Name: Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji glikogenu wątrobowego zachowującą strukturę cząsteczek i minimalizującą utratę małych cząsteczek. Protokół obejmuje gotowanie w celu inaktywacji enzymów degradujących glikogen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Panu Gaosheng Wu i Pani Yunwen Zhu za pomoc techniczną z FACE oraz Panu Zhenxia Hu i Panu Dengbin za pomoc techniczną z SEC. MAS jest wspierany przez Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees oraz L G McCallam Est and George Weaber Trusts. Praca ta była wspierana przez Priorytetowy Program Akademicki Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu, C1304013151101138 grantowy Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych oraz program talentów Jiangsu Innovation and Entrepreneurship 2017. Rysunki 1-5 zostały stworzone przy użyciu BioRender.

Wątroby myszy użyte do optymalizacji tej procedury21 pochodziły od 12 samców myszy tła BKS-DB/Nju (7,2 tygodnia, zobacz Tabelę Materiałów). Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Tkanki zwierzęce
<ol>
	<li>Zważ wątrobę myszy (1-1,8 g całej wątroby z każdej myszy).</li>
	<li>Szybko zamrozić wątrobę myszy w ciekłym azocie i przechowywać ją w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie buforu i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować bufor izolacyjny glikogenu zawierający 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF i 5 mM pirofosforanu sodu z wodą dejonizowaną i dostosować pH do 8.</li>
	<li>Przygotuj 30% (w/w) roztwór sacharozy (uznany za najbardziej optymalny dla glikogenu wątrobowego21).</li>
	<li>Przygotować bufor octanu sodu (1 M, pH 4,5), bufor kwasu octowego (0,1 M, pH 3,5), roztwór wodorotlenku sodu (0,1 M) i cyjanoborowodorek sodu (1 M).</li>
	<li>Przygotować roztwór 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonianu (APTS), dodając 5 mg APTS do 50 μl 15% lodowatego kwasu octowego.</li>
	<li>Przygotować roztwór azotanu amonu zawierający 50 mM azotanu amonu z 0,02% azydkiem sodu.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja glikogenu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Przenieść zamrożoną tkankę wątroby (~1 g) do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 6 ml buforu do izolacji glikogenu.</li>
	<li>Trzymając go na lodzie, homogenizuj tkankę wątroby za pomocą homogenizatora tkankowego.</li>
	<li>Przenieść połowę zawiesiny (3 ml) do nowej probówki i gotować przez 10 minut (optymalne do badań strukturalnych glikogenu21). Drugą połowę zawiesiny (3 ml) należy przechowywać na lodzie w celu ekstrakcji glikogenu zawierającego powiązane białka, które nie są denaturowane. 
	UWAGA: Niegotowane próbki należy zawsze przechowywać na lodzie podczas etapów ekstrakcji glikogenu. Jeśli białka glikogenu nie są ważne dla badania, cała próbka może zostać poddana 10-minutowemu etapowi wrzenia.</li>
	<li>Z każdej probówki wyjąć podwielokrotność o objętości 8 μl, utrzymać podwielokrotności na lodzie i użyć ich do oznaczenia zawartości glikogenu (patrz sekcja 4).</li>
	<li>Pozostałą zawiesinę odwirować w temperaturze 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do probówek ultrawirówek i odwirować je w temperaturze 3,6 × 105 g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pozostałe supernatanty należy odrzucić i ponownie zawiesić granulki w 1,5 ml buforu izolacyjnego do izolacji glikogenu.</li>
	<li>Próbki należy umieścić warstwami na 1,5 ml 30% roztworu sacharozy w probówkach ultrawirówek o pojemności 4 ml i odwirować w temperaturze 3,6 × 10-5 g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pozostałe supernatanty należy wyrzucić i ponownie zawiesić granulki w 200 μl wody dejonizowanej.</li>
	<li>Dodać 800 μl bezwzględnego etanolu do zawiesin i dobrze wymieszać, aby wytrącić glikogen23,24. Mieszaniny należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wytrącenie się powietrza.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 200 μl wody dejonizowanej.</li>
	<li>Powtórz ten proces wytrącania etanolu 3x i ponownie zawieś końcowe granulki glikogenu w 200 μl wody dejonizowanej.</li>
	<li>Usunąć podwielokrotność 8 μl z każdej probówki w celu oznaczenia zawartości glikogenu (patrz sekcja 4).</li>
	<li>Pozostałe supernatanty zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować (liofilizować) przez noc. Suche próbki glikogenu należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Suche próbki glikogenu powinny być stabilne w temperaturze -20 °C; Nie ma jednak danych wskazujących, jak długo utrzymują się one bez żadnych zmian strukturalnych.</li>
</ol>
