Name: In vivo (in vivo) Bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj bezprzewodową optogenetykę do badania wykwalifikowanych zachowań motorycznych u myszy. Ta metoda łączy manipulację neuronami z analizą kinematyczną ruchów, pomagając zrozumieć mechanizmy kontroli ruchowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekt UNAM-PAPIIT IA203520. Dziękujemy zwierzętom IFC za pomoc w utrzymaniu kolonii myszy oraz jednostce obliczeniowej za wsparcie IT, szczególnie Francisco Perez-Eugenio.

Procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi i krajowymi wytycznymi oraz zatwierdzone przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Instytut Fizjologii Komórkowej Protokół IACUC VLH151-19). W obecnym protokole zastosowano transgeniczne samce myszy Drd1-Cre27, 35-40 dni po urodzeniu z tłem C57BL/6. Myszy trzymano w następujących warunkach: temperatura 22±1 °C; wilgotność 55%; Harmonogram światła 12/12 h z wyłączonymi światłami o 19:00 i zostały odstawione od piersi w 21 dniu po porodzie. Odsadzone od piersi szczenięta trzymano w grupach tej samej płci liczących od 2 do 5 osób. Zwierzęta były trzymane w statycznych pomieszczeniach z wierzchołkami z mikrobarierami. Ściółka składała się ze sterylnych wiórów osikowych. Granulki gryzoni i woda oczyszczona RO były dostarczane ad libitum, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Zabiegi chirurgiczne
<ol>
	<li>Przygotuj kaniulę LED o żądanej długości zgodnie ze współrzędnymi grzbietowo-brzusznymi interesującej nas struktury (najlepiej o 0,5 mm dłuższa, aby uwzględnić grubość czaszki, dla prążkowia grzbietowo-bocznego 3,5 mm) (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).
	<ol>
		<li>Przytnij włókno szklane na długość dłuższą niż ostateczny pożądany rozmiar, zmiel końcówkę włókna na docelową długość szorstkim papierem ściernym, a na koniec wypoleruj końcówkę z włókna drobnym papierem ściernym. 
		UWAGA: Kaniula LED to szklane włókno światłowodowe o średnicy 250 μm podłączone do odbiornika podczerwieni (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciągnąć szklane pipety (średnica zewnętrzna 1.14 mm, średnica wewnętrzna 0.53 mm i długość 3.5 mm) do nanowtryskiwacza za pomocą poziomego ściągacza (patrz tabela materiałów) i przechowywać je na później. Zaprogramuj ściągacz w jednej pętli, aby uzyskać średnicę końcówki 15-20 μm z długim stopniowym nachyleniem (4-5 mm).</li>
	<li>Przygotować obszar operacji, dokładnie dezynfekując aparat stereotaktyczny, kaptur, mikrowstrzykiwacz (patrz Tabela Materiałów) i otaczające powierzchnie 70% etanolem. 
	UWAGA: Aparat stereotaktyczny myszy jest niezbędny do precyzyjnego wstrzyknięcia wirusa związanego z adeno (AAV) i umieszczenia kaniuli LED w obszarze zainteresowania.</li>
	<li>Podczas zabiegu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym czysty fartuch laboratoryjny lub jednorazowy fartuch chirurgiczny, sterylne rękawiczki, maskę na twarz i jednorazową nasadkę na głowę.</li>
	<li>Umieść niezbędny sprzęt w pobliżu obszaru operacyjnego, taki jak sterylne narzędzia chirurgiczne, bawełniane końcówki, roztwory, mikropipety, końcówki do pipet, naczynia włosowate, mikrowypełnienie olejem mineralnym i marker.</li>
	<li>Napełnij pipetę do mikroiniekcji olejem mineralnym i umieść ją w mikrowstrzykiwaczu. Upewnij się, że mikrowtryskiwacz działa prawidłowo, wyrzucając trochę oleju mineralnego. 
	UWAGA: Wszystkie narzędzia używane podczas zabiegu powinny być sterylizowane w autoklawie i sterylne. Należy stosować technikę aseptyczną.</li>
	<li>Znieczulać zwierzęta gazowym izofluranem 4-5% w celu wywołania znieczulenia i 1,2% przez cały czas trwania operacji czystym tlenem o stężeniu 0,5-1 l/min. Operacja rozpoczyna się dopiero po osiągnięciu przez zwierzę punktu głębokiego znieczulenia, ocenianego na podstawie braku wycofania łapy po lekkim uszczypnięciu.
	<ol>
		<li>Stale monitoruj częstość oddechów i temperaturę zwierzęcia. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej ustawionej na 34 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj maść okulistyczną. Usuń włosy ze skóry głowy za pomocą trymera i kremu do depilacji. Przetrzyj skórę głowy bawełnianymi wacikami zawierającymi 8% jodu powidonu (patrz Tabela materiałów) i 70% etanolu na przemian trzy razy.</li>
	<li>Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym i zabezpiecz głowę, upewniając się, że czaszka jest wypoziomowana w osi przyśrodkowej i przednio-tylnej.</li>
	<li>Wykonaj 1 cm nacięcie skalpelem przez skórę głowy na wysokości oczu wzdłuż osi strzałkowej. Cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę i oczyść okostną bawełnianymi wacikami.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię czaszki roztworem soli fizjologicznej i sterylnymi wacikami. Usunąć krwawienie z powierzchni za pomocą sterylnych chłonnych włóczni do oczu (patrz Tabela materiałów) lub podobnego sterylnego materiału chłonnego.</li>
