Name: Monitorowanie wzrostu raka piersi i tworzenia kolonii przerzutowych u myszy za pomocą bioluminescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę monitorowania wzrostu guza i kolonizacji przerzutowej raka piersi u myszy przy użyciu bioluminescencji lucyferazy. Technika ta umożliwia badania przedkliniczne nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Y.D.S. Chcielibyśmy podziękować Instytutowi Medycyny Translacyjnej im. Wohla w Centrum Medycznym Hadassah w Jerozolimie za udostępnienie urządzenia do obrazowania małych zwierząt. Badanie to było wspierane przez Research Career Development Award z Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hebrajskiego protokołem MD-21-16429-5. Ponadto Uniwersytet Hebrajski posiada certyfikat Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC).
1. Utrzymanie linii komórkowej
UWAGA: Linie komórkowe ludzkiego raka piersi (MCF-7, MDA-MB-468 i MDA-MB-231) zostały użyte w tym protokole.
<ol>
	<li>Hodowla wszystkich linii komórkowych raka piersi w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze dwutlenku węgla (5%CO2). 
	UWAGA: Regularnie sprawdzaj gęstość komórek; Dziel i rozwijaj do wykorzystania w przyszłości, gdy osiągną 70% zbieżności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wirusa
<ol>
	<li>Potraktuj HEK293T komórki 1 ml trypsyny, aż się oderwą.</li>
	<li>Dodaj 10 ml DMEM (10% FBS), aby zneutralizować aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 150 × g przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i dodać 1 ml świeżej pożywki DMEM.</li>
	<li>Określić stężenie komórek i zasiać 1,2 × 106 komórek/dołek w sześciodołkowej płytce.</li>
	<li>Następnego dnia należy podgrzać wszystkie niezbędne odczynniki, w tym odczynnik do transfekcji, DMEM bez surowicy, plazmid otoczkowy (VSV-G), plazmid pakujący lentiwirusa (ΔVPR) i plazmid blastyczny lucyferazy-V5 pLX304 lub plazmid FUW GFP.</li>
	<li>W autoklawowanej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml wymieszaj 50 μl DMEM bez surowicy z 0,3 μg plazmidu VSV-G, 1 μg ΔVPR i 1,2 μg plazmidu blastycznego pLX304 Lucyferazy-V5 lub plazmidu FUW GFP.</li>
	<li>Po dokładnym wymieszaniu tych plazmidów z pożywką dodać 5 μl odczynnika do transfekcji, delikatnie wymieszać i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodawać mieszaninę kroplami do HEK293T komórek.</li>
	<li>Po 24 godzinach zastąp pożywkę wzrostową 2 ml (30% FBS) DMEM. Następnego dnia (48 godzin po transfekcji) należy pobrać pożywkę zawierającą wirusy ("pLX304 Lucyferasza-V5 lub wirusy FUW GFP"). 
	UWAGA: Zastosowanie 30% FBS zwiększa wydajność produkcji wirusa.</li>
	<li>Aby uniknąć jakichkolwiek pozostałości HEK293T komórek, przepuścić pożywkę zawierającą wirusa przez filtr strzykawkowy 0,45 μm lub wirować przy 150 × g przez 5 minut i zebrać supernatant. 
	UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać robocze porcje wirusa w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Ustanawianie komórek stabilnie wyrażających GFP i lucyferazy ("komórki GFP + Luc+")
<ol>
	<li>Dzień przed zakażeniem komórek wysiewaj 8 × 105 komórek na studzienkę na płytce sześciodołkowej.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji zastąp pożywkę wzrostową świeżą pożywką zawierającą 8 μg/ml polibrenu. Dodać kroplami 200 μl wirusów FUW GFP do komórek.</li>
	<li>Opcjonalnie: W celu zwiększenia skuteczności wirusa należy odwirować płytkę o masie 560 × g przez 30 minut (37 °C) (zakażenie wirowe).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 48 godzin i zweryfikować ekspresję GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Posortuj komórki wykazujące ekspresję GFP według sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (GFP+) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Zainfekuj komórki posortowane przez GFP wirusami blastycznymi pLX304 Lucyferazy-V5, jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Potraktuj komórki blastycydyną (10 μg / ml) 30 godzin po zakażeniu, aby wzbogacić o komórki eksprymujące lucyferasę-V5 pLX304 (komórki GFP+, Luc+). Następnie co dwa dni zastępować świeżą pożywką zawierającą blasticydynę. Dodatkowo, jako kontrolę, potraktuj naiwne komórki tym samym podłożem zawierającym blastycydynę. 
	UWAGA: Wyraźną różnicę między zakażonymi a kontrolnymi komórkami należy zaobserwować po kilku dniach leczenia blasticydyną. Efekt ten jest zależny od linii komórkowej i zwykle trwa ~8-10 dni. Słaba przeżywalność będzie wskazywać na niską wydajność produkcji wirusa. Jeśli tak, wyprodukuj nową partię wirusów, ponieważ niska wydajność może wpłynąć na przyszłe eksperymenty.</li>