4. Oznaczanie zawartości glikogenu (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Dodać 8 μl supernatantów glikogenu (patrz sekcje 3.13 i 3.4), 5 μl amyloglukozydazy (3269 j./ml) i 100 μl buforu octanu sodu (1 M, pH 4,5) do probówki mikrowirówki i napełnić probówkę do oznaczenia 500 μl wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Przygotuj kontrole, które wykorzystują wodę dejonizowaną zamiast amyloglukozydazy.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut, utrzymując kontrole na lodzie.</li>
	<li>Odwirować przy 6 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zmieszać 300 μl każdego otrzymanego supernatantu z 1 ml odczynnika oksydazy/peroksydazy glukozydazy (GOPOD).</li>
	<li>Skonstruuj krzywą kalibracyjną, mieszając 300 μl denionizowanej wody zawierającej 0, 10, 20, 30, 40 i 50 μg D-glukozy z 1 ml odczynnika GOPOD.</li>
	<li>Inkubować mieszaniny w temperaturze 50 °C przez kolejne 30 minut.</li>
	<li>Odczytać absorbancję (510 nm) każdej próbki za pomocą 96-dołkowych płytek (150 μl na studzienkę) za pomocą spektrofotometru UV-vis.</li>
	<li>Odjąć absorbancję próbek kontrolnych (bez amyloglukozydazy) od absorbancji próbek doświadczalnych, a następnie obliczyć zawartość glikogenu na podstawie krzywej wzorcowej D-glukozy.</li>
</ol>
5. Uzysk surowy, uzysk glikogenu i oznaczanie czystości
<ol>
	<li>Aby uzyskać surowy plon, zważyć liofilizowaną próbkę glikogenu i obliczyć wydajność jako procent mokrej tkanki wątroby. 
	UWAGA: Wydajność tę należy dostosować w celu skorygowania o podwielokrotności pobrane na każdym etapie zawartości glikogenu.</li>
	<li>W celu zapewnienia czystości glikogenu należy oznaczyć zawartość glikogenu w końcowych granulkach, jak opisano w sekcji 4. Obliczyć czystość jako procent oznaczonej zawartości glikogenu w stosunku do uzysku surowego (patrz krok 5.1).</li>
	<li>W celu uzyskania uzysku glikogenu należy oznaczyć zawartość glikogenu w homogenizowanych próbkach bez gotowania i przed odwirowaniem, jak opisano w sekcji 4. Obliczyć uzysk glikogenu jako procent zawartości glikogenu w końcowych granulkach (patrz krok 5.2) w stosunku do zawartości glikogenu oznaczonej w początkowym homogenacie.</li>
</ol>
6. Analiza rozkładów długości łańcucha (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Odważyć 0,5 mg liofilizowanego glikogenu w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do probówek dodać 90 μl wody dejonizowanej i 1,5 μl azydku sodu (0,04 g/ml).</li>
	<li>Dodać 5 μl buforu kwasu octowego (0,1 M, pH 3,5) i 2 μl roztworu izoamylazy (180 U/mg) do probówek w celu rozgałęzienia glikogenu.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu wodorotlenku sodu (0,1 M) do próbek, aby zwiększyć pH do 7,0.</li>
	<li>Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować (liofilizować) przez noc.</li>
	<li>Do liofilizowanego rozgałęzionego glikogenu dodać 2 μl roztworu APTS (5 mg APTS w 50 μl 15% lodowatego kwasu octowego) i 2 μl cyjanoborowodorku sodu (1 M).</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 4 000 × g przez 2 minuty.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 60 °C przez 3 godziny w ciemności. 
	UWAGA: Tubę można przykryć folią aluminiową, aby chronić zawartość przed światłem.</li>
	<li>Dodać 200 μl wody dejonizowanej do próbek i wirować je, aż cały osad się rozpuści.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 4 000 × g przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieść podwielokrotności 50 μl do mikrofiolek do elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) w celu analizy. 
	UWAGA: Dane przedstawiono jako względną obfitość (rozgałęzionych) łańcuchów (Nde(X)) dla każdego stopnia polimeryzacji (DP, symbol X).</li>
</ol>
7. Analiza rozkładu wielkości cząsteczek (Rysunek 5)
<ol>
	<li>Rozpuścić 0,5 mg liofilizowanego glikogenu w 50 mM azotanu amonu i 0,02% azydku sodu w stężeniu 1 mg/ml.</li>
	<li>Próbki inkubować w termomieszalniku w temperaturze 80 °C przez 3 godziny przy 300 obr./min.</li>
	<li>Wstrzykiwać próbki do systemu SEC za pomocą kolumny wstępnej i kolumn 1000 A i 10 000 A w temperaturze 80 °C przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min (patrz tabela materiałów). Użyj detektora indeksu refrakcji, aby określić względną masę cząsteczek w każdej objętości elucji.</li>
	<li>Stosując wzorce pullulanu (PSS) o masach molowych w zakresie od 342 do 1,22 × 106, należy wykreślić uniwersalną krzywą kalibracyjną SEC, aby przeliczyć czas elucji na Rh (promień hydrodynamiczny). Wyrazić dane z detektora różnicowego indeksu refrakcji (DRI) jako rozkład masy SEC w (log Rh) w funkcji Rh.</li>
</ol>