	<li>Nałóż kroplę 2,5% nadtlenku wodoru za pomocą bawełnianego wacika i pozwól mu działać przez kilka sekund, aby szwy czaszki były widoczne i miały lepsze odniesienie. Po kilku sekundach dokładnie wyczyść czystym bawełnianym wacikiem.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety (końcowa średnica końcówki 15 μm) zlokalizuj bregma i lambda, aby sprawdzić, czy czaszka jest wypoziomowana w osi przednio-tylnej. 
	UWAGA: Zaleca się posiadanie mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu USB, aby zobaczyć końcówkę szklanej pipety. W razie potrzeby dostosuj wysokość uchwytu na usta, aby wypoziomować czaszkę.</li>
	<li>Przesuń kapilarnę w kierunku wybranych współrzędnych przednio-tylnych (AP) i przyśrodkowo-bocznych (ML) (prążkowie grzbietowo-boczne AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Pomaluj punkt odniesienia w skórze głowy powyżej wybranych współrzędnych sterylnym markerem.</li>
	<li>W punkcie odniesienia wykonaj kraniotomię o średnicy ~1 mm, delikatnie uciskając czaszkę sterylnym narzędziem obrotowym lub wiertłem dentystycznym z małą lub średnią prędkością za pomocą małego okrągłego wiertła dentystycznego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Załaduj kapilarnę 300-400 nL wirusa związanego z adenowirusem zależnym od Cre (AAV), takiego jak AAV1-dflox-hChR-2-mCherry, aby uzyskać ekspresję rodopsyny kanałowej lub AAV, aby wyrazić tylko białko reporterowe (np. mCherry) jako kontrolę w regionie zainteresowania (patrz tabela materiałów). Sprawdź, czy końcówka nie jest zatkana, a następnie wprowadź szklaną pipetę do mózgu w żądanych współrzędnych grzbietowo-brzusznych (DV) (prążkowie grzbietowo-boczne DV -3,35 mm).
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 200 nL za pomocą automatycznego wstrzykiwacza z szybkością 23 nL/s. Po zakończeniu wstrzyknięcia odczekać 10 minut, powoli wyjąć szklaną pipetę, aby uniknąć rozlania. 
		UWAGA: Możliwe jest użycie igły 30 G do wstrzykiwania za pomocą odpowiedniego mikrowstrzykiwacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść i osusz wszelkie pozostałości bawełnianymi wacikami.</li>
	<li>Przymocuj sterylną szklaną kaniulę LED do ramienia stereotaktycznego i skalibruj współrzędne, używając bregmy jako odniesienia. Wkładać kaniulę bardzo powoli (300 μm/min), aby uniknąć uszkodzenia tkanki i umieścić ją 100 μm powyżej miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Po umieszczeniu kaniuli LED na miejscu dodaj kroplę (100 μl) kleju tkankowego na krawędzi kraniotomii.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę cementu dentystycznego (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, aby przymocować włókno do czaszki. 
	UWAGA: Krótko mówiąc, użyj schłodzonego naczynia porcelanowego, aby mieć więcej czasu na pracę, zanim cement stwardnieje. Dodaj 2 miarki przezroczystego proszku żywicznego do porcelanowego naczynia, dodaj 4 krople szybkiej bazy i 1 kroplę katalizatora, a następnie dobrze wymieszaj. Stosunek proszku do cieczy można dostosować, jeśli potrzebna jest cieńsza lub gęstsza lepkość.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej szczoteczki stopniowo nakładaj mieszankę cementu dentystycznego wokół łącznika kaniuli, budując warstwy, aż czaszka zostanie pokryta, a łącznik zostanie bezpiecznie przymocowany do czaszki, pozostawiając szpilki całkowicie wolne. Unikaj kontaktu cementu dentystycznego ze skórą myszy.</li>
	<li>Pozostawić do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Zamknij skórę wokół implantu za pomocą kleju tkankowego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść mysz w klatce regeneracyjnej nad poduszką grzewczą w temperaturze 33°C. Monitoruj obecność jednego lub więcej z następujących objawów bólu/dyskomfortu: 1) Garbienie się, brak lub zmniejszenie aktywności ruchowej, 2) Brak pielęgnacji odzwierciedlony w nieutrzymanej, brudnej sierści, 3) Nadmierne lizanie lub drapanie, zaczerwienienie w miejscu nacięcia, 4) agresywne zachowanie, 5) anoreksja lub odwodnienie oraz 6) brak tworzenia gniazd. 
	UWAGA: Podczas wszystkich zabiegów mysz należy trzymać indywidualnie w klatce, aby uniknąć odłączenia implantu. W przypadku odłączenia kaniuli należy przeprowadzić eutanazję poprzez wstrzyknięcie 150 mg/kg pentobarbitalu sodu, a następnie ścięcie głowy po osiągnięciu głębokiego znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzykiwać podskórnie (SC) meloksykam w dawce 1 mg/kg mc. raz na dobę przez trzy dni po operacji w celu znieczulenia.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 7 dni na całkowite wyzdrowienie i 14 dni na ekspresję opsyny przed dalszymi zabiegami. 
	UWAGA: Wykonuj obserwację pooperacyjną co 12 godzin przez trzy dni, a następnie sprawdzaj zwierzęta codziennie, aż do dnia eutanazji pod koniec eksperymentu.</li>
</ol>