</ol>
4. Walidacja aktywności lucyferazy in vitro
<ol>
	<li>Wyhoduj komórki MCF-7, MDA-MB-468 i MDA-MB-231 GFP+ Luc+ na 15-centymetrowej płytce do 80% konfluencji. Zbierz komórki przez trypsynizację, jak opisano w krokach 2.1-2.2.</li>
	<li>Zasiej rosnącą liczbę komórek w każdym dołku (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) na czarnej 96-dołkowej płytce. 
	UWAGA: Czarne 96-dołkowe płytki są bardziej odpowiednie do pomiaru poziomów lucyferazy, ponieważ białe lub przezroczyste płytki wytwarzają sygnały autoluminescencyjne. Jako kontrolę należy użyć samej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w jednym studzience, aby upewnić się, że nie ma autoluminescencji z PBS.</li>
	<li>Napełnij wszystkie studzienki 100 μl DMEM i inkubuj przez 16-24 godziny.</li>
	<li>Przygotować roztwór lucyferyny w PBS o stężeniu 1,5 mg/ml z zapasu 30 mg/ml. Podać zapas roztworu lucyferyny i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki PBS, dodaj 100 μl roztworu lucyferyny do każdej studzienki i odczekaj 2 minuty. Na koniec zmierz aktywność lucyferazy we wszystkich komórkach raka piersi za pomocą bioluminescencji. 
	UWAGA: Badanie in vitro GFP i ekspresji lucyferazy przed eksperymentami na zwierzętach ma kluczowe znaczenie. Dodatkowo puste studzienki służą do odejmowania tła.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie myszom komórek GFP+ Luc+
<ol>
	<li>Przenieś 5 × 106 (MCF-7 i MDA-MB-468) lub 2 × 106 (MDA-MB-231) komórek GFP+ Luc+ odpowiednio do 200 μl lub 100 μl PBS.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy oczyścić sterylny kaptur biologiczny 5% roztworem dezynfekującym (patrz tabela materiałów). Następnie znieczulij myszy przefiltrowanym (0,2 μm) powietrzem zawierającym 4% izofluranu przy natężeniu przepływu powietrza 1 l/min przez 2-3 min. 
	UWAGA: Konieczne jest potwierdzenie prawidłowego znieczulenia; Ściśnij palec myszy i poszukaj odpowiedzi.</li>
	<li>Umieść stożek nad znieczuloną głową myszy w pozycji leżącej. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przetrzyj obszar brzucha myszy, powyżej gruczołu sutkowego, etanolem za pomocą bawełnianego wacika i podnieś 4. gruczoł sutkowy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) pod poduszkę tłuszczową i powoli wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórkowej. 
	UWAGA: Pod skórą pojawi się okrągłe wybrzuszenie. Ponadto niewłaściwe wstrzyknięcie może prowadzić do odchylenia tempa wzrostu guza lub braku guza w tej samej grupie eksperymentalnej.</li>
	<li>Po zabiegu wstrzyknięcia należy wyjąć myszy z kaptura i przenieść je do nowej klatki. Monitoruj myszy, aż powrócą do przytomności. 
	UWAGA: Upewnij się, że wszystkie zużyte igły i strzykawki zostały wyrzucone do pudełka na ostre przedmioty.</li>
</ol>
6. Pomiar poziomu lucyferazy u myszy GFP+ Luc+
<ol>
	<li>Przed wykryciem bioluminescencji należy unieruchomić przytomną mysz, trzymając ją za szyję lewą ręką. Następnie przechyl rękę w lewo, tak aby mysz była skierowana do góry, a dolna część ciała znajdowała się w pozycji leżącej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl lucyferyny (30 mg/ml) dootrzewnowo (i.p.) w powierzchnię brzucha myszy w lewym dolnym kwadrancie brzucha za pomocą strzykawki 1,0 ml z igłą o rozmiarze 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm). 
	UWAGA: Końcówka igły nie powinna być wprowadzana dalej niż 3-5 mm od ściany jamy brzusznej, ponieważ może przebić narządy trzewne. Dodatkowo zaleca się wykonanie iniekcji i.p. bez znieczulenia, ponieważ dystrybucja lucyferyny w organizmie znieczulonych myszy jest wolniejsza niż u myszy przytomnych. Tak więc monitorowanie poziomu lucyferazy u świadomych myszy jest szybszą procedurą.</li>
	<li>Trzymaj mysz przez 7 minut bez znieczulenia, a następnie 3 minuty w komorze anestezjologicznej przed pomiarem kinetyki guza. 
	UWAGA: Czas inkubacji różni się w zależności od eksperymentu, linii komórkowych i gatunku. Dlatego zaleca się kalibrację czasu inkubacji przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
	<li>Znieczulij myszy zgodnie z opisem w krokach 5.2-5.3.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie (Tabela materiałów) podczas inkubacji, zainicjuj system obrazowania i kliknij przycisk Inicjalizuj. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że aparat potrzebuje ~10 minut, aby ostygnąć i osiągnąć -90 °C. Dodatkowo, jako kontrola tła, zmierz poziom lucyferazy u myszy naiwnych (tj. myszy GFP+, którym wstrzyknięto komórki, które nie wyrażają genu lucyferazy).</li>
