Name: In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach wycinków mózgu myszy embriogenicznej. Technika obejmuje elektroporację DNA, przygotowanie plastrów organotypowych oraz analizę obrazowania wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Marii Eugenii Bernis za sfotografowanie zabiegów. Dziękujemy również Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Maxowi Schelskiemu i Sinie Stern za przeczytanie i omówienie manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni naszym znakomitym asystentkom technicznym, Jessice Gonyer, Blanci Randel i Anh-Tuan Pham. Doceniamy cenne wsparcie ze strony zakładu mikroskopów świetlnych i zakładu dla zwierząt DZNE. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), Międzynarodową Fundację Badań nad Paraplegią (IRP) oraz Wings for Life (przy FB). F.B. jest członkiem klastra doskonałości ImmunoSensation2, SFB 1089 i 1158 oraz laureatem Nagrody Rogera De Spoelbercha.

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
<li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li>
<li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li>
<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
<li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li>
<li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li>
<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
<li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li>
<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
<li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li>
<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

To, w jaki sposób stożki wzrostu wyczuwają i reagują na otaczające je środowisko, aby koordynować jednoczesne rozszerzanie aksonów i prowadzenie, jest nadal przedmiotem dyskusji 3,18. Pionierskie badania nad substratami 2D dały wgląd w podstawowe mechanizmy molekularne generujące siły, które napędzają dynamikę stożka wzrostu podczas formowania aksonów, wzrostu i nawigacji 2,10,11,12,19. Niedawne badania nad matrycami 3D ujawniły, jak duży wpływ ma trzeci wymiar na zachowanie stożka wzrostu, a w konsekwencji na wzrost aksonów 8,9. Niemniej jednak skomplikowane mechanizmy instruujące dynamikę stożków wzrostu in vivo wymagają jeszcze dokładnego zbadania.
Przygotowanie organotypowych kultur warstwowych z mózgów IUE lub EUE jest szeroko stosowane i dobrze udokumentowane. Stała się złotym standardem, pozwalającym naukowcom uzyskać wgląd w rozwój i zachowanie neuronów w żywej tkance mózgowej20,21. Rzeczywiście, technika ta została z powodzeniem wykorzystana w połączeniu z różnymi technikami obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji określonych procesów molekularnych i zdarzeń morfologicznych in situ. Badania takie obejmują między innymi tworzenie i wydłużanie aksonów19,22, migrację neuronów korowych 19,22,23,24, dynamikę centrosomów 25,26, dynamikę mikrotubul27, a także dynamikę funkcjonalną przedziałów pre- i postsynaptycznych 28,29.
Protokół ten wypełnia lukę w neurobiologii eksperymentalnej, wizualizując dynamikę stożka wzrostu rozwijających się neuronów korowych in situ, w ostrych kulturach wycinków mózgu ex vivo oraz narzędzia do analizy uzyskanych danych.
Do ustalenia tego protokołu wykorzystano ostre kultury wycinków mózgu, ponieważ (1) przy odrobinie praktyki są one łatwe do wygenerowania; (2) przedstawić dostępny system do badania stożków wzrostu osadzonych w quasi-całkowicie fizjologicznym środowisku, a jednocześnie wystarczająco przezroczysty, aby umożliwić obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości; (3) może być rozszerzony do użytku o niezliczoną ilość transgenicznych linii myszy; (4) w połączeniu z IUE lub EUE, zapewniają praktycznie nieograniczony potencjał dostarczania narzędzi molekularnych do oceny wydajności stożków wzrostu i aksonów in vivo w reżimach utraty/wzmocnienia funkcji, wraz z fluorescencyjnymi reporterami i sondami cytoszkieletowymi.
Metodologia ta została opisana zarówno w kontekście EUE, jak i IUE. Chociaż nadal jest to wysoce wiarygodna metoda, EUE spowodowała zwiększoną częstość występowania wycinków mózgu wykazujących zdezorganizowaną sieć RG w porównaniu z tymi uzyskanymi za pomocą IUE jako metody dostarczania (Figura 4C). Zaburzenia w matrycy RG silnie wpływają na migrację neuronów i wzorzec wydłużania aksonów30,31. Są to kluczowe parametry, które przewidują, gdzie w danym momencie znaleźć aksony do analizy i rodzaj środowiska, w którym się poruszają. Wycinki mózgu ze znacznie zakłóconą siecią RG zazwyczaj mają upośledzoną stratyfikację neuronów korowych. To z kolei wytwarza aksony o chaotycznych trajektoriach. Dlatego zdecydowanie zaleca się kontrolę integralności strukturalnej sieci RG. Co ciekawe, słaba integralność strukturalna koreluje ze zwiększonym wiekiem mózgu embrionalnego. Rzeczywiście, takich efektów u młodszych zarodków E12.5-E13.5 zazwyczaj nieobserwowano19.