2. Trening od sięgania do ręki
<ol>
	<li>W 7 dniu po operacji rozpocznij protokół deprywacji żywności28. Waż myszy przez trzy kolejne dni, aby określić ich średnią masę ciała ad libitum. Następnie zaplanuj ograniczenia żywieniowe tak, aby zwierzęta otrzymywały wystarczającą ilość składników odżywczych, aby utrzymać około 90% i nie mniej niż 85% masy ciała. 
	UWAGA: Osiąga się to poprzez dostarczanie 2,5-3 g pokarmu dziennie. Codziennie monitoruj wagę zwierząt i oceniaj ogólne samopoczucie, obserwując zachowanie i wygląd zwierząt, na przykład wygląd sierści i oczu. Użyj systemu oceny kondycji ciała z Reference29.</li>
	<li>W okresach przedtreningowych, treningowych i testowych podawaj każdej myszy 20 granulek (20 mg bezpyłowych granulek o smaku czekoladowym) dziennie (patrz Tabela materiałów) (spożywanych podczas zadania lub po nim) oprócz standardowych granulek pokarmowych.</li>
	<li>Trzy dni przed przyzwyczajeniem rozsyp 0,4 g/zwierzę/dzień 20 mg bezpyłowych granulek o smaku czekoladowym w ich domowych klatkach, aby myszy zapoznały się z granulkami, które służą jako nagroda podczas zadania sięgania po sięganie.</li>
	<li>Przyzwyczaj myszy, umieszczając je na 10 minut w komorze testowej na dzień przed treningiem wstępnym z granulkami rozrzuconymi na podłodze komory (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Zezwalaj na jedzenie codziennie po treningu i testach. Utrzymuj podobny harmonogram każdego dnia.</li>
	<li>Pierwszego dnia treningu wstępnego umieść myszy w komorze sięgającej do chwytania i obserwuj od przodu. Umieść pelety przed komorą blisko otworu, aby zaczęły pochłaniać pelety. Na tym etapie myszy mogą chwytać granulki w dowolnej formie.</li>
	<li>W drugim dniu treningu wstępnego umieszczaj granulki coraz dalej od otworu, aż dojdą do wgłębienia (1 cm od otworu), aby myszy mogły kształtować swój ruch sięgania do chwytania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Trenuj myszy, aby biegły na tył klatki i wracały do otworu klatki, aby otrzymać następny granulat pokarmu jako strategię indywidualizacji prób. 
	UWAGA: Można to osiągnąć, czekając, aż mysz znajdzie się z tyłu klatki przed umieszczeniem granulki we wgłębieniu przy każdej próbie.</li>
	<li>Umieść granulki tak, aby chwytały je prawą lub lewą łapą. 
	UWAGA: Myszy zaczynają używać preferencyjnie jednej łapy do chwytania, która będzie używana w kolejnych dniach treningu i testów.</li>
	<li>Trenuj zwierzęta przez 6 dni w codziennych sesjach trwających 20 prób lub do upływu maksymalnie 10 minut. Od 2 dnia treningu umieść atrapę odbiornika (wymiary 12 x 18 x 7 mm, 1 g, patrz Tabela Materiałów), aby myszy przyzwyczaiły się do wagi podczas wykonywania zadania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Każdego dnia oceniaj liczbę trafionych i nietrafionych prób.</li>
	<li>Nagrywaj zachowanie zwykłą kamerą i rejestruj 30-60 klatek/s z przodu komory. Dodatkowo można umieścić lustro pod komorą treningową pod kątem 45°, aby monitorować postawę zwierząt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D,E).</li>
	<li>W przypadku analizy kinematycznej post-hoc (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) zamontuj szybką kamerę (patrz Tabela materiałów) pod kątem 45°, aby nagrywać z boku klatki. Jeśli wymagana jest analiza 3D, umieść drugą szybką kamerę, aby nagrywać pod kątem 35° od przodu komory; obie kamery powinny być umieszczone po prawej lub lewej stronie klatki, w zależności od postawy zwierzęcia i powinny rejestrować z tą samą liczbą klatek na sekundę i być zsynchronizowane7 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D,E).</li>
	<li>Ustaw szybkie kamery na 100 klatek/s z rozdzielczością 376 x 252 pikseli lub większą, jeśli to możliwe. Umieść białe ścianki styropianowe po bokach i z tyłu komory, aby zmniejszyć tło i zwiększyć kontrast (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>W dniu testu wymień próbną jednostkę na odbiornik podczerwieni do bezprzewodowej stymulacji optogenetycznej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C).</li>
	<li>Gdy myszy zaczną sięgać, obróć kaniulę LED ręcznie za pomocą pilota zdalnego sterowania, aby uzyskać ciągłą stymulację przez czas wykonywania zachowania i nie dłużej niż 2 s. Preferowane jest zaprogramowanie paradygmatu automatycznej stymulacji. Urządzenie stymulujące wyzwala diodę LED o długości fali 470 nm (światło niebieskie) o natężeniu na końcówce 1,0 mW/mm2.</li>
	<li>Zbierz filmy do dalszej analizy, w tym punktacji i analizy kinematycznej.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie histologiczne post hoc
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu potwierdź ekspresję wirusa i umieszczenie kaniuli LED. Znieczulić zwierzę koktajlem ketaminy 100 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg. Gdy mysz wykazuje oznaki głębokiego znieczulenia (krok 1.7), przelej ją lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie 4% PFA.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wszczepioną kaniulę, mocno chwytając łącznik kleszkami i delikatnie pociągając do góry.</li>
	<li>Ekstrakcja i post-fix mózg przez 24 godziny w 4% PFA23.</li>
	<li>Wykonuj 3-10 minutowe pranie z PBS.</li>
	<li>Przeciąć mózg na skrawki o grubości 50 μm za pomocą mikrotomu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zamontuj sekcje w szkiełkach za pomocą twardych nośników montażowych z DAPI do barwienia jąder i szkiełek osłonowych.</li>
	<li>Po wyschnięciu obserwuj skrawki pod mikroskopem konfokalnym i sprawdź lokalizację wszczepionej kaniuli oraz ekspresję Ch2R połączonego z dowolnym białkiem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Balbinot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-stroke+kinematic+analysis+in+rats+reveals+similar+reaching+abnormalities+as+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans.</a> Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).</li>
<li>Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+rodent+skilled+reaching+as+a+translational+model+for+investigating+brain+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).</li>
<li>MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+impairments+follow+intrastriatal+hemorrhagic+stroke+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats.</a> Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).</li>
<li>Evenden, J. L., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unilateral+6-hydroxydopamine+lesions+of+the+caudate-putamen+on+skilled+forepaw+use+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat.</a> Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).</li>
<li>Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanual+reach+to+grasp+movements+in+youth+with+and+without+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychology%22%5BJournal%5D)">Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder.</a> Frontiers in Psychology. 9, 2720(2019).</li>