	<li>Utrzymuj konfigurację w trybie automatycznej ekspozycji, korzystając z następujących ustawień: czas ekspozycji auto, 60 s; Binning Medium, przysłona 1; Zablokowany filtr wzbudzenia; Otwarty filtr spalin. Po zakończeniu inicjalizacji wybierz Kreator obrazowania | Bioluminescencja, a następnie kliknij przycisk Dalej | Otwórz filtr | wybierz opcję Mysz w temacie obrazu.</li>
	<li>W widoku pola wybierz etap C (10 cm) i Wysokość obiektu: 1,50 cm.</li>
	<li>Kliknij pozycję Image Setup Stage (Etap konfiguracji obrazu) na C, a przed kliknięciem przycisku Acquire (Uzyskaj) upewnij się, że mysz znajduje się na stole montażowym we właściwej pozycji leżącej.</li>
	<li>Zamknij drzwi, kliknij przycisk Zdobądź i poczekaj, aż na ekranie pojawi się obraz. 
	UWAGA: W przypadku opcji automatycznej ekspozycji silny sygnał trwa 5-20 s w zależności od sygnału; Słaby sygnał zajmie około 60 sekund.</li>
	<li>Powtórz ten krok dla innych myszy.</li>
	<li>Aby wykryć przerzuty do płuc, zakryj silny sygnał guza pierwotnego grubym czarnym papierem kartonowym i wystaw tylko brzuszną stronę płuc w kierunku kamery. Przechwyć obraz przy użyciu tych samych parametrów, które opisano powyżej.</li>
</ol>
7. Pozyskiwanie obrazu ex vivo za pomocą bioluminescencji i fluorescencji
<ol>
	<li>Poddać myszy eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla (CO2) w eksykatorze i wypreparować myszy za pomocą autoklawowanych nożyczek i kleszczy.</li>
	<li>Przelej myszy za pomocą 0,9% soli fizjologicznej, zbierz narządy i spłucz 1x PBS, aby wyeliminować plamy krwi z narządu.</li>
	<li>Przenieś opłukany narząd na szalkę Petriego i umieść go w stoliku maszyny do bioluminescencji. Zastosuj to samo ustawienie bioluminescencji, jak opisano w krokach 6.2-6.6. 
	UWAGA: Ze względu na spadek sygnału lucyferazy, ten krok jest ograniczony w czasie. Tak więc po eutanazji myszy natychmiast uwidocznij narząd za pomocą bioluminescencji.</li>
	<li>W przypadku obrazów GFP zastosuj to samo ustawienie, jak opisano w kroku 6.3, używając filtra Fluorescencyjny GFP zamiast Bioluminescencji.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia płuc za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zbadać obecność kolonii GFP+.</li>
</ol>
8. Analiza danych bioluminescencyjnych
<ol>
	<li>Kliknij dwukrotnie oprogramowanie i wybierz Otwórz z menu Plik.</li>
	<li>Otwórz wszystkie pliki i zminimalizuj je. Upewnij się, że wszystkie jednostki mają promieniowanie (fotony). Dodatkowo kliknij przycisk Zastosuj do wszystkich, aby zachować te same parametry dla wszystkich obrazów.</li>
	<li>Z menu Widok wybierz paletę narzędzi, która otworzy nowe okno.</li>
	<li>W oknie Tool Palette (Paleta narzędzi) wybierz zakładkę ROI Tools (Narzędzia ROI), a następnie w polu Type (Typ) wybierz wartość Average Bkg ROI.</li>
	<li>Z narzędzi ROI wybierz Okrąg i narysuj mały okrąg na klatce piersiowej myszy.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie kółko, wybierz opcję Użyj jako BKG dla przyszłych ROI na karcie Zwrot z inwestycji w tle i kliknij Gotowe.</li>
</ol>
9. Pomiar całkowitego strumienia
<ol>
	<li>W oknie Tool Palette (Paleta narzędzi) wybierz zakładkę ROI Tools (Narzędzia ROI), a następnie w polu Type (Typ) wybierz opcję Measurement of ROI.</li>
	<li>Z narzędzi ROI wybierz Okrąg i narysuj duży okrąg na pierwotnym guzie myszy.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Kopiuj ROI i kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Wklej zwrot zwrotu (ROI) do każdego pliku każdej myszy.</li>
	<li>Kliknij opcję Mierz ROI na karcie Narzędzia ROI, co spowoduje otwarcie nowego okna o nazwie Pomiary ROI. Na tej karcie zachowaj Typy pomiarów jako Promienność (fotony) i Atrybuty obrazu jako wszystkie wypełnione wartości.</li>
	<li>Wyeksportuj plik w formacie Measurements File (*.txt) lub Csv (*.csv).</li>
	<li>Otwórz wyeksportowane dane w arkuszu kalkulacyjnym i weź całkowity strumień (p/s) oraz wartości dla tygodni. 
	UWAGA: Ten krok może być wykorzystany do pomiaru różnych grup. Na przykład myszy leczone nośnikiem w porównaniu z tymi leczonymi lekiem.</li>
	<li>Wygeneruj wykres XY, na którym czas jest prezentowany wzdłuż osi X, a całkowity strumień (p/s) wzdłuż osi Y. Dla każdego tygodnia weź parametr Strumień całkowity (p/s) dla każdej grupy próby i określ wszelkie istotne różnice za pomocą nieparametrycznego testu t-Studenta.</li>
</ol>