Obecny protokół jest dokładny i prosty. Niemniej jednak istnieje kilka krytycznych kroków, w których należy zachować szczególną ostrożność i uwagę, aby uzyskać optymalne wyniki. Zostały one wyraźnie zaznaczone w protokole i obejmują (1) dostrojenie ilości DNA używanego w elektroporacji w celu uzyskania rzadkiego znakowania; (2) unikanie uszkodzeń podczas ekstrakcji mózgu; (3) kontrolowanie temperatury agarozy podczas obudowy mózgu; (4) rozwiązywanie problemów z ustaleniem idealnego procentu agarozy dla mózgu w danym wieku; oraz (5) dobór fluoroforów, których doświadczenie następuje. Podczas optymalizacji protokołu przetestowano działanie kilku fluoroforów w obrazowaniu in situ żywych komórek. Do tego protokołu wybrano monomeryczne warianty GFP EGFP i NeonGreen do przygotowania plazmidów znakowanych LifeAct i Lyn (Figura 5A,B). Dodatkowo przetestowano wariant RFP mScarlet i uznano, że jest bardzo odpowiedni dla tej konfiguracji (dane nie pokazane). Przetestowano również multimeryczny tRFP (dimer) i ZsGreen (tetramer) (Rysunek 5C i Dodatkowe wideo 1, po prawej). Te szybko składające, super jasne fluorofory są zalecane, gdy metoda wymaga szybkiego generowania sygnału fluorescencyjnego po dostarczeniu DNA.
Powszechną praktyką w stosowaniu kultur warstwowych jest wykorzystywanie wycinków z różnych mózgów do testowania warunków kontrolnych i eksperymentalnych. Stanowi to nieodłączne źródło niepożądanej zmienności. W tym przypadku zastosowano system ekspresji, który umożliwia niezależną modyfikację sąsiednich neuronów i ekspresji reporterów w celu identyfikacji. Zauważ, że w tej demonstracji (Figura 5C) nie było różnic między neuronami wyrażającymi którykolwiek z fluoroforów. Jednak, na przykład, taka mieszanka plazmidów w połączeniu z transgeniczną linią myszy zawierającą gen wrażliwy na Cre oznaczy neuronami tRFP (Dre-wrażliwymi), które pozostały jako dzikie typy. W przeciwieństwie do tego, ZsGreen (również wrażliwy na Cre) oznaczy zrekombinowane neurony. W związku z tym stożki wzrostu dwóch różnych genotypów, a prawdopodobnie także fenotypy, mogą być badane obok siebie jednocześnie w tym samym wycinku mózgu.
Lokalizacja aksonów i stożków wzrostu do analizy jest ważną kwestią. Neurony korowe polaryzują się podczas promieniowej migracji ze strefy komorowej (VZ) w kierunku płytki korowej (CP). Podczas tego procesu neurony tworzą proces wiodący (przyszły dendryt) i proces końcowy, który stanie się aksonem, ostatecznie łącząc się z pionierskimi aksonami w strefie pośredniej (IZ), ustanawiając drogi aksonów32. Dlatego, aby uchwycić stożki wzrostu aksonów, przeprowadzono obrazowanie na włóknach aksonalnych w IZ, w tym aksonach wychodzących z CP i wcześnie wygenerowanych aksonach już związanych z wiązkami aksonalnymi; lub ostatecznie we włóknach, które przecinają IZ i rozciągają się poniżej niego (ryc. 7).
Protokół ten umożliwia wykonywanie obrazowania neuronów w superrozdzielczości w wycinkach organotypowych. Historycznie rzecz biorąc, rozpraszanie światła było poważnym problemem, z jakim borykano się podczas obrazowania grubych próbek. W ciągu ostatnich dwóch dekad znaczny postęp w technologiach optycznych umożliwił obrazowanie grubych próbek. W tym przypadku wykorzystano obiektyw o dużej odległości roboczej, aby lepiej uwidocznić mniejsze struktury, takie jak stożki wzrostu. Nieuchronnie protokół ten nie obejmuje bardziej szczegółowych zdarzeń, takich jak wsteczny przepływ aktyny lub dynamika mikrotubul. Obiektyw o dużej odległości roboczej, który wymaga mniejszej apertury numerycznej (NA), zachowuje informacje z grubych warstw. Możliwe było jednak również dostosowanie tego protokołu do użytku z celami o krótszej odległości roboczej. Wymagało to płynnego przeniesienia plastrów do naczynia ze szklanym dnem, aby zachować integralność strukturalną. Jednak zastosowanie tej metody skutkowało krótszym przeżyciem – ~15 h – ze względu na utratę wymiany gazowej (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do kultur 2D, stożki wzrostu w 3D zajmują większą objętość i wymagają kompensacji artefaktu ruchu w osi z. Aby zwiększyć zdolność obrazowania szczegółowych zdarzeń, należy zastosować nowoczesną technologię konfokalną. Dlatego zaleca się stosowanie szybko skanującego silnika z-stack, takiego jak z-Galvo dostępny w bardzo czułych mikroskopach konfokalnych33.
Warto zauważyć, że protokół ten ma trzy główne ograniczenia. Po pierwsze, często trudno jest kontrolować poziomy ekspresji/liczbę komórek eksprymujących dowolny plazmid in vivo. Wprowadza to zmienność między wszystkimi warstwami, nawet przy utrzymaniu tego samego stężenia plazmidu. W związku z tym wybór elementów regulacyjnych w stosowanych wektorach ekspresji musi być z góry określony z ostrożnością. Po drugie, obrazowanie szczegółowych zdarzeń za pomocą wkładek membranowych nie jest obecnie możliwe. To drugie ograniczenie może zostać przezwyciężone dzięki aktualizacjom metodologicznym zaproponowanym w poprzednim ustępie. Wreszcie, stożki wzrostu są bardzo wrażliwe na światło i mogą szybko ulec fotowybielaniu. Dlatego częste obrazowanie stożków wzrostu, trwające zaledwie 5 minut przy użyciu laserowych mikroskopów skaningowych, często może spowodować zapadnięcie się stożków wzrostu. W związku z tym nowe osiągnięcia w dziedzinie urządzeń generowanych za pomocą mikroskopii świetlnej mogą być dostosowane do długoterminowego obrazowania wycinków mózgu34.