<ol><li>Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHills%2C+DM+%22Life%3A+the+science+of+biology.+12th+edn%22">Life: the science of biology. 12th edn</a>. Freeeman, W. H. , (2020).</li>
<li>Calder, P. C., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+of+high+molecular+weight+from+mammalian+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle.</a> Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).</li>
<li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes+-+The+organelles+of+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li>
<li>Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafine+structure+of+glycogen+macromolecules+in+mammalian-tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).</li>
<li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologie+du+glycogene+-+etude+au+microscope+electronique+de+colorations+negatives+du+glycogene+particulaire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li>
<li>Besford, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li>
<li>Lumsden, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+structure+of+glycogen+in+some+cyclophyllidean+and+trypanorhynch+cestodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes.</a> Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).</li>
<li>Deng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+diabetic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in diabetic liver.</a> Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).</li>
<li>Deng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers%2C+exemplified+by+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular-size+dependence+of+glycogen+enzymatic+degradation+rate+and+its+importance+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Polymer+Journal%22%5BJournal%5D)">The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes.</a> European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+structure+in+type+1+diabetic+mice%3A+towards+understanding+the+origin+of+diabetic+glycogen+molecular+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+control+of+glycogen+metabolism+in+knockout+mice+lacking+the+muscle-specific+protein+phosphatase+PP1G%2FR-GL%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).</li>
<li>Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhomogeneity+of+glycogen+as+a+function+of+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight.</a> Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).</li>
<li>Nahorski, S. R., Rogers, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymic+fluorometric+micro+method+for+determination+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen.</a> Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structural+features+of+glycogen+in+the+kidneys+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats.</a> Carbohydrate Polymers. 229, 115526(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in Escherichia coli.</a> Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structural+analyses+of+purified+glycogen+particles+from+rat+liver%2C+human+skeletal+muscle+and+commercial+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).</li>
<li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-degradative+method+to+purify+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">A new non-degradative method to purify glycogen.</a> Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+liver+glycogen+extraction+when+considering+molecular+fine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure.</a> Carbohydrate Polymers. 261, 117887(2020).</li>
<li>Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+fine+structure+to+identify+optimal+methods+of+extracting+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Starch+-+Starke%22%5BJournal%5D)">Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch.</a> Starch - Starke. 72, 1900214(2020).</li>
<li>Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+classical+assay+method+for+liver+glycogen+fractions%3A+ASG+is+the+main+and+metabolic+active+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).</li>
<li>Kerly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The solubility of glycogen.</a> The Biochemical Journal. 24, 67-76 (1930).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+size-exclusion+chromatography+for+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Improving size-exclusion chromatography for glycogen.</a> Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+glycogen+chain+length+correlates+with+insolubility+in+mouse+models+of+polyglucosan-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases.</a> Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).</li>
<li>Orrell, S. A., Bueding, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+products+obtained+by+various+procedures+used+for+the+extraction+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen.</a> Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+glycogen+alpha-particle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into glycogen alpha-particle formation.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Wcześniejsze badania wykazały, że struktura glikogenu jest ważna dla jego właściwości; Na przykład wielkość cząsteczki wpływa na szybkość degradacji glikogenu10, a rozkład długości łańcucha wpływa na jego rozpuszczalność26. Aby właściwie zrozumieć te zależności, ważne jest, aby wyekstrahować glikogen za pomocą procedury, która w jak największym stopniu izoluje reprezentatywną i nieuszkodzoną próbkę. Tradycyjne metody ekstrakcji wykorzystywały albo gorące warunki alkaliczne,...

