapnia Rysunek 3 prezentuje interfejsy oprogramowania AutoStereota podczas implantacji soczewki GRIN. Rysunek 4 prezentuje interfejsy programu NeuView oraz oprogramowania do rejestracji zachowań podczas in vivo obrazowanie wapnia
Wynik obrazowania wapnia in vivo zależy od powodzenia zarówno operacji wstrzyknięcia wirusa, jak i implantacji soczewki GRIN. Rysunek 5 przedstawia zakres wyników (tj. niepowodzenia, wyników suboptymalnych i dobrych) z rejestracji obrazowania wapnia in vivo. W przypadkach niepowodzeń obraz wapnia może być ciemny lub jasny, ale zazwyczaj nie wykazuje żadnych lub bardzo niewielu aktywnych neuronów. Zazwyczaj nie kontynuujemy eksperymentów z rejestracją wapnia in vivo, jeśli liczba aktywnych neuronów jest mniejsza niż pięć. Dobre obrazowanie wapnia in vivo zazwyczaj ujawnia kilkaset aktywnych neuronów. Jeśli rejestracja obejmuje mniej niż sto aktywnych neuronów, uznajemy ją za suboptymalną.
W przypadku zarówno suboptimalnych, jak i dobrych nagrań przeprowadzono eksperymenty obrazowania wapnia in vivo, a następnie wykonano analizę danych. Film 1 przedstawia reprezentatywne nagranie z obrazowania wapnia in vivo z obszaru mPFC myszy. Nagrania behawioralne oraz dane z obrazowania wapnia są zazwyczaj przetwarzane oddzielnie. Filmy przedstawiające zachowanie myszy mogą być oceniane ręcznie. Pliki z obrazowania wapnia są przetwarzane przy użyciu zestawu narzędzi do przetwarzania obrazów wapnia CaImAn24. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywną mapę komórek oraz kilka przebiegów stężeń wapnia z dobrego nagrania z obrazowania wapnia in vivo .
Po zakończeniu obrazowania wapnia in vivo, ostatnim krokiem jest potwierdzenie, czy wstrzyknięcie wirusa oraz implantacja soczewki GRIN odbyły się w pożądanym obszarze mózgu. W tym celu mysz poddano perfuzji solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), a następnie 4% paraformaldehydem (PFA). Mózg myszy został pobrany, utrwalony dodatkowo w 4% PFA przez 12 h i przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C. Następnie mózg myszy pocięto na plastry o grubości 50 µm przy użyciu wibrotomu. Przekroje mózgu barwiono DAPI i obserwowano pod mikroskopem (nieopisane w protokole)12. Rysunek 7 przedstawia przekrój mózgu myszy eksperymentalnej z poziomu ok. 1,94 mm przed bregma, ukazujący tor implantacji soczewki GRIN. Obszar zielonej fluorescencji pod i wokół toru soczewki GRIN wskazuje na ekspresję GCaMP6f w obszarze mPFC.