Tego typu protokoły mają otworzyć nowe ścieżki badawcze, pozwalając lepiej zrozumieć, co jest potrzebne, aby stożek wzrostu odczytywał i reagował na złożone środowisko in vivo , a co ważniejsze, aby rozwikłać mechanikę tej wyrafinowanej interakcji.

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, które reprezentują podstawową jednostkę obliczeniową w układzie nerwowym. Odbierają i emitują informacje, które opierają się na podziałach na miejsca wejściowe i wyjściowe: odpowiednio dendryty i aksony1. Podczas tworzenia aksony rozszerzają się, poruszając się w niewiarygodnie złożonym środowisku, aby dotrzeć do celu. Nawigacja w aksonach jest kierowana przez stożek wzrostu, strukturę czuciową znajdującą się na końcu rozwijającego się aksonu. Stożek wzrostu jest odpowiedzialny za wykrywanie sygnałów środowiskowych i przekształcanie ich w dynamiczną reorganizację przestrzenną swojego cytoszkieletu2,3. Powstałe w ten sposób reakcje morfomechaniczne instruują stożek wzrostu, aby wysunął się lub wycofał z sygnału wyzwalającego, co prowadzi do określonych manewrów aksonów.
Obecne zrozumienie dynamiki rozciągania aksonów i wzrostu wynika z badań oceniających wzrost aksonów na dwuwymiarowych (2D) podłożach2,4,5,6,7. Te pionierskie badania zidentyfikowały wyrafinowane wzajemne oddziaływanie między stożkami wzrostu a podłożami wzrostu i ujawniły uderzające różnice w zależności od cech podłoża, takich jak przyczepność i sztywność8,9. Na podstawie tych spostrzeżeń postawiono hipotezę, że zewnątrzkomórkowe sygnały środowiskowe dyktują wzrost aksonów, przy czym cytoszkielet stożka wzrostu wykonuje ten wzrost2,10,11,12. Warto zauważyć, że neurony mogą rozszerzać aksony w podłożach nieadhezyjnych (np. polilizyna, poliornityna)13. Co więcej, sztywność podłoża może wpływać na szybkość wzrostu aksonów niezależnie od kompleksów adhezyjnych komórek8. W związku z tym badanie dynamiki stożków wzrostu w samych substratach 2D nie może dokładnie modelować równowagi sił, które powstają w wyniku interakcji aksonalnych stożków wzrostu z fizjologicznie istotnymi środowiskami trójwymiarowymi (3D), takimi jak te występujące in vivo.
Aby przezwyciężyć ograniczenia testów 2D, wzrost aksonów i dynamika stożków wzrostu zostały zbadane w matrycach 3D8,9. Macierze te stanowią bardziej fizjologiczny kontekst, a jednocześnie pozwalają na badanie wewnętrznych mechanizmów wzrostu aksonów w komórce. Umożliwia badanie stożka wzrostu w sposób jednokomórkowy w różnych warunkach i zabiegach farmakologicznych9. W takich środowiskach 3D aksony wykazywały wyraźną dynamikę cytoszkieletu i rosły szybciej niż te obserwowane w neuronach hodowanych w 2D9. Te eleganckie badania wykazały wpływ dodatkowego wymiaru na reorganizację cytoszkieletu stożka wzrostu, a w konsekwencji na jego zachowanie.
Pomimo oczywistych zalet prezentowanych przez matryce 3D w porównaniu z powierzchniami 2D we wspieraniu natywnego rozwoju neuronów i wzrostu aksonów, pozostają one uproszczonym syntetycznym rusztowaniem, które nie jest w stanie odzwierciedlić złożoności dynamiki obserwowanej w tkance ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W tym przypadku dostarczanie plazmidów reporterowych za pomocą elektroporacji ex utero i in utero połączono z organotypową hodowlą plastrów mózgu i obrazowaniem in situ w super rozdzielczości w celu analizy dynamiki stożków wzrostu w kontekście fizjologicznym. Metodologia ta pozwala na wizualizację rozwijających się aksonów przy jednoczesnym doświadczaniu trójwymiarowości środowisk in vivo i złożoności ich składu fizykochemicznego. Na koniec opisano przyjazne dla użytkownika procedury pomiaru wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu przy użyciu powszechnie licencjonowanego i publicznie dostępnego oprogramowania.