<li>Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reach-to-grasp+movement+in+infants+later+diagnosed+with+autism+spectrum+disorder%3A+a+high-risk+sibling+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurodevelopmental+Disorders%22%5BJournal%5D)">The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41(2018).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Marques, J. M., Olsson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+juvenile+mice+in+a+reach-to-grasp+task%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).</li>
<li>Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+deficits+in+unilateral+dopamine-depleted+rats%3A+Impairments+in+movement+and+posture+and+compensatory+adjustments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments.</a> The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).</li>
<li>Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+coordination+during+reach-to-grasp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Neural coordination during reach-to-grasp.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).</li>
<li>Ian, Q. W., Sergio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+skilled+forelimb+reaching+in+the+rat%3A+A+proximally+driven+movement+with+a+single+distal+rotatory+component%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component.</a> Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).</li>
<li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+senses%3A+their+roles+in+signaling+body+shape%2C+body+position+and+movement%2C+and+muscle+force%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).</li>
<li>Yttri, E. A., Dudman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opponent+and+bidirectional+control+of+movement+velocity+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia.</a> Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).</li>
<li>Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+motor+cortex+is+involved+in+bimanual+coordination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary motor cortex is involved in bimanual coordination.</a> Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).</li>
<li>Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+bilateral+motor+representation+depends+on+subcortical+and+interhemispheric+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).</li>
<li>d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+muscle+synergies+in+the+construction+of+a+natural+motor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).</li>
<li>Fattori, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+orientation+during+reach-to-grasp+movements+modulates+neuronal+activity+in+the+medial+posterior+parietal+area+V6A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).</li>
<li>vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+of+the+motor+cortex+ipsilateral+to+the+moving+body+side+depends+on+spatio-temporal+task+complexity+and+hemispheric+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization.</a> PLoS One. 6 (3), 17742(2011).</li>
<li>vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+primary+motor+cortex+in+controlling+movements+executed+with+the+ipsilateral+hand+differs+between+left-+and+right-handers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cognitive+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers.</a> Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).</li>
<li>Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipsilateral+motor+cortex+activity+during+unimanual+hand+movements+relates+to+task+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity.</a> Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).</li>
<li>Lopez-Huerta, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+bilateral+control+of+skilled+forelimb+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Striatal bilateral control of skilled forelimb movement.</a> Cell Reports. 34 (3), 108651(2021).</li>
<li>Lopez-Huerta, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatum%3A+two+entities%2C+one+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The neostriatum: two entities, one structure.</a> Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).</li>
<li>Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+control+of+reach+accuracy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Online control of reach accuracy in mice.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).</li>
<li>Jaidar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+underlies+the+behavior+in+unilateral+dopamine-depleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice.</a> European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cre+recombinase+to+specific+neuron+populations+with+bacterial+artificial+chromosome+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).</li>
<li>Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+or+fluid+restriction+in+common+laboratory+animals%3A+balancing+welfare+considerations+with+scientific+inquiry%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry.</a> Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).</li>
<li>Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+condition+scoring%3A+a+rapid+and+accurate+method+for+assessing+health+status+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice.</a> Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).</li>
<li>Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+motor+skill+learning+by+single-pellet+reaching+tasks+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51238(2014).</li>
<li>Fink, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+inhibition+of+spinal+sensory+feedback+ensures+smooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement.</a> Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+learned+skilled+movement+representation+in+motor+cortex+deep+output+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer.</a> Nature Communication. 8, 15834(2017).</li>
<li>Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+activates+a+handful+of+muscle+synergies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microstimulation activates a handful of muscle synergies.</a> Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Timescale+interrogation+of+neuronal+function+by+fiberless+optogenetics+using+lanthanide+micro-particles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles.</a> Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multilateral+devices+for+optogenetic+studies+of+individual+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors.</a> Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).</li>
<li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiberless+multicolor+neural+optoelectrode+for+in+vivo+circuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis.</a> Scientific Reports. 6, 30961(2016).</li>
<li>Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+designing+interpretable+optogenetic+behavior+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments.</a> Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).</li>
<li>Packer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPacker%2C+AM+%22Nature+Methods%22">Nature Methods</a>. 9, 1202-1205 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak ujawnień.