Glikogen to złożony, rozgałęziony polimer glukozy występujący u zwierząt, grzybów i bakterii1. U ssaków glikogen wątrobowy działa jako bufor glukozy we krwi, zachowując homeostazę, podczas gdy glikogen mięśniowy działa jako krótkoterminowy rezerwuar glukozy, który bezpośrednio dostarcza energię2. Struktura glikogenu jest często opisywana przez trzy poziomy (pokazane na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1): 1. Łańcuchy liniowe są tworzone przez monomery glukozy za pośrednictwem (1→4)-α wiązań glikozydowych, przy czym punkty rozgałęzień są połączone wiązaniami glikozydowymi (1→6)-α; 2. silnie rozgałęzione cząstki β (o średnicy ~20 nm), które, szczególnie w tkankach takich jak mięśnie szkieletowe, działają jak niezależne cząsteczki glikogenu<klasa SUP = "xref">3,<klasa SUP = "xref">4; 3. Większe α cząstki glikogenu (do 300 nm średnicy), które składają się z mniejszych jednostek glikogenu β, które znajdują się w Liver5, heart6 oraz u niektórych gatunków niebędących ssakami7. Cząstki α wątroby myszy z cukrzycą są molekularnie kruche, z tendencją do degradacji do β cząstek po rozpuszczeniu w dimetylosulfotlenku (DMSO), podczas gdy cząstki α z kontroli bez cukrzycy na ogół pozostają niezmienione. Jedna z hipotez głosi, że ta kruchość może nasilać słabą równowagę glukozy we krwi obserwowaną w cukrzycy, przy czym kruche cząstki α potencjalnie skutkują wyższym odsetkiem szybciej degradowanych cząstek β8,9,10,11.
Tradycyjne metody ekstrakcji glikogenu wykorzystują stosunkowo trudne warunki wystawiania tkanki wątroby na działanie gorącego roztworu alkalicznego12 lub roztworów kwasów, takich jak kwas trichlorooctowy (TCA)13 lub kwas nadchlorowy (PCA)14. Chociaż metody te są skuteczne w oddzielaniu glikogenu od innych składników tkanki wątroby, nieuchronnie degradują strukturę glikogenu do pewnego stopnia15,16. Chociaż metody te są odpowiednie do ilościowego pomiaru zawartości glikogenu, nie są idealne do badań skoncentrowanych na uzyskaniu informacji strukturalnych na glikogenie z powodu tego uszkodzenia strukturalnego. Od czasu opracowania tych metod opracowano łagodniejszą procedurę ekstrakcji, która wykorzystuje zimny bufor Tris (wykazano, że hamuje degradację glukozydazy) z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości sacharozy17,18,19. Przy pH kontrolowanym na poziomie ~8 metoda ta nie poddaje glikogenu hydrolizie kwasowej lub zasadowej obserwowanej w poprzednich procedurach.
Ultrawirowanie gradientu gęstości sacharozy homogenizowanej tkanki wątroby może oddzielić cząsteczki glikogenu od większości materiału komórkowego. W razie potrzeby dodatkowe oczyszczanie można przeprowadzić za pomocą preparatywnej chromatografii wykluczającej wielkość, w wyniku czego uzyskuje się pobranie oczyszczonego glikogenu z przyłączonymi białkami asocjującymi glikogen20. Chociaż ta metoda, w łagodniejszych warunkach, z większym prawdopodobieństwem zachowa strukturę glikogenu, trudno jest zapobiec utracie części glikogenu w supernatancie, zwłaszcza mniejszych cząstkach glikogenu, które są mniej gęste15. Inną potencjalną przyczyną utraty glikogenu jest to, że łagodniejsze warunki pozwalają na pewną degradację enzymatyczną, co skutkuje niższą wydajnością glikogenu w porównaniu z ostrzejszymi metodami ekstrakcji. Ostatnie badania wykazały optymalizację metody ekstrakcji glikogenu w wątrobie w celu zachowania struktury glikogenu21. Tutaj przetestowano różne stężenia sacharozy (30%, 50%, 72,5%) w celu ustalenia, czy niższe stężenia sacharozy minimalizują utratę mniejszych cząstek glikogenu. Uzasadnieniem było to, że mniejsza gęstość pozwoliłaby mniejszym, mniej gęstym cząstkom przeniknąć do warstwy sacharozy i zagregować się w granulce z resztą glikogenu.
W tym badaniu, metody ekstrakcji z i bez 10-minutowego etapu gotowania zostały porównane, aby sprawdzić, czy enzymy rozkładu glikogenu mogą zostać zdenaturowane, co skutkuje ekstrakcją większej ilości glikogenu, który był również wolny od częściowej degradacji. Do określenia struktury ekstrahowanego glikogenu wykorzystano rozkłady całkowitej wielkości cząsteczki i rozkłady długości łańcucha glikogenu, podobnie jak w przypadku optymalizacji ekstrakcji skrobi opublikowanej wcześniej22. Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) z detekcją różnicowego indeksu refrakcji (DRI) została wykorzystana do uzyskania rozkładów wielkości glikogenu, które opisują całkowitą masę cząsteczkową w funkcji wielkości cząsteczki. Elektroforeza węglowodanowa wspomagana fluoroforem (FACE) została wykorzystana do analizy rozkładów długości łańcuchów, które opisują względną liczbę łańcuchów glukozydowych o każdej danej wielkości (lub stopniu polimeryzacji). W artykule opisano metodologię ekstrakcji glikogenu z tkanek wątroby w oparciu o poprzednie badanie optymalizacyjne21. Dane sugerują, że metodą najbardziej odpowiednią do zachowania struktury glikogenu jest stężenie sacharozy wynoszące 30% w 10-minutowym etapie wrzenia.