<table><tbody><tr><td>Adson Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Goat Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Goat Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin przeciwciało</td><td>sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>Mysz monoklonalna, klon LN-6, płyn wodobrzuszny</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod DMZ</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>Model ProClip UltraEdge Super 2-Speed</td></tr><tr><td>Enrofloksacyna (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2,5% (wt/vol)</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek Eppendorf</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Zawartość barwnika > 85 %</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Wodne medium</td><td>montażowe sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>Suplement 5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna rozwiązanie</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S wibratome</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 z Airyscan</td><td>Myszy Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg 8890217</td><td></td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Janvier</td><td>Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania mikropipet</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; mm, hydrofilowy PTFE, 0.4&nbsp; &mikro; m</td></tr><tr><td>Łyżki perforowane Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium, minus czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Neuropan-2</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Uchwyt na igły z nożyczkami</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dysz PicoNozzle v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa pęseta</td><td>Aparat Harvard</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>Zestaw QIAGEN Maxi</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Odblaskowe zamykanie ran Clip</td><td>World Precision Instruments</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>System elektroporacji fali prostokątnej ECM830</td><td>Harvard Aparat</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna lubrykantna maść do oczu</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawice chirurgiczne</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 jedwabne szwy chirurgiczne</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr> <tr><td>i mikro;-Slide 8 Well Szklane dno</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Podczas rozwoju neuronów, aksony poruszają się po środowisku korowym, aby dotrzeć do swoich końcowych miejsc docelowych i ustanowić połączenia synaptyczne. Stożki wzrostu - struktury czuciowe znajdujące się na dystalnych końcach rozwijających się aksonów - wykonują ten proces. Badanie struktury i dynamiki stożka wzrostu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozwoju aksonów i interakcji z otaczającym ośrodkowym układem nerwowym (OUN), które umożliwiają mu tworzenie obwodów nerwowych. Ma to zasadnicze znaczenie przy opracowywaniu metod reintegracji aksonów z obwodami neuronalnymi po urazie w badaniach podstawowych i kontekstach przedklinicznych. Dotychczasowe ogólne zrozumienie dynamiki stożków wzrostu opiera się przede wszystkim na badaniach neuronów hodowanych w dwóch wymiarach (2D). Chociaż niewątpliwie ma to fundamentalne znaczenie dla obecnej wiedzy na temat dynamiki strukturalnej stożków wzrostu i reakcji na bodźce, badania 2D błędnie przedstawiają fizjologiczne trójwymiarowe (3D) środowisko, z którym spotykają się stożki wzrostu neuronów w nienaruszonej tkance OUN. Niedawno zastosowano żele kolagenowe w celu przezwyciężenia niektórych z tych ograniczeń, umożliwiając badanie rozwoju neuronów w 3D. Jednak zarówno syntetyczne środowiska 2D, jak i 3D nie mają wskazówek sygnalizacyjnych w tkance OUN, które kierują rozszerzaniem i odnajdywaniem ścieżki rozwijających się aksonów. Protokół ten zapewnia metodę badania aksonów i stożków wzrostu przy użyciu organotypowych wycinków mózgu, w których rozwijające się aksony napotykają fizjologicznie istotne wskazówki fizyczne i chemiczne. Łącząc precyzyjnie dostrojoną elektroporację in utero i ex utero w celu rzadkiego dostarczania fluorescencyjnych reporterów wraz z mikroskopią superrozdzielczą, protokół ten przedstawia metodologiczną linię produkcyjną do wizualizacji dynamiki aksonów i stożków wzrostu in situ. Ponadto dołączono szczegółowy opis zestawu narzędzi do analizy danych z obrazowania długoterminowego i żywych komórek.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy zastosowaniu opisanego schematu metody. W niniejszej demonstracji wykorzystano myszy w stadium E15.5, choć protokół ten można z łatwością dostosować do niemal wszystkich etapów rozwoju zarodkowego od E11 do późnego E17. W niniejszym protokole zastosowano albo ex utero elektroporacja (EUE; Rysunek 2A, 2C-I) lub wewnątrzmacicznie elektroporacja (IUE; Rysunek 2B,C oraz 2J-Q) wykorzystano do wprowadzenia plazmidów do neuronów progenitorowych wyścielających komory boczne. Progenitory te stanowią źródło przyszłych neuronów rzutujących do kory (CPN)15,16Przygotowano mieszaniny plazmidów w celu uzyskania rzadkiej, specyficznej dla neuronów ekspresji albo białka skierowanego do błony komórkowej (Lyn)-mNeonGreen (Rysunek 1A) lub (E)GFP wzmocnione LifeAct (Rysunek 1B) w celu oceny odpowiednio ogólnego zachowania oraz dynamiki aktyny w stożkach wzrostu. Ponadto zastosowano mieszaninę plazmidów mającą na celu znakowanie poszczególnych neuronów białkiem turbo(t)-RFP lub zielonym białkiem fluorescencyjnym zoanthus sp. (ZsGreen) (Rysunek 1C) został uwzględniony. Ułatwia to monitorowanie zachowania stożków wzrostu niezależnych, sąsiadujących neuronów.
Disekcja mózgu z elektroporowanych embrionów jest kluczowym krokiem, który musi być przeprowadzony z dużą starannością w celu uzyskania wysokiej jakości przekrojów przy zachowaniu natywnej struktury mózgu. Narzędzia do disekcji oraz wibratom przygotowano wcześniej i starannie wysterylizowano etanolem (Rysunek 3A,B). Następnie starannie wypreparowano głowy elektroporowanych embrionów i wyekstrahowano mózgi. Przedstawiono tutaj reprezentatywną disekcję mózgów embrionów poddanych EUE na etapie E15 (Rysunek 3C-F) oraz E12.5 (Rysunek 3G-J). Mózgi są niezwłocznie zamykane w matrycy agarozowej, cięte w plastry i umieszczane na wkładkach z membrany PTFE w naczyniu z szklanym dnem w celu inkubacji (Rysunek 3K-M).