<img alt="Schemat wstrzykiwania stereotaktycznego, ekspresji GCaMP6f, implantacji soczewki GRIN oraz obrazowania Ca²⁺ in vivo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury eksperymentalnej. (A) Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do mPFC. (B) Implantacja soczewki GRIN w mPFC. (C) Mocowanie podstawy miniskopu do czaszki myszy. (D) Montaż miniskopu i obrazowanie wapnia in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ spektroskopowy z komponentami wzbudzenia optycznego i sprzętem analitycznym do badań emisji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Główne komponenty niezbędne do obrazowania wapnia in vivo. (A) Soczewka GRIN o średnicy 1 mm i długości 4,38 mm. (B) Ręcznie polerowana igła tępokutna 27 G używana do aspiracji tkanki mózgowej. (C) Ramię robotyczne połączone z uchwytem igły. (D) Specjalnie wykonany korek z probówki PCR służący do ochrony odsłoniętej soczewki GRIN do momentu przymocowania podstawy miniskopu do czaszki myszy. (E) Uchwyt (podstawa) miniskopu z nakrętką sześciokątną. (F) Miniskop, którego część gwintowana jest owinięta taśmą PTFE. (G) Miniskop przymocowany do podstawy za pomocą śruby blokującej. (H) Ramię podtrzymujące miniskop. (I) Specjalnie zbudowany 3D sterownik zmotoryzowany ułatwiający przemieszczanie miniskopu w pozycjach XYZ. (J) Kapturek ochronny przymocowany do podstawy, chroniący odsłoniętą soczewkę GRIN w czasie, gdy mysz nie poddawana jest obrazowaniu wapnia in vivo. (K) Miniskop podłączony do kabla. (L) System akwizycji danych do obrazowania Ca2+ in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs parametrów optymalizacji; symulacja komputerowa; zmienne procesowe; diagram; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Interfejsy oprogramowania AutoStereota podczas warstwowej aspiracji tkanki mózgowej. (A) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.1 do 2.17.3. (B) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.4 do 2.17.6. (C) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.7 do 2.17.9. (D) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.10 do 2.17.12. Czerwone ramki wyróżniają wartości wejściowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Pomiar wzbudzenia optycznego, obraz mikroskopowy w interfejsie oprogramowania, układ absorpcji przejściowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Interfejsy oprogramowania NeuView oraz oprogramowania do rejestracji zachowań podczas obrazowania wapnia in vivo. (A) Interfejs programu NeuView. (B,C) Interfejsy oprogramowania do rejestracji zachowań. Czerwone ramki wyróżniają przyciski, które należy kliknąć. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Seria obrazów mikroskopowych z analizy struktury komórek; obejmuje porównanie w jasnym polu oraz szczegóły spektralne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Mapy fluorescencyjne komórek z maksymalną projekcją obrazu, pokazujące zakres możliwych wyników. (A,B) Nieudane obrazowanie wapnia in vivo, które nie nadaje się do późniejszej analizy danych. (A) obraz ciemny, zawierający mniej niż 5 aktywnych neuronów. (B) obraz jasny, ale pozbawiony aktywnych neuronów. (C) Mapa komórek z suboptimalnego obrazowania wapnia in vivo, zawierająca niektóre aktywne neurony. (D) Mapa komórek z dobrego obrazowania wapnia in vivo, obejmująca kilkaset aktywnych neuronów. Pasek skali: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Kalkuluj tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wizualizacja aktywności neuronów, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej i ślady sygnału wapniowego do analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywna mapa komórek i przejściowe zmiany stężenia wapnia z udanego obrazowania wapniowego in vivo. Panel lewy przedstawia mapę fluorescencyjną komórek (maksymalna projekcja) z rejestracji obrazowania wapniowego in vivo w mPFC podczas testu otwartego pola. Rejestracja trwa 5 min. Panel prawy pokazuje przejściowe zmiany stężenia wapnia z 15 obszarów zainteresowania (dopasowane kolorystycznie). Pasek skali: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przekrój mózgu z torbacją soczewki GRIN, obrazowanie fluorescencyjne, kora przedczołowa, schemat badania optycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Ocena pośmiertna myszy eksperymentalnej. Ocena pośmiertna ekspresji GCaMP6f oraz implantacji soczewki GRIN w mPFC myszy eksperymentalnej. Prostokątny obszar wskazuje tor implantacji soczewki GRIN. Zielony obszar poniżej miejsca implantacji soczewki GRIN potwierdza ekspresję GCaMP6f oraz precyzyjną implantację soczewki GRIN w pożądanym regionie mózgu. Cg, kora obręczy; PrL, kora przedlimbiczna; IL, kora podlimbiczna. Pasek skali: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Porównanie systemu miniskopu zbudowanego na zamówienie w NIDA z innymi systemami miniskopów 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Film 1: in vivo obrazowanie wapnia w mPFC myszy podczas testu otwartego pola. W celach demonstracyjnych w tym filmie przedstawiono jedynie 1 min nagrania. Pierwotna częstotliwość odświeżania klatek nagrania wynosi 10 frames/s. Prędkość odtwarzania filmu jest 6-krotnie większa niż w oryginalnym nagraniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo umożliwia naukowcom zbadanie przestrzennie i czasowo skoordynowanej aktywności setek neuronów w głębokich strukturach mózgu swobodnie zachowujących się zwierząt. Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo ma wiele zalet, w tym możliwość wykonywania zapisów specyficznych dla typu komórki, na dużą skalę i podłużnych. Nasz protokół chirurgiczny do wstrzykiwania wirusa i implantacji soczewek GRIN jest kompatybilny z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych fotonów i dwóch fotonów do głębokiego obrazowania wapnia mózgu in vivo.Procedurę zademonstruje Rashmi Thapa, doktorantka z mojego laboratorium. Po zdezynfekowaniu ogolonego obszaru chirurgicznego znieczulonej myszy, za pomocą skalpela wykonaj dwucentymetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić lambdę i bregmę czaszki. Po zlokalizowaniu 0,5-milimetrowego wiertła dentystycznego w pozycji przedniej tylnej 1,94 milimetra i przyśrodkowej bocznej 0,5 milimetra od bregmy, rozpocznij wiercenie w czaszce.Następnie załaduj wirusa do mikrolitrowej strzykawki za pomocą panelu sterowania mikropompy i usuń 500 nanolitrów pęcherzyków powietrza, a następnie 800 nanolitrów wirusa przy natężeniu przepływu 50 nanolitrów na sekundę. Powoli przesuwaj igłę w dół do tkanki mózgowej do docelowej współrzędnej Z grzbietu brzusznego 1,75 milimetra, a następnie lekko przesuń ją w górę do współrzędnej Z grzbietowo-brzusznej 1,65 milimetra. Na panelu sterowania ustaw mikropompę tak, aby wstrzykiwała 500 nanolitrów wirusa z natężeniem przepływu 50 nanolitrów na minutę przed naciśnięciem przycisku Uruchom, aby wstrzyknąć wirusa.Po zakończeniu wstrzyknięcia wyrównać brzegi skóry i ostrożnie zamknąć nacięcie szwem 4-0. Nałóż maść z antybiotykiem na zszyty obszar, aby zapobiec infekcji. Aby wszczepić soczewkę o wskaźniku gradientu lub GRIN, należy wyciąć cienkimi nożyczkami trójkątny obszar skóry o wysokości 1,5 centymetra i podstawie 1,5 centymetra od przedniej strony między oczami do tylnej strony za lambdą.Po dokładnym oczyszczeniu i wysuszeniu czaszki nałóż cyjanoakrylan na krawędzie skóry i przymocuj skórę do czaszki. Po pięciu minutach, gdy cyjanoakrylan wyschnie, zlokalizuj wiertło dentystyczne o średnicy 1,2 milimetra w pozycji przedniej tylnej 1,94 milimetra, przyśrodkowej bocznej 0,8 milimetra od bregmy. Przewiercić czaszkę, a następnie usunąć oponę twardą za pomocą końcówki igły o rozmiarze 30.Oczyść wszystkie kawałki kości za pomocą ostrych kleszczy pod kątem 45 stopni. Następnie przymocuj ręcznie polerowaną igłę z końcem w rozmiarze 27 do uchwytu igły sprzężonej z ramieniem robota nachylonym pod kątem 10 stopni i podłącz drugi koniec uchwytu igły do domowego systemu próżniowego. Zlokalizuj końcówkę igły, aby dotknąć bregmy przed kliknięciem przycisku