Zastosowanie manipulacji optogenetycznej populacji neuronów w dobrze zdefiniowanych paradygmatach behawioralnych pogłębia naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw kontroli motorycznej 7,23. Metody bezprzewodowe są szczególnie przydatne w zadaniach, które wymagają testów na wielu zwierzętach lub swobodnego przemieszczaniasię 34,35. Niemniej jednak, w miarę udoskonalania technik i urządzeń, powi...

Zachowanie motoryczne jest obecne podczas większości wykonywanych przez nas ruchów i wiadomo, że wpływa na kilka zaburzeń mózgu1,2,3,4,5,6. Realizacja zadań, które pozwalają badać rozwój, uczenie się i wykonywanie wykwalifikowanych ruchów, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia neurobiologicznych podstaw funkcji motorycznych, zwłaszcza w modelach uszkodzeń mózgu, zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych2,7,8,9,10,11,12,13. Sięganie po przedmioty i aportowanie ich jest rutynowe w codziennych czynnościach życiowych i jest jedną z pierwszych umiejętności motorycznych nabytych we wczesnym okresie rozwoju, a następnie doskonalonych przez lata5,6. Obejmuje złożone zachowanie, które wymaga procesów sensoryczno-motorycznych, takich jak postrzeganie cech obiektu, planowanie ruchu, wybór działań, wykonywanie ruchów, koordynacja ciała i modulacja prędkości7,14,15,16. Tak więc jednoręczne zadania o wysokiej zręczności wymagają udziału wielu struktur mózgowych obu półkul16,17,18,19,20,21,22. U myszy zadanie polegające na sięganiu po pojedyncze granulki jest charakteryzowane dla kilku faz, które mogą być kontrolowane i analizowane oddzielnie7,13,23. Ta funkcja pozwala na badanie udziału określonych subpopulacji neuronalnych na różnych etapach akwizycji i wydajności zachowania oraz stanowi platformę do szczegółowych badań układów motorycznych13,23,24. Ruch następuje w ciągu kilku sekund; W związku z tym do analizy kinematycznej należy stosować filmowanie z dużą prędkością na różnych etapach trajektorii biegłego motoryki<klasa SUP="Xref">7,<klasa SUP="Xref">25. Z filmów można wyodrębnić kilka parametrów, w tym postawę ciała, trajektorię, prędkość i rodzaj błędów25. Analiza kinematyczna może być wykorzystana do wykrycia subtelnych zmian podczas bezprzewodowej manipulacji optogenetycznej7,23.
Użycie zminiaturyzowanych diod elektroluminescencyjnych (LED) do dostarczania światła za pomocą bezprzewodowego systemu montowanego na głowie umożliwia zdalną kontrolę optogenetyczną, podczas gdy zwierzę wykonuje zadanie. Bezprzewodowy kontroler optogenetyczny akceptuje pojedyncze impulsowe lub ciągłe polecenia wyzwalania ze stymulatora i wysyła sygnały podczerwieni (IR) do odbiornika podłączonego do zminiaturyzowanej diody LED23,26. Obecny protokół łączy to bezprzewodowe podejście optogenetyczne z szybką wideografią zadania zręcznościowego w celu przeanalizowania roli określonych populacji neuronów podczas wykonywania zachowań motorycznych23. Ponieważ jest to zadanie jednoręczne, pozwala na ocenę udziału struktur w obu półkulach. Tradycyjnie, mózg kontroluje ruchy ciała w wysoce asymetryczny sposób; Jednak zadania związane z wysoką zręcznością wymagają starannej koordynacji i kontroli ze strony wielu struktur mózgu, w tym jąder ipsilateralnych i zróżnicowanego udziału subpopulacji neuronów w jądrach10,20,21,22,23. Protokół ten pokazuje, że struktury podkorowe z obu półkul kontrolują trajektorię kończyny przedniej23. Ten paradygmat może być odpowiedni do badania innych regionów mózgu i modeli chorób mózgu.