Stan zdrowia skrawków mózgu jest istotnym punktem kontrolnym, zapewniającym wiarygodność wyników. Codziennie przeprowadzano wizualną inspekcję w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń. Ponadto, po zakończeniu hodowli, skrawki mózgu utrwalano i poddawano immunohistochemii. W tym celu zastosowano 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) do kontroli ogólnej organizacji komórkowej oraz barwienie na wimentynę w celu uwidocznienia organizacji glejowej, w szczególności rusztowania glej radialny (RG). Zazwyczaj pomyślnie wyhodowane skrawki mózgu pochodzące z elektroporacji IUE lub EUE wykazują prawidłowy rozkład komórek w barwieniu DAPI oraz w pewnym stopniu zorganizowany układ RG z procesami kontaktującymi się z oponą miękką, zorientowanymi apikalnie17 (Rycina 4A, B odpowiednio). Okazjonalnie w hodowanych skrawkach mózgu obserwuje się wyraźne zaburzenia rusztowania RG, szczególnie w tych pochodzących z elektroporacji EUE (Rycina 4C). Skrawki mózgu z niezwykle zdezorganizowanym rusztowaniem RG wykazują upośledzoną migrację neuronów i wadliwy wzrost aksonów (nie pokazano). Zatem kontrola rusztowania RG jest prostą metodą po hodowli, pozwalającą na selekcję danych uzyskanych z wiarygodnych skrawków mózgu.
Przekroje mózgu uzyskane zarówno z IUE, jak i EUE z mieszaniną plazmidów wykazujących ekspresję Lyn-mNeonGreen prowadzą do podobnego rzadkiego znakowania neuronów. Jako przykład przedstawiono reprezentatywny piramidowy neuron projekcyjny kory (CPN) wykazujący ekspresję Lyn-mNeonGreen oraz dynamiczne zachowanie jego stożka wzrostu (Rysunek 5A i Film uzupełniający 1, (lewy górny róg). Dodatkowo neurony oznakowano za pomocą plazmidu wykazującego ekspresję sondy aktynowej w celu analizy dynamiki aktyny w stożkach wzrostu aksonów in situ (Rycina 5B i Film uzupełniający 1, lewy dolny róg). In situ eksperymenty przeprowadzono również z wykorzystaniem plazmidu o podwójnym projekcie, wykazującego ekspresję fluoroforów sterowaną przez Cre i Dre (Rycina 1C i Wideo uzupełniające 1, prawo). fluorofory tRFP lub ZsGreen w tym plazmidzie mogłyby zostać aktywowane specyficznie i indywidualnie przez rekombinazy Dre lub Cre, odpowiednio, w sąsiednich neuronach (Rysunek 5C). Taki układ eksperymentalny umożliwia równoległą analizę stożków wzrostu neuronów kontrolnych oraz sąsiadujących z nimi neuronów zmodyfikowanych (w przypadku dowolnej utraty lub uzyskania funkcji). Pozwala to uniknąć zmienności wynikającej z zastosowania różnych przekrojów do testowania warunków kontrolnych i eksperymentalnych.
Przeanalizowano kymografy wygenerowane z zarejestrowanego filmu, z których można łatwo uzyskać dynamiczne parametry wzrostu, takie jak aktywność protruzywna w czasie oraz długość wzrostu (Rycina 6A). Należy zauważyć, że prosta regulacja rozdzielczości czasowej filmu poklatkowego pozwala na pomiar prędkości elongacji aksonu przez 2 h (Rycina 6A). Ponadto, przy użyciu licencjonowanego oprogramowania, można łatwo uzyskać informację o zmianie objętości stożka wzrostu w czasie – mierniku ogólnej dynamicznej aktywności stożka wzrostu (Rycina 6B i Rycina 6E,F). Może to służyć do oceny prędkości treadmillingu aktyny oraz równowagi między filopodiami a lamelipodiami podczas aktywności eksploracyjnej stożka wzrostu.
<img alt="Schemat edycji genów; metoda rekombinazy Cre/Dre; funkcja promotora eukariotycznego; ekspresja GFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematy plazmidów użytych w protokole. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Istotne informacje dotyczące komponentów plazmidowych i pochodzenia fluoroforów znajdują się w ramkach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układy do elektroporacji: techniki ex utero i in utero, w tym sprzęt i kroki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat elektroporacji ex utero oraz in utero u myszy w dniu E15.5. (A) Konfiguracja stanowiska chirurgicznego do elektroporacji ex utero. (B) Konfiguracja stanowiska chirurgicznego do elektroporacji in utero. (C) Rogi macicy wyciągnięte poza jamę brzuszną znieczulonej myszy. (D) Wyjęcie zarodka z woreczka macicznego. (E) Uśmiercenie zarodka poprzez całkowite przecięcie rdzenia kręgowego via cięcie ukośne; należy zauważyć, że uniknięto dekapitacji. (F) Umieszczenie zarodka w uchwycie i wstrzyknięcie mieszaniny DNA/Fast Green do lewego komory bocznej. (G,H) Ułożenie głowy zarodka między platynowymi elektrodami pęsetowymi z katodą (czerwona strzałka) nad korą pod kątem 60°. (I) Umieszczenie kończyn zarodka (czarne strzałki) na zewnątrz uchwytu, aby zapobiec przesuwaniu się zarodka podczas procedury. (J) Obrócenie zarodka wewnątrz woreczka macicznego w celu odsłonięcia głowy. (K,L) Wstrzyknięcie mieszaniny DNA/Fast Green do komór bocznych zarodka przez ścianę macicy. (M) Ułożenie głowy zarodka między platynowymi elektrodami pęsetowymi z katodą (czerwona strzałka) nad korą pod kątem 60°. (N) Zaszycie nacięcia mięśni via szew ciągły z blokowaniem. (O) Zaszycie nacięcia skóry via szew przerywany. (P) Zabezpieczenie rany za pomocą chirurgicznych klipsów do ran i dezynfekcja betadyną. (Q) Umieszczenie myszy w klatce rekonwalescencyjnej z lampą grzewczą emitującą daleką podczerwień. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyjęcie mózgu i przygotowanie hodowli organotypowej; obrazy mikroskopowe przedstawiające sekcję zarodkowego mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Procedura wyjęcia mózgów zarodków w dniach E15,5 i E12,5 oraz hodowla organotypowa plastrów tkankowych. (A) Narzędzia użyte do procedury wyjęcia mózgu. (B) Konfiguracja stacji hodowli organotypowej. (C-F) Wyjęcie mózgu w dniu E15,5. (G-J) Wyjęcie mózgu w dniu E12,5. Linie przerywane wskazują miejsca nacięć. Czerwone strzałki wskazują kierunek pociągnięcia pęsetą. (K) Osadzanie mózgu w naczyniu o średnicy 3 cm zawierającym 3% niskotopliwą agarozę, z pozostawieniem 1-2 mm przerwy z agarozy pod mózgiem. (L) Pobranie plastra mózgu o grubości 150 µm. (M) Umieszczenie plastrów mózgu na wkładkach z membrany PTFE unieruchomionych w naczyniu o średnicy 35 mm za pomocą folii parafinowej (niebieska strzałka). Czerwona gwiazdka oznacza pobranie konkretnego plastra mózgu z wibratomu (L) i jego przeniesienie na membranę PTFE (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie metod elektroporacji; barwienie wimentyną i DAPI; schemat mikroskopowy; analiza neuronalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zachowana struktura komórek glei radialnej w zdrowych skrawkach organotypowych. Obrazy konfokalne skrawków mózgu E17.5 ukazujące układ RG (vimentin; zielony) oraz ogólną organizację komórek (DAPI; magenta) po IUE (A) i EUE (B,C). Należy zwrócić uwagę na silne zaburzenia w układzie RG, które mogą sporadycznie wynikać z EUE (C). Powiększenia odpowiadają czerwonym przerywanym ramkom na głównym rysunku: paski skali, 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna neuronów, markery tRFP/ZsGreen, uwidaczniające strukturę cytoszkieletu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: In situ wizualizacja dynamiki stożków wzrostu w ostrych skrawkach organotypowych. (A,B) Neurony i odpowiadające im stożki wzrostu znakowane odpowiednio Lyn-mNeonGreen oraz LifeAct-GFP. Czerwona gwiazdka oznacza stożek wzrostu neuronu wykazującego ekspresję Lyn-mNeonGreen. Niebieski asterysk oznacza stożek wzrostu neuronu wykazującego ekspresję LifeAct-GFP. (C) Sąsiadujące neurony znakowane podwójnym systemem plazmidowym zawierającym tRFP (magenta) i ZsGreen (zielony) oraz odpowiadające im stożki wzrostu. Stożki wzrostu obrazowane (po prawej) znajdowały się poza uchwyconą klatką (po lewej), uzyskane krótko po zarejestrowaniu time-lapse stożka wzrostu; paski skali, 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza wzrostu aksonów Lyn-mNeonGreen; mikroskopia fluorescencyjna, wykresy prędkości wzrostu, wykres objętości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Analiza prędkości wzrostu aksonów i objętości stożka wzrostu. (A) Śledzenie aksonu w neuronie wykazującym ekspresję Lyn-mNeonGreen (góra) oraz odpowiadający mu kymograf (dół) wygenerowany w programie ImageJ. (B) Rekonstrukcja wideo z serii obrazów z-stack stożka wzrostu z wykorzystaniem oprogramowania do analizy obrazu (góra) oraz ten sam stożek wzrostu zaznaczony za pomocą narzędzia pomiaru powierzchni (dół). (C) Wykresy przedstawiające zmiany prędkości wzrostu w czasie dla kilku aksonów. (D) Ilościowe określenie średniej prędkości wzrostu aksonów z wykresów w punkcie (C). (E) Wykres przedstawiający zmiany objętości stożka wzrostu w czasie. (F) Ilościowe określenie średniej objętości stożków wzrostu z wykresu w punkcie (E); pasek skali, 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat migracji neuronów; od VZ do CP; proces rozwoju mózgu; pozycjonowanie neuronów; narzędzie badawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Migracja radialna i polaryzacja neuronów piramidowych kory. Schemat ilustrujący rozwijające się neurony piramidowe kory (różowe) migrujące radialnie z zarodkowej strefy komorowej (VZ) w kierunku powierzchni opon opiłkowatych. Prowadzone przez wypustki glejowe radialne (szare), migrujące spolaryzowane neurony tworzą wypustkę prowadzącą (przyszła dendryta) oraz wypustkę podążającą (przyszły akson), która nadal rozrasta się w dół w kierunku strefy pośredniej (IZ). Czerwone przerywane ramki reprezentują obszary kory, w których obrazowano stożki wzrostu. Konkretnie w IZ, strefie podkomorowej (SVZ) lub łączących się pęczkach aksonów (zielone). Ilustracja została stworzona za pomocą narzędzia internetowego BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plazmid</td>
			<td>Stężenie (µg/µL)</td>
			<td>Przeznaczenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Znakowanie białka skierowanego do błony (Lyn)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>znakowanie aktyny włóknistej (F-aktyny) w stożkach wzrostu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Niezależne znakowanie dwóch populacji sąsiadujących neuronów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista plazmidów użytych w protokole. Nazwa, stężenie i przeznaczenie każdego wykorzystanego plazmidu.
