Name: Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Poznaj technikę wstrzyknięcia wewnątrzkostnego komórek kostniakomięsaka w celu wygenerowania ortotopowego guza pierwotnego i przerzutów płucnych u myszy. Ta metoda wiernie odzwierciedla kliniczny rozwój nowotworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z (1) Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2018YFC1704300 i 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 i 82174408).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju. Czterotygodniowe samce myszy atonimiczne BALB/c aklimatyzowano przez tydzień przed operacją w celu ortotopowego wstrzyknięcia komórek kostniakomięsaka. Myszy trzymano w indywidualnie wentylowanych klatkach dla myszy z pięcioma myszami na klatkę w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do paszy SPF i sterylnej wody.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>W dniu wstrzyknięcia komórki kostniakomięsaka (143B-lucyferazy) należy dwukrotnie przemyć 80%-90% zlewających się komórek hodowanych w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej PBS (pH 7,4) i trypsynizować 1,5 ml 0,25% trypsyny przez 3 min. Następnie dodaj 6 ml 10% pożywki MEM zawierającej surowicę, aby ugasić trypsynę i zebrać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Linia komórkowa 143B-lucyferazy jest uzyskiwana z transfekcji linii komórkowej 143B z wektorem pLV-lucyferazy23.</li>
	<li>Odessać 20 μl zawiesiny komórek do komory płytki do zliczania komórek i obliczyć stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odwirować komórki przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórkowy w matrycy błony podstawnej o sile 8,5 mg/ml (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 2 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Trzymając komórki na lodzie, przynieś je na salę operacyjną. Ogniwa należy zużyć w ciągu 2 godzin 
	UWAGA: Aby uniknąć niedokładnych dawek do wstrzykiwań (na przykład z powodu martwej przestrzeni w strzykawkach), przygotowuje się dodatkową zawiesinę komórek (zwykle dwukrotność wymaganej objętości zawiesiny komórek). Macierz błony podstawnej jest cały czas utrzymywana na lodzie, ponieważ ma właściwości krzepnięcia powyżej temperatury pokojowej24.</li>
</ol>
2. Chirurgia ortotopowego wstrzykiwania komórek kostniakomięsaka
UWAGA: Narzędzia chirurgiczne są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
<ol>
	<li>Myszy były hodowane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie zabiegi zostały wykonane w aseptycznej komorze ze sterylnymi narzędziami.</li>
	<li>Znieczulij myszy, wystawiając je na działanie 2% izofluranu i 98% tlenu (natężenie przepływu tlenu, 2 l/min).</li>
	<li>Nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. 
	UWAGA: Całą procedurę należy wykonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Przed wstrzyknięciem komórek kostniakomięsaka upewnij się, że każda mysz jest pod głębokim znieczuleniem przez uszczypnięcie palca u nogi; Jeśli mysz nadal ma odpowiedzi, takie jak drgnięcie lub szarpnięcie, poczekaj długo, aż powyższe odpowiedzi znikną.</li>
	<li>Trzymaj każdą mysz w pozycji leżącej. Chwyć kostkę myszy za pomocą kciuka i palca wskazującego i zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia kości piszczelowej wacikiem z 70% etanolu. 
	UWAGA: Aby mocno trzymać kostkę myszy, zarówno kciuk, jak i opuszki palca wskazującego mają ogromne znaczenie dla kolejnych zabiegów.</li>
	<li>Obróć staw skokowy każdej myszy na zewnątrz, aby przesunąć kość piszczelową i strzałkową, a następnie zegnij staw kolanowy do odpowiedniej pozycji, aż bliższy płaskowyż kości piszczelowej (górna część kości piszczelowej) będzie wyraźnie widoczny przez skórę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
	<li>Przymocować igłę do strzykawki o pojemności 1 ml i skierować końcówkę igły w stronę miejsca wstrzyknięcia. Upewnić się, że igła strzykawki jest równoległa do długiej osi kości piszczelowej.
	<ol>
		<li>Przezskórnie wprowadzić igłę przez więzadło rzepki lub przylegające do niego, gdy przechodzi przez torebkę skórną/stawową; th0en, obróć strzykawkę (1/2 do 3/4 koła), aby wywiercić otwór w platformie piszczelowej w kierunku dystalnego końca kości piszczelowej (jamy rdzeniowej) do wstrzyknięcia komórek kostniakomięsaka za pomocą strzykawki o mikroobjętości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, C). 