<ol><li>Waks, A. G., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+treatment%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Breast cancer treatment: A review.</a> JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).</li>
<li>Jin, X., Mu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer%3A+Basic+and+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).</li>
<li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175(2011).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967(2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The whole picture.</a> Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+tumor+burden+and+molecular+pathways+in+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).</li>
<li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).</li>
<li>Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Different+Methods+for+Determining+Cell+Proliferation+in+Breast+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54040(2016).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077(2010).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+breast+tumors+as+preclinical+models+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173(2020).</li>
<li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316(2020).</li>
<li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li>
<li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+peroxidase+8+%28GPX8%29%2FIL-6%2FSTAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy ujawnili, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Eksperymenty na zwierzętach są obowiązkowe w badaniach nad rakiem 7,8,9 i rzeczywiście opracowano wiele protokołów 3,6,10,11,12,13,14. Jednak większość z tych badań określała efekt biologiczny dopie...

Rak piersi jest częstym rodzajem raka na całym świecie, z około 250 000 nowych przypadków diagnozowanych każdego roku w Stanach Zjednoczonych1. Pomimo wysokiej częstości występowania, nowy zestaw leków przeciwnowotworowych znacznie poprawił wyniki leczenia pacjentów z rakiem piersi2. Jednak te metody leczenia są nadal niewystarczające, ponieważ wielu pacjentów doświadcza nawrotu choroby i przerzutów do ważnych narządów2, co jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności pacjentów. Dlatego jednym z głównych wyzwań w badaniach nad rakiem piersi jest identyfikacja mechanizmów molekularnych regulujących powstawanie dystalnych przerzutów w celu opracowania nowych sposobów hamowania ich rozwoju.
Przerzuty raka to dynamiczny proces, w którym komórki odrywają się od pierwotnego guza i atakują sąsiednie tkanki poprzez krążenie krwi. Tak więc modele zwierzęce, w których komórki przechodzą podobną kaskadę przerzutów, mogą ułatwić identyfikację mechanizmów rządzących tym procesem3,4. Ponadto te modele in vivo są niezbędne do opracowania środków terapeutycznych na raka piersi5,6. Jednak te modele ortotopowe nie mogą wskazać rzeczywistej kinetyki wzrostu guza, ponieważ efekt jest określany dopiero po zakończeniu. Dlatego opracowaliśmy narzędzie oparte na lucyferazie do wykrywania rozwoju guza i kolonizacji przerzutów w czasie rzeczywistym. Dodatkowo komórki te wyrażają GFP w celu wykrycia kolonii przerzutowych. To podejście jest stosunkowo proste i nie obejmuje żadnych inwazyjnych procedur3. Tak więc połączenie lucyferazy i wykrywania fluorescencji jest pomocną strategią w celu przyspieszenia badań przedklinicznych nad terapią raka piersi i leczeniem choroby.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml probówki eppendorfa</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L końcówki</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L końcówki</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L końcówki</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytki CZARNE z płaskim dnem</td><td>Bar Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczne liczniki komórek</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>Sorter BD FACSAria III</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3 igły 27 G (3/4'')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki BD Plastipak 1 ml x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm Naczynie stylowe</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm Stylowe naczynie</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory liczenia komórek Countess</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM), wysoka zawartość glukozy, bez glutaminy</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Eclipse 80i</td><td>Wirówka Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eppendorf 5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Podarowany z laboratorium dr Yossi Buganim (Uniwersytet Hebrajski w Jerozolimie)</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>Podarowane z laboratorium dr Liora Nissima (Uniwersytet Hebrajski w Jerozolimie)</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Branże biologiczne</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do żywego obrazu</td> Bioluminescencja <td>PerkinElmer</td><td></td><td> pomiar</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td>Dostarczone przez Davida M. Sabatiniego" s lab (instytut Whiteheada, Boston, USA)</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Dostarczone przez Davida M. Sabatiniego' s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 90 mm (90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 25ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Lucyferasza-V5 plazmid blast</td><td>Addgene</td><td>#98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki odczynników</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Mikroskopy stereoskopowe</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Bio-Lab</td><td></td><td></td>190359400</tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,5% roztwór</td><td>Branże biologiczne</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA roztwór B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Branże biologiczne</td><td>03-052-1a Filtry próżniowe</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>środek</td><td></td>dezynfekujący</tr><tr><td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Odczynnik do transfekcji Sigma</td><td>Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie wzrostu raka piersi i tworzenia kolonii przerzutowych u myszy za pomocą bioluminescencji