<table><tbody><tr><td>8-aminopireno-1,3,6-trisulfonian (APTS)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9341</td><td>0,1 M roztwór</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>695092</td><td>0,1 M, roztwór pH 3,5</td></tr><tr><td>System SEC Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)</td></tr><tr><td>BKS-DB/Nju myszy tła</td><td>Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University Nanjing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania D-glukozy (format GOPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenoditrilotetraoctowy (EDTA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>IKA</td><td>T 25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0,1 M roztwór</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0,1 M roztwór</td></tr><tr><td>P/ACE MDQ plus system</td><td>Ab Sciex, US</td><td></td><td>Elektroforeza węglowodanowa wspomagana fluoroforem (FACE)</td></tr><tr><td>Detektor indeksu refrakcji</td><td>Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)</td><td></td><td>Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>241245</td><td>1 M, roztwór pH 4,5</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sicynoborowodorek sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>156159</td><td>1 M roztwór</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>43617</td><td>0,1 M roztwór</td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>NISTRM8569</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>V90016</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wstępna SUPREMA, 1 000 i 10 000 kolumn</td><td>Usługi w zakresie standardów polimerów, Moguncja, Niemcy</td><td></td><td>Chromatografia wykluczania według wielkości (SEC)</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T 1503</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman</td><td></td><td>4 mL, Otwarta cienkościenna probówka ultraprzezroczysta, 11 x 60 mm</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Glikogen wątrobowy to hiperrozgałęziony polimer glukozy, który bierze udział w utrzymaniu poziomu cukru we krwi u zwierząt. Na właściwości glikogenu ma wpływ jego struktura. W związku z tym odpowiednia metoda ekstrakcji, która izoluje reprezentatywne próbki glikogenu, ma kluczowe znaczenie dla badania tej makrocząsteczki. W porównaniu z innymi metodami ekstrakcji, metoda wykorzystująca etap wirowania w gradiacji gęstości sacharozy może zminimalizować uszkodzenia molekularne. Opierając się na tej metodzie, niedawna publikacja opisuje, w jaki sposób zmieniano gęstość roztworu sacharozy używanego podczas wirowania (30%, 50%, 72,5%), aby znaleźć najbardziej odpowiednie stężenie do ekstrakcji cząstek glikogenu o różnych rozmiarach, ograniczając utratę mniejszych cząstek. Wprowadzono 10-minutowy etap wrzenia, aby przetestować jego zdolność do denaturacji enzymów rozkładających glikogen, zachowując w ten sposób glikogen. Wykazano, że najniższe stężenie sacharozy (30%) i dodanie etapu wrzenia pozwoliły na ekstrakcję najbardziej reprezentatywnych próbek glikogenu.