<table><tbody><tr><td>Aparat anestezjologiczny</td><td>RWD</td><td>R583S</td><td>Waporyzator izofluranowy</td></tr><tr><td>Anesket</td><td>PiSA</td><td></td><td>Płytka stykowa ketaminy</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>MB3090/M</td><td>Solidna aluminiowa płytka stykowa optyczna</td></tr><tr><td>Obiektyw aparatu Obiektywy</td><td>Canon</td><td></td><td>50mmf/ 1.4 z manualnym ustawianiem ostrości (c-mount)</td></tr><tr><td>System kamer</td><td>BrainVision</td><td>MiCAM02</td><td>Kontroler kamery i synchronizer</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CS roztwór</td><td>PiSA</td><td></td><td>Roztwór chlorku sodu 9%</td></tr> <tr><td>Dostosowana komora treningowa</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiertło #105</td><td>Dremel</td><td>2 615 010 5AE</td><td>Frez do grawerowania</td></tr><tr><td>Bezpyłowe granulki czekolady</td><td>precyzyjnej Bio-Serv</td><td>F05301</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>J. T.&nbsp; Baker</td><td>9000-02</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Eyespears</td><td>Ultracell</td><td>40400-8</td><td>Włóczki do oczu z chłonnego materiału PVA</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VetOne</td><td>V1 502017-250</td><td>Izofluran</td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Drumond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Pipety do NanoJect II</td></tr><tr><td>Hidrogen nadtlenek</td><td>Farmacom</td><td></td><td>Antyseptyczna</td></tr><tr><td>kamera szybkoobrotowa</td><td>BrainVision</td><td>MiCAM02-CMOS</td><td>Monochromatyczne kamery szybkoobrotowe</td></tr><tr><td>Emiter podczerwieni</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaniula LED</td><td>Teleopto</td><td>TelC-c-l-d</td><td>Kaniula LED 250um 487nm light</td></tr><tr><td>Mikropipeta 10 uL</td><td>Eppendorf</td><td>Z740436</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter</td><td>P-87</td><td>Ściągacz poziomy</td></tr><tr><td>Mikroskop LSM780</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atrapa odbiornika</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoJect II</td><td>Drumond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Mikro wtryskiwacz</td></tr><tr><td>Zbiornik tlenu</td><td>Infra</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA</td><td>Addgene</td><td>20297</td><td>Wektor wirusowy do ekspresji ChR-2</td></tr><tr><td>Parafilm Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Bufor soli fosforanowej</td><td>Sigma</td><td>P-4417</td><td>Bufor fosforanowy w postaci soli fizjologicznej w tabletkach</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 10 μL</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12635</td><td>0,5-10 μl objętości</td></tr><tr><td>Pisabental</td><td>PiSA</td><td></td><td>Pentobarbital sodu</td></tr><tr><td>pleksi</td><td>komercyjny</td><td></td><td>arkusz akrylowy</td></tr><tr><td>Povidone jod</td><td>Farmacom</td><td></td><td>Antyseptyczny</td></tr><tr><td>Procin</td><td>PiSA</td><td></td><td>Xylacine</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Perrigo pharma</td><td>1228112</td><td>Smar do oczu 15% olej mineralny/85% wazelina</td></tr><tr><td>Narzędzie obrotowe</td><td>Kmoon</td><td>Mini młynek</td><td>Standard</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze</td><td></td><td></td><td></td>skalpela</tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>Aparat cyfrowy</td></tr><tr><td>Super-Bond C& B</td><td>Sun Medical</td><td></td><td>Cement dentystyczny</td></tr><tr><td>Chirurgiczna jednorazowa nasadka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilot zdalnego sterowania Teleopto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg Drd1-Cre linia myszy</td><td>Gensat</td><td>036916-UCD</td><td>Wprowadzanie transgenu FK150Gsat</td></tr><tr><td>Klej tkankowy</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>TPI Vibratome 1000 plus</td><td>Peico</td><td></td><td>Nośniki</td></tr><tr><td>montażowe Microtome Vectashield z DAPI</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H-1200</td><td>Nośniki montażowe</td></tr><tr><td>Odbiornik bezprzewodowy</td><td>Teleopto</td><td>TELER-1-P</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

Umiejętności motoryczne są niezbędne w codziennym życiu i mogą być zagrożone w wielu zaburzeniach układu nerwowego. Przyswojenie i wykonanie tych zadań wymaga integracji czuciowo-motorycznej i obejmuje precyzyjną kontrolę obustronnych obwodów mózgowych. Wdrożenie jednoręcznych paradygmatów behawioralnych w modelach zwierzęcych poprawi zrozumienie wkładu struktur mózgu, takich jak prążkowie, w złożone zachowania motoryczne, ponieważ umożliwia manipulację i rejestrację aktywności neuronalnej określonych jąder w warunkach kontrolnych i choroby podczas wykonywania zadania. 
Od momentu powstania, optogenetyka jest dominującym narzędziem do badania mózgu, umożliwiając selektywną i ukierunkowaną aktywację lub hamowanie populacji neuronów. Połączenie optogenetyki z testami behawioralnymi rzuca światło na mechanizmy leżące u podstaw określonych funkcji mózgu. Bezprzewodowe systemy montowane na głowie ze zminiaturyzowanymi diodami elektroluminescencyjnymi (LED) umożliwiają zdalną kontrolę optogenetyczną u całkowicie swobodnie poruszającego się zwierzęcia. Pozwala to uniknąć ograniczeń wynikających z tego, że system przewodowy jest mniej restrykcyjny dla zachowania zwierząt bez uszczerbku dla wydajności emisji światła. Obecny protokół łączy bezprzewodowe podejście optogenetyczne z szybką wideografią w jednoręcznym zadaniu zręcznościowym, które ma na celu przeanalizowanie udziału określonych populacji neuronów w zachowaniu motorycznym.