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Rak piersi jest częstym niejednorodnym nowotworem złośliwym i drugą najczęstszą przyczyną śmiertelności u kobiet, głównie z powodu przerzutów do odległych narządów. Wygenerowano kilka modeli zwierzęcych, w tym szeroko stosowane ortotopowe modele myszy, w których komórki rakowe są wstrzykiwane do poduszeczki tłuszczowej sutka. Jednak modele te nie mogą pomóc w monitorowaniu kinetyki wzrostu guza i kolonizacji przerzutowej. Najnowocześniejsze narzędzia do monitorowania komórek nowotworowych u myszy w czasie rzeczywistym znacznie poszerzą wiedzę na temat biologii nowotworów. 
Tutaj ustanowiono linie komórkowe raka piersi stabilnie wyrażające lucyferazy i białko zielonej fluorescencji (GFP). W szczególności technika ta obejmuje dwa sekwencyjne etapy zainicjowane pomiarem aktywności lucyferazy in vitro, a następnie implantację komórek rakowych do poduszeczek tłuszczowych sutka myszy z nieotyłym cukrzycą i ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD-SCID). Po iniekcji zarówno wzrost guza, jak i kolonizacja przerzutowa są monitorowane w czasie rzeczywistym przez nieinwazyjny system obrazowania bioluminescencyjnego. Następnie kwantyfikacja przerzutów do płuc wykazujących ekspresję GFP zostanie zbadana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu potwierdzenia zaobserwowanych wyników bioluminescencji. Ten zaawansowany system łączący lucyferazy i narzędzia do wykrywania oparte na fluorescencji ocenia przerzuty raka in vivo, co ma ogromny potencjał do wykorzystania w terapii raka piersi i leczeniu choroby.