Podczas gdy opisana powyżej procedura dotyczy metody najbardziej optymalnej (30% sacharozy z dodatkiem etapu gotowania przez 10 min), tutaj przedstawiono dane dla glikogenu ekstrahowanego przy użyciu trzech stężeń sacharozy (30%, 50%, 72,5%), z etapem gotowania i bez niego, zgodnie z wcześniejszym opisem21. Zgodnie z protokołem, czystość, wydajność całkowita i wydajność glikogenu dla suchego glikogenu ekstrahowanego w różnych warunkach podano w Tabeli 1, powielonej z<sup class="xr...

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Protokół ten pozwala na ekstrakcję cząsteczek glikogenu wątrobowego w sposób, który zachowuje ich strukturę i ogranicza ilość traconych małych cząstek glikogenu. Ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że cukrzyca zmienia strukturę glikogenu, metoda ta może pomóc w badaniu cukrzycy i różnych chorób związanych z magazynowaniem glikogenu. Aby wyekstrahować glikogen z wątroby, zacznij od przeniesienia jednego grama zamrożonej tkanki wątroby do 15-mililitrowej probówki zawierającej sześć mililitrów buforu izolacyjnego glikogenu.Trzymając na lodzie, homogenizuj tkankę wątroby za pomocą homogenizatora tkankowego. Po zakończeniu przenieś pół lub trzy mililitry zawiesiny komórek do nowej probówki, a następnie gotuj przez 10 minut. Drugą połowę zawiesiny należy przechowywać na lodzie w celu ekstrakcji białek towarzyszących zawierających glikogen, które nie są denaturowane.W celu oznaczenia zawartości glikogenu należy usunąć podwielokrotność ośmiu mikrolitrów z każdej probówki i trzymać probówkę na lodzie. Po odwirowaniu pozostałej zawiesiny w temperaturze 6 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść supernatant do probówek ultrawirówek w celu odwirowania ich w temperaturze 3,6 razy 10 do piątej G i czterech stopni Celsjusza przez 90 minut. Po odrzuceniu pozostałych supernatantów ponownie zawiesić granulki w 1,5 mililitra buforu izolacyjnego glikogenu.Następnie ułóż próbki na 1,5 mililitra 30% roztworu sacharozy w czterech mililitrowych probówkach ultrawirówek, a następnie odwiruj, jak opisano wcześniej, przez dwie godziny. Po wyrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach wody dejonizowanej. Aby wytrącić glikogen z zawiesiny komórek, dodaj 800 mikrolitrów absolutnego etanolu do zawiesin komórek i dobrze wymieszaj.Następnie przechowuj mieszaniny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby umożliwić wytrącenie się. Po wytrąceniu się należy odwirować próbki o sile 6 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić granulki glikogenu w 200 mikrolitrach wody dejonizowanej, aby powtórzyć proces wytrącania etanolu trzykrotnie. Z końcowej zawiesiny komórek pobrać podwielokrotność ośmiu mikrolitrów z każdej probówki w celu oznaczenia zawartości glikogenu.Następnie zamrozić pozostałe supernatanty w ciekłym azocie i wysuszyć przez noc. Następnego dnia wysuszone próbki glikogenu przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W badaniu przeanalizowano