Wideo uzupełniające 1: In situ wizualizacja dynamiki stożka wzrostu w ostrych plastrach organotypowych. Dynamika stożków wzrostu znakowanych Lyn-mNeonGreen (lewa góra) i LifeAct-GFP (lewa dół). Sąsiednie stożki wzrostu są różnie znakowane za pomocą dualnego systemu plazmidowego zawierającego tRFP (magenta; prawa góra) i ZsGreen (zielony; prawa dół). Interwał obrazowania: 2,5 s. Paski skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

To, w jaki sposób aksony poruszają się po złożonej macierzy ośrodkowego układu nerwowego, jest podstawowym pytaniem w neurobiologii. Protokół ten umożliwia badanie wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w środowisku fizjologicznym za pomocą obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje przyjazny dla użytkownika, kompleksowy proces dostarczania DNA do embrionalnego mózgu myszy, przygotowania do wysokiej jakości wycinków organotypowych oraz przewodnik krok po kroku dotyczący pozyskiwania i analizy obrazu.Chociaż pierwotnie zaprojektowano go do badania dynamiki aksonów w embrionalnym ośrodkowym układzie nerwowym, protokół ten można dostosować, aby umożliwić hodowlę organotypową i wizualizację plastyczności aksonów po stanach urazowych lub patologicznych. Sam protokół jest stosunkowo prosty. Jednak osiągnięcie pierwszego oznakowania i zachowanie struktur mózgu są punktami krytycznymi.Dlatego etapy elektroporacji, sekcji mózgu i krojenia wymagają dodatkowej ostrożności. Zademonstrowanie procedury będzie pomocne, a doktorant pochodzi z laboratorium Bracketa. Po znieczuleniu ciężarnej samicy myszy wykonaj nacięcie, aby wyciągnąć oba rogi macicy za pomocą wacika nasączonego ciepłą solą fizjologiczną lub kleszczykami, ostrożnie chwytając przestrzenie między zarodkami.Następnie umieść zarodki na mokrej gazie. Po rozcięciu worka macicznego usuń każdy zarodek. Umieść zarodki w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym HBSS uzupełniony glukozą na lodzie.W celu elektroporacji ex utero należy pobrać zarodek i umieścić go w uchwytu. Następnie ostrożnie włóż szklaną kapilarnę zawierającą szybką zieloną mieszankę DNA przez czaszkę zarodka do bocznej komory i wstrzyknij od dwóch do trzech mikrolitrów mieszanki plazmidu DNA do każdej komory. Następnie przytrzymaj głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety pod odpowiednim kątem, aby celować w żądany obszar mózgu, katodą skierowaną w stronę, w której ma nastąpić transfer DNA.W przypadku elektroporacji in utero, po wyciągnięciu rogów macicy i umieszczeniu zarodków na mokrej gazie, jak pokazano wcześniej, opuszkami palców delikatnie obróć zarodek wewnątrz macicy, aż do znalezienia szwów lambdoidalnych i strzałkowych. Następnie ostrożnie włóż szklaną kapilarnę zawierającą szybką zieloną mieszankę DNA przez ścianę macicy i czaszkę zarodka do komory bocznej i wstrzyknij dwa do trzech mikrolitrów mieszanki plazmidu DNA do jednej lub obu komór w zależności od potrzeb, maksymalnie dwa mikrolitry na komorę. Po wstrzyknięciu należy trzymać głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety pod odpowiednim kątem, aby celować w pożądany obszar mózgu, katodą skierowaną w stronę, w której ma nastąpić transfer DNA.Po elektroporacji wszystkich wymaganych zarodków użyj wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby delikatnie umieścić rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej. Zszyj nacięcia mięśni i skóry za pomocą materiału szwowego 5-0, następnie zabezpiecz ranę za pomocą klipsów do szwów i zdezynfekuj ranę, spryskując ją betadyną. Umieść mysz z powrotem w klatce regeneracyjnej i utrzymuj ciepło za pomocą ciepła dalekiej podczerwieni przez co najmniej 20 minut po zabiegu.Zamocuj głowę zarodka pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie usuń skórę z czaszki, przecinając wzdłuż linii środkowej, zaczynając od podstawy głowy w kierunku nosa. Obierz skórę w czaszce z boku, tworząc wystarczająco dużą szczelinę, aby można było wyciąć mózg.Następnie, aby usunąć mózg, włóż zamkniętą końcówkę sterylnych nożyczek preparacyjnych, zaczynając pod opuszką węchową i przesuwając się w kierunku pnia mózgu. Następnie odetnij pień mózgu i przytnij wiele luźnych kawałków opon mózgowych wokół mózgu. Za pomocą perforowanej łyżki podnieś mózg i usuń nadmiar płynu, wcierając spód łyżki w suchą bibułkę.Następnie umieść mózg w naczyniu z agarozą na lodzie. Następnie za pomocą mniejszej łyżki mieszaj agarozę przez 10 sekund, aby równomiernie się schłodzić, a następnie manewruj mózgiem do środka naczynia, umieszczając go poziomo grzbietem do góry i upewniając się, że jest całkowicie pokryty agarozą ze wszystkich kierunków. Delikatnie podnieś blok agarozy ze stacji roboczej Vibratome i osusz spód, wcierając w bibułę.Następnie umieść blok na sklejonym obszarze uchwytu na próbkę rostralną stroną mózgu skierowaną do góry i połóż uchwyt na próbkę na lodzie. Pozostaw klej do wyschnięcia na minutę. Pokrój mózg w plastry koronalne pod kątem 15 stopni.Następnie za pomocą czystych szpatułek zbierz plastry mózgu i umieść je na membranie PTFE unieruchomionej w naczyniu ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów za pomocą Parrafin. Zbierz do pięciu wycinków mózgu na błonę. Następnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usuń nadmiar roztworu glukozy HBSS z okolic plastrów na membranie, pozostawiając plastry na wpół suche, a następnie dodaj 500 mikrolitrów podgrzanej pożywki do plastrów bezpośrednio do przestrzeni pod membraną i inkubuj plastry w temperaturze 35 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Aby zobrazować wzrost aksonów, zlokalizuj region kory o niskiej lub średniej gęstości komórek. Natomiast w celu obrazowania dynamiki stożka wzrostu należy zlokalizować stożek wzrostu w strefie bezpośredniej kory lub strefie podkomorowej. Następnie zdefiniuj rozmiar stosu Z.W przypadku wzrostu aksonów w dużym stosie Z ustaw rozmiar kroku na dwa mikrometry, a dla stożków wzrostu w mniejszym stosie Z ustaw rozmiar kroku na jeden mikrometr. Aby przeprowadzić analizę danych, otwórz plik obrazu na Fidżi, klikając plik, a następnie otwórz i wybierając obraz. Uzyskaj projekcję maksymalnej intensywności upływu czasu, klikając obraz, a następnie stosy, projekcję Z i projekcję maksymalnej intensywności.Przejdź przez upływ czasu i zlokalizuj rosnący akson. Po zlokalizowaniu narysuj linię przechodzącą przez rosnący akson, zaczynając od czubka aksonu w pierwszej klatce i podążając za aksonem przez cały upływ czasu. Następnie zaśpiewaj wtyczkę kymo re-slice szeroko.Ustaw skalę kimografu, przechodząc do obrazu, a następnie właściwości. Po ustawieniu odległości w mikrometrach i szerokości pikseli oraz czasu w sekundach lub minutach oraz wysokości pikseli, przejdź do analizy i kliknij zmierz. Aby zmierzyć objętość stożka wzrostu, otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu, klikając file, open i wybierając interesujący Cię plik.Następnie wybierz kreatora dodawania nowych powierzchni w kroku pierwszym, w obszarze Ustawienia algorytmu wybierz segment tylko obszaru zainteresowania, a w kroku drugim przytnij ramkę, aby zmieścić cały stożek wzrostu we wszystkich ramkach. Następnie w kroku trzecim utrzymuj próg na bezwzględnej intensywności, a w kroku czwartym upewnij się, że cały obszar stożka wzrostu jest progowany. Następnie w kroku piątym, w obszarze Typ filtra, wybierz liczbę wokseli LMG na jeden.Wybierz przycisk Wykonaj, aby wykonać wszystkie kroki tworzenia i zakończyć kreatora dodawania nowych powierzchni. Na koniec w zakładce statystyki w górnej części okna kreatora wybierz określone wartości i wolumin na karcie szczegółowe. Zazwyczaj pomyślnie wyhodowane wycinki mózgu pochodzące z elektroporacji in utero lub ex utero wykazują normalną dystrybucję komórkową i zorganizowany układ promienistych komórek glejowych z wierzchołkowo zorientowanymi procesami pilo-kontaktowymi.Czasami obserwuje się elektroporację ex utero, wyraźne zaburzenia w promieniowym rusztowaniu glejowym i hodowanych wycinkach mózgu, co sprawia, że to barwienie kontrolne jest zalecane. Pokazano tutaj reprezentatywny neuron wystający z kory piramidalnej wyrażający Lyn-mNeonGreen i dynamiczne zachowanie jego stożka wzrostu. Dodatkowo neurony znakowano za pomocą sondy aktynowej z ekspresją plazmidu w celu analizy dynamiki aktyny w stożkach wzrostu aksonów in situ.Przeprowadzono również eksperymenty in situ z podwójnym projektem plazmidu z ekspresją fluoroforu cre dre, w którym fluorofory tRFP lub ZsGreen mogły być specyficznie i indywidualnie aktywowane przez rekombinazy dre lub cre, odpowiednio w sąsiednich neuronach. Z kimografów można łatwo uzyskać dynamiczne parametry wzrostu, takie jak szybkość wzrostu dla kilku aksonów i objętość stożka wzrostu w czasie. Można to wykorzystać do oceny szybkości bieżni aktynowej i równowagi między filopodiami a blaszkami podczas eksploracji stożków wzrostu.Ważne jest, aby utrzymać strukturę mózgu i dostroić stężenia plazmidu, aby uzyskać rzadkie znakowanie. Ma to kluczowe znaczenie dla dokładnej wizualizacji aksonów i stożków wzrostu w korze mózgowej. W zależności od wybranego osocza i tła genetycznego, protokół ten pozwala użytkownikom modyfikować neurony lub środowisko, w którym rosną, co pozwala na szeroki zakres badań.Umożliwiając dostęp do neuronów in situ w wysokiej rozdzielczości, technika ta umożliwia neuronom badanie dynamicznej interakcji między stożkami wzrostu a wskaźnikami ośrodkowego układu nerwowego zarówno na poziomie morfologicznym, jak i molekularnym.

in-situ-visualization-axon-growth-growth-cone-dynamics-acute-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Ten film demonstruje hodowlę ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych embrionów myszy. Zarodki są izolowane i osadzane w agarozie. Za pomocą wibratomu uzyskuje się plastry zawierające jądra okoruchowe i oczy. Plastry są utrzymywane w kulturze i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Poznaj metodę wizualizacji wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach wycinków mózgu myszy embriogenicznej. Technika obejmuje elektroporację DNA, przygotowanie plastrów organotypowych oraz analizę obrazowania wysokiej rozdzielczości.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Przeglądaj więcej filmów