Wygenerowano linie komórkowe raka piersi (MDA-MB-231, MCF-7 i MDA-MB-468) wykazujące ekspresję wektorów GFP i lucyferazy. Zostało to osiągnięte poprzez sekwencyjną infekcję. W pierwszej kolejności linie komórkowe raka piersi zainfekowano wektorem lentiwirusowym wykazującym ekspresję fluorescencyjnego białka GFP. Komórki GFP-dodatnie (GFP+) posortowano 2 dni po infekcji (Rycina 1A,B) i zainfekowano wektorem pLX304 Luciferase-V5. Następnie użyto blastycydyny do sele...

Tutaj opisujemy nieinwazyjną metodę monitorowania obejmującą lucyferazy i ekspresję białka zielonej fluorescencji w różnych liniach komórkowych raka piersi. Protokół ten zapewnia technikę monitorowania powstawania guza i kolonizacji przerzutów w czasie rzeczywistym u myszy.

Monitorowanie wzrostu raka piersi i tworzenia kolonii przerzutowych u myszy za pomocą bioluminescencji

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Korzystając z tego wyrafinowanego, nieinwazyjnego narzędzia, możemy monitorować w czasie rzeczywistym kinetykę wzrostu guza i kolonizację przerzutową u myszy, co ma ogromny potencjał w leczeniu raka piersi i leczeniu choroby. Połączenie lucyferazy i wykrywania fluorescencji jest pomocną strategią w rozwoju badań przedklinicznych nad progresją raka piersi i leczeniem choroby. Można to zastosować do badań nad lekami przeciwnowotworowymi.Protokół ten nie jest ograniczony do raka piersi i może być stosowany do innych nowotworów, takich jak rak płuc i trzustki. Zacznij od wyhodowania komórek GFP i lucyferazy MCF-7, MDA-MB-468 i MDA-MB-231 oddzielnie na 16-centymetrowej płytce do 80% konfluencji. Po zebraniu komórek przez trypsynizację, wysiewaj rosnącą liczbę komórek w każdym dołku na czarną 96-dołkową płytkę.Następnie napełnij wszystkie studzienki 100 mikrolitrami DMEM i inkubuj przez 16 do 24 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Przygotuj roztwór lucyferyny w PBS w stężeniu 1,5 miligrama na mililitr i przechowuj roztwór w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po inkubacji delikatnie umyj komórki raz PBS przed dodaniem 100 mikrolitrów roztworu lucyferyny d

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Eksperymentalny model przerzutów do kości u myszy został ustanowiony po dokardialnym podaniu komórek guza piersi wykazujących ekspresję lucyferazy. Rozwój guza oraz powstałe zmiany osteolityczne monitorowano podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz mikro-CT.

Monitorowanie przerzutów nowotworowych i zmian osteolitycznych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i mikro-tomografii komputerowej

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

Źródło:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instytut Nauk Biologicznych, Uniwersytet w Brasílii, 2Zakład Podstawowych Procesów Psychologicznych, Instytut Psychologii, Uniwersytet w BrasíliiTen film przedstawia procedurę śledzenia progresji guza in vivo poprzez wstrzyknięcie...

Obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza piersi w modelu mysim płci żeńskiej

Obrazowanie bioluminescencyjne jest dobrze znanym narzędziem do lokalizacji guzów i przerzutów, ale kwantyfikacja tych obrazów często wymaga skomplikowanych obliczeń i specjalnych instrumentów. Opisujemy łatwą w użyciu metodę luminoscore, opartą na precyzyjnych warunkach akwizycji, niewymagającą obliczeń i umożliwiającą monitorowanie obciążenia guzem i odpowiedzi na leczenie w modelach mysich.

Metoda kwantyfikacji guza oparta na bioluminescencji do monitorowania progresji guza i efektów leczenia w modelach chłoniaka myszy

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Poznaj nieinwazyjną metodę monitorowania wzrostu guza i kolonizacji przerzutowej raka piersi u myszy przy użyciu bioluminescencji lucyferazy. Technika ta umożliwia badania przedkliniczne nowotworów.

Monitorowanie wzrostu raka piersi i tworzenia kolonii przerzutowych u myszy za pomocą bioluminescencji

Przeglądaj więcej filmów