UWAGA: Jednoczesny obrót kości piszczelowej może być wyczuwalny podczas wiercenia, jeśli końcówka igły jest dokładna. Upewnij się, że igła przesuwa się do przodu wraz z obrotem strzykawki, a nie jest bezpośrednio popychana do przodu, aż około połowa igły znajdzie się w kości piszczelowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź, czy igła strzykawki wykonała wyraźny ruch w kanale szpikowym, aby zapewnić pomyślne wiercenie. 
	UWAGA: Wykonaj badanie rentgenowskie (patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić prawidłowe położenie igły i zebrać obrazy.</li>
	<li>Załaduj zawiesinę komórek kostniakomięsaka 143B (od kroku 1.5) do strzykawki o mikroobjętości i zastąp strzykawkę o pojemności 1 ml w kości piszczelowej strzykawką o mikroobjętości 143B (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2D). Powoli wstrzyknij ~ 10 μL (zignoruj istniejący wcześniej roztwór w igle) zawiesiny komórek 143B do kości piszczelowej każdej myszy atymicznej (około 2 x 105 komórek) bez stosowania wysokiego ciśnienia.</li>
	<li>Uciskać miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem przez 20-30 s po wyjęciu strzykawki o małej objętości.</li>
	<li>Umieść każdą mysz z powrotem w czystej klatce i uważnie monitoruj, aż mysz całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia (około 10 minut).</li>
	<li>Monitoruj wzrost guza in vivo za pomocą systemu obrazowania rentgenowskiego. Mierz dłuższą średnicę (a) i krótką średnicę (b) masy raka co tydzień za pomocą suwmiarki do obliczania objętości guza (V): V = 1/2 x a x b2, 
	UWAGA: Znieczul myszy, wystawiając je na działanie 2% izofluranu i 98% tlenu. Myszy znieczulono do obrazowania rentgenowskiego. Wstrzyknięcie do kości piszczelowej lucyferazy lub komórek kostniakomięsaka znakowanych białkiem fluorescencyjnym umożliwia śledzenie pierwotnych i przerzutowych zmian kostniakomięsaka. 
	UWAGA: Humanitarne punkty końcowe myszy z kostniakomięsakiem spowodowanym wzrostem guza kolana i przerzutami do płuc opierały się na następujących kryteriach: (1) ocena kondycji ciała, (2) próg utraty masy ciała wynoszący 20%, (3) średnia maksymalna średnica guzów wynosząca 2 cm lub (4) poważnie ograniczone zachowanie zwierząt.</li>
</ol>
3. Badanie patologiczne (pobieranie próbki pierwotnego i płucnego kostniakomięsaka z przerzutami do analizy)
<ol>
	<li>Sześć tygodni po wstrzyknięciu komórek kostniakomięsaka należy poświęcić myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po wystawieniu ich na wdychanie CO2 .</li>
	<li>Trzymaj mysz w pozycji leżącej na plecach i rozciągnij obie tylne kończyny.</li>
	<li>Oddziel całe nogi z kostniakomięsakiem od okolicy pachwinowej. 
