Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Protokół ten pozwala na ekstrakcję cząsteczek glikogenu wątrobowego w sposób, który zachowuje ich strukturę i ogranicza ilość traconych małych cząstek glikogenu. Ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że cukrzyca zmienia strukturę glikogenu, metoda ta może pomóc w badaniu cukrzycy i różnych chorób związanych z magazynowaniem glikogenu. Aby wyekstrahować glikogen z wątroby, zacznij od przeniesienia jednego grama zamrożonej tkanki wątroby do 15-mililitrowej probówki zawierającej sześć mililitrów buforu izolacyjnego glikogenu.

Trzymając na lodzie, homogenizuj tkankę wątroby za pomocą homogenizatora tkankowego. Po zakończeniu przenieś pół lub trzy mililitry zawiesiny komórek do nowej probówki, a następnie gotuj przez 10 minut. Drugą połowę zawiesiny należy przechowywać na lodzie w celu ekstrakcji białek towarzyszących zawierających glikogen, które nie są denaturowane.

W celu oznaczenia zawartości glikogenu należy usunąć podwielokrotność ośmiu mikrolitrów z każdej probówki i trzymać probówkę na lodzie. Po odwirowaniu pozostałej zawiesiny w temperaturze 6 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść supernatant do probówek ultrawirówek w celu odwirowania ich w temperaturze 3,6 razy 10 do piątej G i czterech stopni Celsjusza przez 90 minut. Po odrzuceniu pozostałych supernatantów ponownie zawiesić granulki w 1,5 mililitra buforu izolacyjnego glikogenu.

Następnie ułóż próbki na 1,5 mililitra 30% roztworu sacharozy w czterech mililitrowych probówkach ultrawirówek, a następnie odwiruj, jak opisano wcześniej, przez dwie godziny. Po wyrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach wody dejonizowanej. Aby wytrącić glikogen z zawiesiny komórek, dodaj 800 mikrolitrów absolutnego etanolu do zawiesin komórek i dobrze wymieszaj.

Następnie przechowuj mieszaniny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby umożliwić wytrącenie się. Po wytrąceniu się należy odwirować próbki o sile 6 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić granulki glikogenu w 200 mikrolitrach wody dejonizowanej, aby powtórzyć proces wytrącania etanolu trzykrotnie. Z końcowej zawiesiny komórek pobrać podwielokrotność ośmiu mikrolitrów z każdej probówki w celu oznaczenia zawartości glikogenu.

Następnie zamrozić pozostałe supernatanty w ciekłym azocie i wysuszyć przez noc. Następnego dnia wysuszone próbki glikogenu przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W badaniu przeanalizowano czystość, surowy uzysk i uzysk glikogenu w wysuszonej próbce glikogenu ekstrahowanej w różnych warunkach.

Nie stwierdzono istotnych różnic w uzysku surowym i uzysku glikogenu między grupami ekstrahowanymi w różnych warunkach. Natomiast na czystość glikogenu istotny wpływ miało stężenie sacharozy i dodanie etapu wrzenia. Glikogen o najwyższej czystości został wyekstrahowany przy użyciu 30% stężenia sacharozy i 10-minutowego etapu wrzenia.

Glikogen ekstrahowano z homogenatu wątroby za pomocą 30%50% lub 72,5% sacharozy, gotowanej lub niegotowanej, w celu oceny wpływu różnych warunków na wielkość cząsteczek w ekstrakcie końcowym. Analizę długości łańcucha przeprowadzono na sześciu wątrobach, zarówno gotowanych, jak i niegotowanych, przy użyciu stężeń 30%50% i 72,5% sacharozy. Obliczono zawartość cząsteczek glikogenu lub cząstek beta o promieniu hydrodynamicznym RH mniejszym niż 30 nanometrów.

Próbki gotowane miały niższe średnie wartości wilgotności względnej i wyższą zawartość cząstek niż próbki niegotowane. Ponadto niższe stężenia sacharozy skutkowały niższymi wartościami wilgotności względnej i wyższą zawartością cząstek beta. Wprowadzenie etapu wrzenia prowadziło również do obniżenia wartości RH max lub maksymalnych, podczas gdy stężenie sacharozy nie miało istotnego wpływu.

Upewnij się, że tkanka jest w pełni homogenizowana i nie pozostały żadne kawałki tkanki. Technika ta toruje nam drogę do zbadania, jakie ścieżki łączą ze sobą mniejsze cząstki beta, tworząc większe cząstki alfa.