Zadanie sięgania po obiekt (reach-to-grasp) to paradygmat powszechnie stosowany do badania kształtowania, uczenia się, wydajności oraz kinematyki precyzyjnych ruchów umiejętnościowych przy różnych manipulacjach eksperymentalnych. Myszy uczą się wykonywać to zadanie w ciągu kilku dni i osiągają dokładność powyżej 55%, osiągając plateau po 5 dniach treningu (Rysunek 2A,B). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, pewna część zwierząt nie wykonuje zadania w sposób prawidłowy (29...

Obecny protokół opisuje, jak korzystać z bezprzewodowej optogenetyki w połączeniu z szybką wideografią w jednym zadaniu typu "sięgnij do uchwytu" w celu scharakteryzowania obwodów neuronowych zaangażowanych w realizację umiejętnego zachowania motorycznego u swobodnie poruszających się myszy.

In vivo (in vivo) Bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...

Obecny protokół przyczynia się do badania mechanizmów mózgowych leżących u podstaw umiejętnego zachowania motorycznego. Optogenetyka bezprzewodowa pozwala na manipulowanie określonymi neuronami, podczas gdy badani wykonują zadanie w swobodnym ruchu. W połączeniu z szybką wideografią możliwa jest szczegółowa analiza zachowań motorycznych.Metoda ta może pomóc w zrozumieniu problemów motorycznych w zaburzeniach neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych. Techniki te mogą być również wykorzystywane do badania funkcji mózgu w innych paradygmatach behawioralnych. Diana Rodriguez-Munoz, studentka z mojego laboratorium, będzie asystować przy eksperymencie.Do zabiegów chirurgicznych należy rozpocząć od przygotowania kaniuli LED o pożądanej długości zgodnie ze współrzędnymi grzbietowo-brzusznymi interesującej nas struktury. Aby to zrobić, przytnij włókno szklane na długość dłuższą niż ostateczny pożądany rozmiar i zmiel końcówkę włókna na docelową długość szorstkim papierem ściernym. Następnie wypoleruj końcówkę z włókna drobnym papierem ściernym.W przypadku mikroiniekcji należy napełnić pipetę olejem mineralnym i umieścić pipetę w mikrowstrzykiwaczu. Upewnij się, że mikrowtryskiwacz działa prawidłowo, wstrzykując trochę oleju mineralnego. Następnie należy przygotować znieczuloną mysz do zabiegu, nakładając maść okulistyczną i usuwając owłosienie ze skóry głowy za pomocą trymera i kremu do depilacji.Następnie przetrzyj skórę głowy bawełnianymi wacikami zawierającymi 8% jodu powidonu i 70% etanolu na przemian trzy razy. Po odkażeniu umieść mysz w aparacie stereotaktycznym i zabezpiecz głowę, upewniając się, że czaszka jest wypoziomowana w osi przyśrodkowej-bocznej i przednio-tylnej. Za pomocą skalpela wykonaj jednocentymetrowe nacięcie przez skórę głowy na wysokości oczu wzdłuż osi strzałkowej.Następnie cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę i oczyść okostną bawełnianymi wacikami. Oczyść powierzchnię czaszki roztworem soli fizjologicznej i wacikami i rozwiąż krwawienie na powierzchni za pomocą sterylnych chłonnych włóczni do oczu. Następnie nałóż kroplę 2,5% nadtlenku wodoru za pomocą bawełnianego wacika i pozwól mu działać przez kilka sekund, aby szwy czaszki były widoczne i miały lepsze odniesienie.Po kilku sekundach dokładnie wyczyść obszar czystym bawełnianym wacikiem. Za pomocą szklanej pipety o końcowej średnicy końcówki 15 mikronów zlokalizuj bregma i lambda, aby sprawdzić, czy czaszka jest wypoziomowana w osi przednio-tylnej. Następnie pomaluj markerem punkt odniesienia w skórze głowy powyżej wybranych współrzędnych.W punkcie odniesienia wykonaj kraniotomię o średnicy jednego milimetra, delikatnie uciskając czaszkę za pomocą narzędzia obrotowego z niską lub średnią prędkością za pomocą małego, okrągłego wiertła dentystycznego. Po zakończeniu przesuń naczynia włosowate w kierunku wybranych współrzędnych przednio-tylnych lub AP i przyśrodkowo-bocznych lub ML. Załaduj kapilarnę 300 do 400 nanolitrami wirusa związanego z adenowirusem zależnym od CreE lub AAV, takiego jak AAV1, D-flox rodopsyna kanałowa mCherry w celu ekspresji rodopsyny kanałowej w obszarze zainteresowania.AAV może być używany jako kontrola do ekspresji białka reporterowego. Po upewnieniu się, że końcówka nie jest zatkana, wprowadź szklaną pipetę do mózgu na współrzędnych grzbietowo-brzusznych minus 3,35 milimetra w prążkowiu grzbietowo-bocznym i wstrzyknij 200 nanolitrów wirusa za pomocą automatycznego wstrzykiwacza z szybkością 23 nanolitrów na sekundę. Odczekaj 10 minut po wstrzyknięciu, a następnie powoli wyjmij szklaną pipetę, aby uniknąć rozlania.Następnie wyczyść i osusz wszelkie pozostałości wacikami. Następnie przymocuj szklaną kaniulę LED do ramienia stereotaktycznego i skalibruj współrzędne, używając bregmy jako odniesienia. Następnie należy powoli wprowadzić kaniulę, aby uniknąć uszkodzenia tkanki i umieścić ją 100 mikrometrów nad miejscem wstrzyknięcia.Po umieszczeniu kaniuli LED na miejscu dodaj kroplę 100 mikrolitrów kleju tkankowego na krawędzi kraniotomii. Użyj sterylnej szczoteczki, aby stopniowo nakładać świeżo przygotowaną mieszankę cementu dentystycznego wokół łącznika kaniuli, budując warstwy, aż czaszka zostanie pokryta, a łącznik zostanie bezpiecznie przymocowany do czaszki, pozostawiając szpilki całkowicie wolne. Gdy cement całkowicie wyschnie, zamknij skórę wokół implantu za pomocą kleju tkankowego.Następnie umieść mysz w klatce regeneracyjnej nad poduszką grzewczą w temperaturze 33 stopni Celsjusza, monitorując oznaki dyskomfortu lub bólu. Nagrywaj zachowanie zwierzęcia zwykłą kamerą i rejestruj od 30 do 60 klatek na sekundę z przodu komory. Pod komorą treningową można umieścić lustro pod kątem 45 stopni, aby monitorować postawę zwierzęcia.Gdy myszy zaczną docierać do pastylki, należy ręcznie obrócić kaniulę LED za pomocą pilota zdalnego sterowania, aby zapewnić ciągłą stymulację przez czas wykonywania zachowania nie dłużej niż dwie sekundy. Urządzenie stymulujące wyzwala diodę LED o długości 470 nanometrów z intensywnością na końcu jednego miliwata na milimetr kwadratowy. Zachowania motoryczne zwierzęcia poddanego manipulacjom optogenetycznym badano za pomocą zadania sięgania do chwytania.Myszy nauczyły się wykonywać zadanie w ciągu kilku dni i osiągnęły ponad 55% dokładności, osiągając plateau po pięciu dniach treningu. Trajektoria ruchów była śledzona za pomocą szybkiej wideografii, co umożliwiło analizę kinematyki. Przeprowadzono kwantyfikowalną ocenę parametrów, takich jak przebyta odległość, prędkość, przyspieszenie, punkt końcowy i trajektoria.W nieudanych próbach myszy rozpoczęły ruch chwytania dalej od granulki niż w próbach uderzenia. Dodatkowo, błędy były istotnie związane z postawą myszy, co przejawiały się w różnicach w kącie nachylenia ciała podczas prób trafienia i chybienia. Kontralateralna aktywacja neuronów projekcyjnych kolczastych z ekspresją dopaminy D1 lub SPN zmniejszyła sukces chwytania w porównaniu z warunkami kontrolnymi.Podczas stymulacji optogenetycznej trajektoria łapy zwiększyła się na długości podróży, co prowadziło do niemożności wycelowania w śrut i wzrostu błędu początkowego typu pierwszego. Analiza głównych składowych (PCA) wykazała, że wszystkie trajektorie prób podczas kontralateralnej aktywacji SPN D1 rozdzieliły się w klastrze prawie bez nakładania się na klaster kontrolny, co wskazuje na niskie podobieństwo. Aktywacja DSPN po stronie ipsilateralnej doprowadziła do wzrostu dyspersji trajektorii wykazanej przez analizę PCA.W związku z tym ipsilateralna aktywacja SPN D1 modyfikowała trajektorię osiągania bez zmiany wyniku behawioralnego. Podczas wykonywania tego protokołu należy uważać, aby prawidłowo umieścić kaniulę, aby nie odczepiła się podczas sesji treningowych. Metoda ta może być stosowana w innych paradygmatach behawioralnych do badania zachowań motorycznych, przetwarzania sensorycznego, uczenia się i pamięci.Optogenetyka bezprzewodowa pozwoli na badanie zachowań naturalistycznych i ich neurobiologicznych podstaw u osób poruszających się naprawdę swobodnie.