	UWAGA: Upewnij się, że wszystkie nogi są oddzielone od tego samego miejsca anatomicznego.</li>
	<li>Przygotuj próbkę histologiczną nóg z kostniakomięsakiem, usuwając skórę, mięśnie i stopy, a następnie utrwal próbkę każdej myszy w probówce o pojemności 50 ml z 20 ml roztworu formaliny (10%) przez 24 godziny, a następnie odwapniaj w 10% roztworze EDTA przez 14 dni z okazjonalną zmianą buforu.</li>
	<li>Zanurz próbkę w parafinie i przygotuj skrawki do badania histologicznego zgodnie z wcześniej opublikowanymi pracami25.</li>
	<li>Delikatnie oddziel płuca i umieść je w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml roztworu formaliny (10%). Po 24 godzinach przenieś płuca każdej myszy do probówki o pojemności 15 ml z 70% etanolem. Osadź płuca w parafinie w celu barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz testu immunohistochemicznego25.</li>
</ol>

<ol><li>Bielack, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+in+high-grade+osteosarcoma+of+the+extremities+or+trunk%3A+an+analysis+of+1%2C702+patients+treated+on+neoadjuvant+cooperative+osteosarcoma+study+group+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).</li>
<li>Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+incidence+and+survival+rates+from+1973+to+2004%3A+data+from+the+Surveillance%2C+Epidemiology%2C+and+End+Results+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.</a> Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+safety+comparison+of+first-line+chemotherapeutic+agents+%28high-dose+methotrexate%2C+doxorubicin%2C+cisplatin%2C+and+ifosfamide%29+for+osteosarcoma%3A+a+network+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).</li>
<li>Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+considerations+for+osteosarcoma+metastatic+at+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation.</a> Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).</li>
<li>Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+adolescents+and+adults%3A+survival+analysis+with+and+without+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases.</a> Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).</li>
<li>Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+mouse+models+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Commonly used mouse models of osteosarcoma.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+the+post+genome+era%3A+Preclinical+models+and+approaches+to+identify+tractable+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+immunology+and+immunotherapy+of+canine+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).</li>
<li>Cobb, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+osteosarcoma+in+the+rat+as+a+model+for+osteosarcoma+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man.</a> British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+osteosarcoma%2C+dependent+on+p53+loss+and+potentiated+by+loss+of+Rb%2C+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease.</a> Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).</li>
<li>Entz-Werlé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+apc%3Btwist+double-mutant+mice%3A+a+new+model+of+spontaneous+osteosarcoma+that+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease.</a> Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+for+osteosarcoma+in+the+mouse%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).</li>
<li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+causes+direct+pulmonary+seeding+of+osteosarcoma+cells+and+is+not+a+spontaneous+model+of+metastasis%3A+A+mouse+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+reproducible+osteosarcoma+rat+model+using+orthotopic+implantation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique.</a> Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected].</a> Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).</li>
<li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing%27s+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).</li>
<li>Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+of+the+proximal+tibia+in+a+dog+6+years+after+tibial+tuberosity+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement.</a> The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).</li>
<li>Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for human osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantharidin+inhibits+osteosarcoma+proliferation+and+metastasis+by+directly+targeting+miR-214-3p%2FDKK3+axis+to+inactivate+%CE%B2-catenin+nuclear+translocation+and+LEF1+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyllin+I+suppresses+human+osteosarcoma+growth+by+inactivation+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primary+bone+tumors+and+bone+metastasis+with+solid+tumor+graft+implantation+into+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ortotopowe wstrzykiwanie komórek kostniakomięsaka jest idealnym modelem do badania funkcji i mechanizmu określonych czynników w kancerogenezie i rozwoju kostniakomięsaka w celu oceny skuteczności terapeutycznej. Aby uniknąć różnic we wzroście guza, większość aktywnych komórek kostniakomięsaka w 80% -90% zlewających się z tą samą liczbą jest ostrożnie wstrzykiwana do kości piszczelowej każdej myszy, a czas trypsynizacji komórek jest ściśle kontrolowany bez wpływu na żywotność komórki. Ponieważ grudki komórek wpływają na l...

Kostniakomięsak jest najczęstszym pierwotnym nowotworem kości u dzieci i młodzieży1,2, który głównie nacieka otaczające tkanki, a nawet daje przerzuty do płuc, gdy pacjenci są zdiagnozowani. Przerzuty do płuc są głównym wyzwaniem w leczeniu kostniakomięsaka, a pięcioletni wskaźnik przeżycia pacjentów z kostniakomięsakiem z przerzutami do płuc pozostaje na poziomie 20%-30%3,4,5. Jednak pięcioletni wskaźnik przeżycia pierwotnego kostniakomięsaka wzrósł do około 70% od 1970 roku z powodu wprowadzenia chemioterapii6. Dlatego pilnie potrzebne jest zrozumienie podstawowego mechanizmu karcynogenezy kostniakomięsaka i przerzutów do płuc, aby opracować nowe terapie. Zastosowanie modeli mysich, które najlepiej naśladują postęp kostniakomięsaka u ludzi, ma ogromne znaczenie7.