Bregma, aby ustawić współrzędną Z bregmy na zero.Ustaw wartość wejściową X na 0,8, wprowadź wartość Y na 1,94, wprowadź wartość Z na 1,0 i kliknij przycisk Znajdź, aby przesunąć igłę na wierzch wywierconego otworu w czaszce. Wyśrodkuj końcówkę igły do wywierconego otworu i opuść ją do pozycji zerowej Z. Włącz odkurzacz i zacznij płukać odsłonięty obszar mózgu sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym lub ACSF przez sterowany grawitacyjnie system rurek podłączony do igły o rozmiarze 30 z wygiętą końcówką.ACSF jest stale bąbelkowany mieszaniną gazów składającą się z 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, podczas gdy jest filtrowany przez filtr 0,2 mikrona. Korzystając z oprogramowania AutoStereota, aspiracja tkanki mózgowej zakończy się w czterech rundach. W pierwszej rundzie aspiracji upewnij się, że wartość Z jest wyświetlana na zero.Następnie w sesji zStep kliknij i zaznacz pierwszy i drugi wiersz. Ustaw wartości w pierwszym wierszu na 0,2 i 1. Ustaw wartości dla drugiego wiersza na 0,15 i 4.W sesji Mode ustaw rozmiar igły 27 i 1.2. Ustaw przyciemnienie 0.9. Wszystkie inne wartości będą wartościami domyślnymi.Aby rozpocząć aspirację, kolejno klikaj przyciski NotSet, KeepZero i Start. Pierwsza runda aspiracji generuje kieszeń kolumnową o głębokości 0,8 milimetra i średnicy 1 milimetra. W trzeciej rundzie aspiracji kliknij i zaznacz pierwszy wiersz dla sesji zStep i ustaw wartości dla pierwszego wiersza na 1.8 i 1.W sesji Mode ustaw rozmiar igły 27 i 2.2. Rozpocznij aspirację, utrzymując inne wartości takie same jak w poprzedniej rundzie. Po trzeciej rundzie aspiracji głębokość kieszeni kolumny wynosi 1,8 milimetra.Ostatnia runda aspiracji polega na oczyszczeniu krwi nagromadzonej na dnie kieszeni. Ustaw wartości dla pierwszego wiersza na 1.6 i 1 w sesji zStep i ustaw rozmiar igły 27 oraz 2.2 i Dims 0.6 w sesji trybu przed rozpoczęciem aspiracji. Gdy kieszeń będzie wolna od krwi, zatrzymaj podciśnienie, przerwij nawadnianie ACSF i podnieś igłę o 2 milimetry we współrzędnej Z i 0,5 milimetra do przodu do środka.Umieść sterylną 1-milimetrową soczewkę GRIN w kieszeni tkanki mózgowej. Następnie za pomocą szpatułki nałóż stopioną agarozę w szczelinę między soczewką GRIN a tkanką mózgową. Po tym, jak agaroza utworzy żel, usuń nadmiar agarozy za pomocą mikroostrza.Wymieszaj proszek cementu dentystycznego i płyn katalizatora we wstępnie schłodzonym dołku mieszania i nałóż warstwę samoutwardzalnego cementu z żywicy adhezyjnej na czaszkę, zaczynając od otoczenia soczewki GRIN, a następnie pokrywając całą odsłoniętą czaszkę. W czystej studzience z tworzywa sztucznego wymieszaj proszek cementu dentystycznego i węgiel drzewny z płynem, aby nałożyć cienką warstwę mieszanki na pierwszą warstwę cementu dentystycznego. Pozwól mu stwardnieć przez pięć minut.Podłącz miniskop do i włącz specjalnie opracowane oprogramowanie NuView. W NuView kliknij pozycję Sprzęt, zaznacz pozycję LED1 i kliknij przycisk Strumień, aby wyświetlić obrazy na żywo. Aby zatrzymać transmisję na żywo, kliknij przycisk Zatrzymaj.Następnie umieść miniskop w specjalnie zbudowanym ramieniu trzymającym miniskop. Za pomocą zmotoryzowanych kontrolerów umieść miniskop tuż nad odsłoniętą soczewką GRIN, tak aby był równoległy do powierzchni obiektywu. Powoli opuść miniskop w kierunku obiektywu GRIN i dostosuj jego pozycję Z, aż zostanie znaleziona najlepsza płaszczyzna ostrości.Nałóż pierwszą warstwę cementu dentystycznego wokół podstawy miniskopu, nie zmieniając położenia miniskopu. Po stwardnieniu cementu delikatnie zdejmij ramię przytrzymujące, tak aby miniskop mógł samodzielnie stać na główce myszy. Nałóż drugą warstwę cementu dentystycznego wokół podstawy, aby wypełnić wszystkie luki, upewniając się, że nie ma wycieku światła LED ze szczelin.Pozwól cementowi dentystycznemu stwardnieć. Po krótkim znieczuleniu myszy izofluranem, przed zdjęciem nasadki ochronnej poluzuj blokującą w podstawie za pomocą małego śrubokręta i wyczyść powierzchnię soczewki GRIN