czystość, surowy uzysk i uzysk glikogenu w wysuszonej próbce glikogenu ekstrahowanej w różnych warunkach.Nie stwierdzono istotnych różnic w uzysku surowym i uzysku glikogenu między grupami ekstrahowanymi w różnych warunkach. Natomiast na czystość glikogenu istotny wpływ miało stężenie sacharozy i dodanie etapu wrzenia. Glikogen o najwyższej czystości został wyekstrahowany przy użyciu 30% stężenia sacharozy i 10-minutowego etapu wrzenia.Glikogen ekstrahowano z homogenatu wątroby za pomocą 30%50% lub 72,5% sacharozy, gotowanej lub niegotowanej, w celu oceny wpływu różnych warunków na wielkość cząsteczek w ekstrakcie końcowym. Analizę długości łańcucha przeprowadzono na sześciu wątrobach, zarówno gotowanych, jak i niegotowanych, przy użyciu stężeń 30%50% i 72,5% sacharozy. Obliczono zawartość cząsteczek glikogenu lub cząstek beta o promieniu hydrodynamicznym RH mniejszym niż 30 nanometrów.Próbki gotowane miały niższe średnie wartości wilgotności względnej i wyższą zawartość cząstek niż próbki niegotowane. Ponadto niższe stężenia sacharozy skutkowały niższymi wartościami wilgotności względnej i wyższą zawartością cząstek beta. Wprowadzenie etapu wrzenia prowadziło również do obniżenia wartości RH max lub maksymalnych, podczas gdy stężenie sacharozy nie miało istotnego wpływu.Upewnij się, że tkanka jest w pełni homogenizowana i nie pozostały żadne kawałki tkanki. Technika ta toruje nam drogę do zbadania, jakie ścieżki łączą ze sobą mniejsze cząstki beta, tworząc większe cząstki alfa.

the-extraction-liver-glycogen-molecules-for-glycogen-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie opisujemy jakościowy test spektrofotometryczny, aby określić zakres rozgałęzień w próbce glikogenu o niescharakteryzowanej strukturze. Porównanie maksimów absorbancji próbki niescharakteryzowanej z maksimum polisacharydów o znanych strukturach rozgałęzionych wskazuje na obecność rozgałęzień w próbce niescharakteryzowanej.

Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

W tym filmie pokazujemy przygotowanie próbki ludzkiej tkanki mięśni szkieletowych i jej barwienie do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu wizualizacji i ilościowego określenia subkomórkowego rozkładu glikogenu.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa w celu ilościowego określenia dystrybucji glikogenu w ludzkich mięśniach szkieletowych

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.

Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

Protokół ten opisuje kluczowe kroki umożliwiające rygorystyczne i powtarzalne pomiary zarówno glikogenu, jak i glikanów powiązanych z N za pomocą spektrometrii masowej.

Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Poznaj metodę ekstrakcji glikogenu wątrobowego zachowującą strukturę cząsteczek i minimalizującą utratę małych cząsteczek. Protokół obejmuje gotowanie w celu inaktywacji enzymów degradujących glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Przeglądaj więcej filmów