Modele zwierzęce kostniakomięsaka są generowane przez spontaniczną, indukowaną inżynierię genetyczną, transplantację i inne techniki. Model samoistnego kostniakomięsaka jest rzadko stosowany ze względu na długi czas powstawania guza, niespójny wskaźnik występowania guza, niską zachorowalność i słabą stabilność8,9. Chociaż model indukowanego kostniakomięsaka jest bardziej dostępny do uzyskania niż spontaniczny kostniakomięsak, zastosowanie modelu indukowanego kostniakomięsaka jest ograniczone, ponieważ czynnik indukujący będzie miał wpływ na mikrośrodowisko, patogenezę i patologiczne cechy kostniakomięsaka10. Modele transgeniczne pomagają zrozumieć patogenezę nowotworów, ponieważ mogą lepiej symulować fizjologiczne i patologiczne środowisko człowieka; Jednak transgeniczne modele zwierzęce mają również swoje ograniczenia ze względu na trudność, długoterminową i wysokie koszty modyfikacji transgenicznej. Co więcej, nawet w najszerzej akceptowanych transgenicznych modelach zwierzęcych generowanych przez modyfikację genów p53 i Rb, tylko 13,6% mięsaków wystąpiło w czterech kościach kończyn11,12.
Transplantacja jest jedną z najczęściej stosowanych metod tworzenia modeli raka pierwotnego i odległego w ostatnich latach ze względu na prosty manewr, stabilne tempo powstawania nowotworów i lepszą jednorodność13. Transplantacja obejmuje przeszczep heterotopowy i przeszczep ortotopowy w zależności od miejsca przeszczepu. W heterotopowym przeszczepie kostniakomięsaka komórki kostniakomięsaka są wstrzykiwane poza pierwotne miejsca kostniakomięsaka (kości) zwierząt, zwykle pod skórę, podskórnie14. Chociaż przeszczep heterotopowy jest prosty bez konieczności wykonywania operacji na zwierzętach, miejsca, w które wstrzykiwane są komórki kostniakomięsaka, nie reprezentują rzeczywistego mikrośrodowiska kostniakomięsaka człowieka. Przeszczepienie ortotopowe kostniakomięsaka polega na wstrzyknięciu komórek kostniakomięsaka do kości zwierząt, takich jak tibia15,16. W porównaniu z przeszczepami heterotopowymi, przeszczepy kostniakomięsaka ortotopowego charakteryzują się krótkim okresem inkubacji, szybkim wzrostem i silnym charakterem erozyjnym; Dlatego są idealnymi modelami zwierzęcymi do badań związanych z kostniakomięsakiem<klasa SUP="xref">17.
Najczęściej używanymi zwierzętami są myszy, psy i danio pręgowany18,19. Spontaniczny model kostniakomięsaka jest zwykle stosowany u psów, ponieważ kostniakomięsak jest jednym z najczęstszych nowotworów u psów. Jednak zastosowanie tego modelu jest ograniczone ze względu na długi czas powstawania guza, niski wskaźnik nowotworzenia, słabą jednorodność i stabilność. Danio pręgowany jest często wykorzystywany do konstruowania transgenicznych lub nokautujących modeli nowotworów ze względu na ich szybką reprodukcję20. Ale geny danio pręgowanego różnią się od genów ludzkich, więc ich zastosowania są ograniczone.