wacikiem nasączonym acetonem. Podłącz miniskop do i uruchom oprogramowanie NuView, aby rozpocząć identyfikację najlepszej płaszczyzny ogniskowej z dostosowaniem położenia miniskopu względem podstawy poprzez lekkie dokręcenie lub poluzowanie za pomocą kleszczy.Po określeniu najlepszej płaszczyzny ogniskowej dokręć blokującą przed odłączeniem i umieszczeniem myszy z powrotem w klatce domowej. Włącz oprogramowanie kamery behawioralnej, aby wyświetlić arenę zachowania myszy za pomocą funkcji transmisji na żywo. Ręcznie dostosuj ostrość górnego aparatu.Wybierz Trigger Strobe i zaznacz włącz/wyłącz wyzwalacz, a następnie kliknij przycisk Nagraj. Następnie użyj opcji Przeglądaj, aby wybrać lokalizację, w której zostaną zapisane nagrania zachowań. Wybierz żądany format obrazu.Zbliż mysz do areny i podłącz miniskop do podłączonego do systemu akwizycji danych. Następnie umieść mysz na środku areny. W oprogramowaniu kamery behawioralnej kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie.W NuView sprawdź LED1, kliknij Przechwyć, a następnie wyzwalaj przyciski, aby rozpocząć nagrywanie. Pozwala to na jednoczesne rejestrowanie obrazowania wapnia i zachowania myszy. Naciśnij Stop po 3 000 klatek i zapisz pliki.Po zakończeniu nagrywania należy na krótko znieczulić mysz izofluranem, odłączyć miniskop od podstawy i nałożyć nasadkę ochronną na podstawę przed ponownym umieszczeniem myszy w klatce domowej. Mapa komórek z suboptymalnego obrazowania wapnia in vivo zawierała kilka aktywnych neuronów, podczas gdy mapa z udanego obrazowania obejmowała kilkaset aktywnych neuronów w obszarze ogniskowym. W typowym przykładzie nieudanego obrazowania wapnia in vivo zaobserwowano, że region jest ciemny i zawiera mniej niż pięć aktywnych neuronów lub region był jasny, ale nie miał aktywnych neuronów.W analizie reprezentatywnej przedstawiono mapę komórek fluorescencyjnych o maksymalnej projekcji oraz stany przejściowe wapnia z kolejnych zapisów obrazowania wapnia in vivo. Ocena pośmiertna ekspresji GCaMP6f i implantacji soczewki GRIN w przyśrodkowej PFC eksperymentalnej myszy wykazała, że GCaMP6f uległa ekspresji, a soczewka GRIN została wszczepiona dokładnie w pożądany obszar mózgu. Aby uzyskać dobre obrazowanie wapnia, przed wszczepieniem soczewki GRIN należy upewnić się, że krwawienie całkowicie się zatrzymało, a pole jest wolne od skrzepów krwi.Technika ta może być wykorzystana do badania zmian obwodów nerwowych w mysim modelu różnych zaburzeń ludzkiego mózgu i testowania, czy kandydat na lek może znormalizować zmienione obwody.

stereotaxic-viral-injection-gradient-index-lens-implantation-for-deep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-μm. Technika ta znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.

Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia in vivo jest nieocenionym narzędziem, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Jednak zastosowanie tej techniki do ciała migdałowatego było trudne. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do skutecznego celowania w komórki ciała migdałowatego za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu u myszy.

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Kurczenie się cementu dentystycznego podczas utwardzania powoduje przemieszczenie płyty podstawy. Protokół ten minimalizuje problem poprzez stworzenie początkowego fundamentu z cementu dentystycznego, który pozostawia miejsce na zacementowanie płyty podstawy. Kilka tygodni później płyta podstawy może zostać zacementowana na rusztowaniu przy użyciu niewielkiej ilości nowego cementu, zmniejszając w ten sposób skurcz.

Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Poznaj protokół chirurgiczny do obrazowania wapnia in vivo w głębokich strukturach mózgu myszy. Ta metoda umożliwia rejestrację aktywności setek neuronów u swobodnie poruszających się zwierząt.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia (Wideo) | JoVE Journal

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Przeglądaj więcej filmów