in-vivo-wireless-optogenetic-control-of-skilled-motor-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Kodani, S., et.al. Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronalnych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje optogenetyczną manipulację obwodami neuronalnymi zaangażowanymi w przejście ze snu do czuwania u myszy. Zabieg polega na chirurgicznym wszczepieniu światłowodu i elektrod do mózgu i mięśni, aby umożliwić stymulację światłem i zapis elektrofizjologiczny. Dostarczając światło w celu aktywacji światłoczułych kanałów kationowych w...

Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Rozwój optogenetyki dostarcza teraz środków do precyzyjnej stymulacji genetycznie zdefiniowanych neuronów i obwodów, zarówno in vitro, jak i in vivo.  Tutaj opisujemy montaż i wszczepienie światłowodu do przewlekłej fotostymulacji tkanki mózgowej.

Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Tutaj prezentujemy metodę dostarczania wektorów ekspresji wirusa do mózgu za pomocą jedwabnych folii fibroinowych. Ta metoda pozwala na ukierunkowane dostarczanie wektorów ekspresyjnych za pomocą światłowodów pokrytych jedwabiem/AAV, światłowodów stożkowych i okien czaszkowych.

In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Poznaj bezprzewodową optogenetykę do badania wykwalifikowanych zachowań motorycznych u myszy. Ta metoda łączy manipulację neuronami z analizą kinematyczną ruchów, pomagając zrozumieć mechanizmy kontroli ruchowej.

In vivo (in vivo) Bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych

Przeglądaj więcej filmów