Ta praca opisuje szczegółowe procedury, środki ostrożności i reprezentatywne obrazy do wytwarzania pierwotnego kostniakomięsaka w kości piszczelowej z przerzutami do płuc poprzez wstrzyknięcie do piszczeli komórek kostniakomięsaka u myszy z atymią. Metodę tę zastosowano do stworzenia pierwotnego kostniakomięsaka w kości piszczelowej myszy w celu oceny skuteczności terapeutycznej, która wykazała wysoką odtwarzalność21,22.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Liczenie komórek</td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>Sprzęt myszy anestezjologicznych</td></tr><tr><td>Myszy atymiczne BALB / c</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>zwierzę Matryca błony podstawnej</td><td>Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>356234, BD, Matrigel</td><td>system</td></tr><tr><td>obrazowania bioluminescencyjnego</td> komórek <td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>śledzący wzrost guza i przerzuty do płuc, jeśli komórka iniekcyjna jest znakowana lucyferazy</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (15 ml)</td> <td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning</td><td>Wirówka do komórek</td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Myszy anestezjologiczne</td></tr><tr><td>Pożywka MEM</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Pożywka do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Strzykawka o mikroobjętości</td><td>Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd</td><td>0-50 &mu; L</td><td>Wstrzyknij precyzyjne komórki do kości piszczelowej</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>myje ludzkie komórki kostniakomięsaka</td></tr><tr><td>1 ml strzykawki</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>wiercenie</td></tr><tr><td>linii komórkowej 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>linia komórkowa kostniakomięsaka</td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>leczenie komórek trypsyną</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST798</td><td>Barwienie komórek w celu oceny</td></tr><tr><td>wektora aktywności (pLV-lucyferazy)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>Odczynnik do transfekcji plazmidu</td></tr><tr><td>Obrazowanie rentgenowskie System</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>Obrazy rentgenowskie uzyskano w celu wykrycia wzrostu guza</td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Kostniakomięsak jest najczęstszym pierwotnym nowotworem kości u dzieci i młodzieży, a najczęstszym miejscem przerzutów są płuca. Pięcioletnie przeżycie pacjentów z kostniakomięsakiem z przerzutami do płuc wynosi mniej niż 30%. Dlatego wykorzystanie modeli mysich naśladujących rozwój kostniakomięsaka u ludzi ma ogromne znaczenie dla zrozumienia podstawowego mechanizmu karcynogenezy kostniakomięsaka i przerzutów do płuc w celu opracowania nowych metod leczenia. W tym miejscu opisano szczegółowe procedury generowania pierwotnych modeli kostniakomięsaka i przerzutów do płuc poprzez wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka do kości piszczelowej. W połączeniu z bioluminescencyjnym lub rentgenowskim systemem obrazowania na żywo, te żywe modele myszy są wykorzystywane do monitorowania i ilościowego określania wzrostu kostniakomięsaka i przerzutów. Aby ustalić ten model, macierz błony podstawnej zawierająca komórki kostniakomięsaka została załadowana do strzykawki o mikroobjętości i wstrzyknięta do jednej kości piszczelowej każdej myszy atymicznej po znieczuleniu. Myszy zostały uśmiercone, gdy pierwotny kostniakomięsak osiągnął ograniczenie wielkości w protokole zatwierdzonym przez IACUC. Oddzielono nogi z kostniakomięsakiem i płuca ze zmianami przerzutowymi. Modele te charakteryzują się krótkim okresem inkubacji, szybkim wzrostem, ciężkimi zmianami chorobowymi oraz czułością w monitorowaniu rozwoju pierwotnych i płucnych zmian przerzutowych. Dlatego są to idealne modele do badania funkcji i mechanizmów określonych czynników w kancerogenezie kostniakomięsaka i przerzutach do płuc, mikrośrodowisku guza oraz oceny skuteczności terapeutycznej in vivo.

Powodzenie w tworzeniu ortotopowych (pierwotnych) modeli kostniakomięsaka oraz modeli przerzutów do płuc zależy od precyzyjnego ortotopowego wstrzyknięcia komórek kostniakomięsaka. W niniejszej pracy pomyślnie opracowano ortotopowy (pierwotny) model kostniakomięsaka poprzez dokostne wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka do kości piszczelowej. Rycina 3A przedstawia reprezentatywną mysz z ortotopowym (pierwotnym) kostniakomięsakiem, a Rycina 3B przedstaw...

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Protokół ten opisuje technikę generowania modeli mysich z pierwotnym kostniakomięsakiem i zmianami przerzutów do płuc. Poprzez dopiszczelowe wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka, model ten najlepiej naśladuje charakterystykę rozwoju klinicznego kostniakomięsaka nowotworowego. Dokładna liczba komórek kostniakomięsaka jest bezpośrednio wstrzykiwana do kości piszczelowej za pomocą strzykawki o mikroobjętości, co pozwala na identyczne tempo powstawania guza i objętość guza.W dniu wstrzyknięcia komórek kostniakomięsaka należy dwukrotnie przemyć komórki PBS. Trypsynizuj komórki 1,5 mililitra 0,25% trypsyny przez trzy minuty. Następnie dodaj sześć mililitrów 10% pożywki MEM zawierającej surowicę.Zbierz komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odessać 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do komory płytki do liczenia komórek i obliczyć stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować komórki w temperaturze 800 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odessać supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić osad komórek w matrycy z membraną podstawną o stężeniu 8,5 miligrama na mililitr i umieścić je na lodzie. Umieść mysz w pozycji leżącej. Przytrzymaj kostkę myszy za pomocą kciuka i palca wskazującego i zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia kości piszczelowej wacikiem o stężeniu 70% etanolu.Obróć staw skokowy każdej myszy na zewnątrz, aby przesunąć kość piszczelową i strzałkową, a następnie zegnij staw kolanowy do odpowiedniej pozycji, aż bliższe płaskowyż kości piszczelowej będzie widoczny przez skórę. Przymocować igłę do jednomililitrowej strzykawki i skierować końcówkę igły w stronę miejsca wstrzyknięcia, równolegle do osi kości piszczelowej. Przezskórnie wprowadzić igłę, aby wywiercić otwór przez platformę piszczelową w kierunku dystalnego końca kości piszczelowej.Załaduj zawiesinę komórek kostniakomięsaka umieszczoną wcześniej na lodzie do strzykawki o mikroobjętości i zastąp jednomililitrową strzykawkę w kości piszczelowej strzykawką mikroobjętościową z komórkami kostniakomięsaka. Powoli wstrzyknij około 10 mikrolitrów zawiesiny komórek kostniakomięsaka do kości piszczelowej każdej myszy atymicznej bez wywierania dużego nacisku. Następnie wyjąć strzykawkę z mikroobjętością z miejsca wstrzyknięcia i dociskać to miejsce wacikiem przez około 30 sekund.Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i obserwuj jej regenerację przez 10 minut. Ten rysunek przedstawia model myszy z kostniakomięsakiem ortotopowym powstałym z wstrzyknięcia komórek kostniakomięsaka piszczelowego i jego izolowanej postaci. Z każdym tygodniem obserwuje się stopniowy wzrost objętości guza.Obrazy rentgenowskie uzyskane od pierwszego do szóstego tygodnia po wstrzyknięciu komórek kostniakomięsaka znakowanego lucyferazą wykazały stopniowy wzrost objętości. Ponadto obraz uzyskany po wstrzyknięciu do kości piszczelowej myszy wykazał wzrost kostniakomięsaka ortotopowego in vivo. Przerzuty do płuc spowodowane wstrzyknięciem dopiszczelowym komórek kostniakomięsaka udało się śledzić in vivo za pomocą bioluminescencyjnego systemu obrazowania na żywo.Obserwacja pod mikroskopem stereoskopowym ujawniła przerzutowe kolonie w izolowanych tkankach płucnych. Barwienie HE na tkankach płucnych zatopionych w parafinie wykazało zmiany przerzutowe. Igłę należy przezskórnie wprowadzić do torebki stawowej przez więzadło rzepki, aby wywiercić otwór w platformie piszczelowej w kierunku kości piszczelowej poprzez obracanie strzykawki.

intratibial-osteosarcoma-cell-injection-to-generate-orthotopic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Ten manuskrypt zawiera szczegółową procedurę wstrzykiwania do tętnicy biodrowej (IIA), techniki dostarczania komórek rakowych specyficznie do tkanek kończyn tylnych, w tym kości, w celu ustalenia eksperymentalnych przerzutów do kości. Chociaż początkowo ustalono go na podstawie modeli guzów piersi, protokół ten można łatwo rozszerzyć na inne typy raka.

Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Tutaj prezentujemy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z fibroblastów pochodzących od pacjentów z zespołem Li-Fraumeni (LFS), różnicowania iPSC poprzez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) do osteoblastów oraz modelowania nowotworzenia in vivo przy użyciu osteoblastów pochodzących od pacjentów z LFS.

Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Tutaj opisana jest syngeniczna implantacja ortotopowa, po której następuje procedura amputacji kostniakomięsaka ze spontanicznymi przerzutami do płuc, która może być wykorzystana do badań przedklinicznych biologii przerzutów i rozwoju nowych terapii.

Syngeneiczny ortotopowy kostniakomięsak Sprague Dawley Rat Model z amputacją w celu kontrolowania częstości przerzutów

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Poznaj technikę wstrzyknięcia wewnątrzkostnego komórek kostniakomięsaka w celu wygenerowania ortotopowego guza pierwotnego i przerzutów płucnych u myszy. Ta metoda wiernie odzwierciedla kliniczny rozwój nowotworu.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc (Wideo) | JoVE Journal

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Przeglądaj więcej filmów