Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Opisujemy pobieranie komórek macierzystych dróg oddechowych z błony śluzowej nosa. Komórki te są rozszerzane i różnicowane w pseudostratyfikowany nabłonek w laboratorium. Jest to ekspansja i różnicowanie in vitro, które jest podobne do naszych dróg oddechowych in vivo, co oznacza, że obecne są wyspecjalizowane komórki, takie jak komórki rzęskowe, które można wykorzystać do ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek.

Aby umożliwić spójne i powtarzalne określenie ilościowe częstotliwości uderzeń rzęsek u różnych osób i w odpowiedzi na różne leki, standaryzujemy warunki hodowli i akwizycję obrazu. Pomiary częstotliwości uderzeń rzęsek są stosowane jako narzędzia kliniczne w chorobach, takich jak pierwotna dyskineza rzęsek. Mamy nadzieję, że uda nam się ustalić to jako marker kliniczny mukowiscydozy.

Procedurę demonstrują Katelin Allan i Laura Fawcett, doktorantki z mojego laboratorium, oraz dr Sharon Wong, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od poproszenia uczestnika, aby oddychał przez usta. Następnie weź szczoteczkę do cytologii w rękę dominującą i opierając piąty palec na brodzie uczestnika, aby zakotwiczyć dłoń, włóż szczoteczkę do cytologii do przewodu nosowego uczestnika pod kątem 45 stopni do twarzy uczestnika i przełóż ją przez ujście nosowe.

Po obróceniu szczoteczki w pionie, tak aby była prostopadła do twarzy uczestnika, delikatnie ale stanowczo dosuń szczoteczkę do bocznej ściany nosa poniżej małżowiny dolnej, aż znajdzie się w środkowej lub tylnej części małżowiny dolnej. Obróć szczotkę o 360 stopni do trzech razy. Następnie wyjmij go delikatnie, odwracając manewr wkładania, aby komórki nie zostały wyjęte ze szczoteczki.

Umieść szczoteczkę w przygotowanej probówce z pożywką do pobierania komórek nosa i umieść probówkę na lodzie. Po delikatnym wirowaniu w celu usunięcia komórek ze szczotki, przenieś probówkę zbiorczą na lodzie z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety serologicznej przenieś pożywkę z probówki zbiorczej do nowej probówki, pozostawiając szczoteczki cytologiczne.

Następnie odwirować próbkę. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze warunkowego przeprogramowania pożywki komórkowej. Następnie za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej przepuść komórki przez sito komórkowe umieszczone na 50-mililitrowej probówce ruchem okrężnym.

Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, należy zebrać zawiesinę z dna probówki i kilkakrotnie przepuścić ją przez sito. Następnie wyrzuć sito komórkowe. Aby zasiać komórki nabłonka dróg oddechowych na przygotowanych przepuszczalnych wkładkach podporowych, należy dobrze wymieszać komórki bez tworzenia pęcherzyków, upewniając się, że są jednorodne i w zawiesinie.

Następnie dodać 150 mikrolitrów zawiesiny komórek na wierzchołkową stronę przygotowanych przepuszczalnych wkładów podporowych. Aby zróżnicować komórki nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz, hoduj je w pożywce różnicującej lub ALI przez dwa dni. Następnie odessać pożywkę i dodać 750 mikrolitrów pożywki ALI tylko do komory podstawowej, aby utworzyć granicę faz powietrze-ciecz.

Aby zasiać komórki nabłonka dróg oddechowych w kopułach ECM, należy ponownie zawiesić zdysocjowane komórki nabłonka dróg oddechowych o odpowiedniej objętości 90% ECM. Następnie, trzymając pipetę pionowo pod kątem 90 stopni jak najbliżej dna studzienki, dozować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek ECM do środka studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aż ECM zastygnie.

Podczas krzepnięcia ECM ogrzej pożywkę do wysiewu organoidów dróg oddechowych (AOSM) do temperatury pokojowej, aby zapobiec ponownemu upłynnieniu i rozpadowi kopuły ECM po dodaniu. Po inkubacji dodaj 500 mikrolitrów podgrzanego AOSM do każdej studzienki, dozując ścianę studzienki. Nie pipetować mediów bezpośrednio na kopułę ECM.

Zmieniaj nośnik co dwa dni przez cztery do siedmiu dni. Aby zassać media, przechyl płytkę pod kątem 45 stopni i odessaj od dolnej krawędzi studni z dala od kopuły ECM. Po czterech do siedmiu dniach rozpocznij różnicowanie organoidów, dodając 500 mikrolitrów podgrzanej pożywki do różnicowania organoidów dróg oddechowych lub AODM do każdej studzienki i zmieniaj pożywkę co dwa dni przez siedem dni.

Umieść płytkę hodowlaną zawierającą modele komórek nabłonka dróg oddechowych we wkładce płytki mikroskopu i zamknij komorę środowiskową mikroskopu. Pozwól próbce zrównoważyć się we wstępnie ogrzanej komorze mikroskopu wypełnionej dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. W okularze mikroskopu ustaw ostrość na modelu komórkowym.

Następnie za pomocą oprogramowania do akwizycji kliknij L100, aby przełączyć ścieżkę światła na port, w którym zamontowana jest kamera. Kliknij zielony przycisk Odtwórz, aby zobrazować pole widzenia mikroskopu za pomocą oprogramowania. Sprawdź, czy rzęski są ostre i dostosuj w razie potrzeby.

Aby uzyskać obrazy poklatkowe z menu, kliknij Pobierz, a następnie Fast TimeLapse. W wyskakującym okienku wybierz lokalizację zapisu i nazwę pliku, aby uzyskać 1 000 klatek. Aby wyświetlić podgląd rzęsek w polu widzenia mikroskopu, kliknij Zastosuj, a następnie zielony przycisk Odtwórz.

W razie potrzeby wyreguluj ostrość Z. Następnie kliknij Uruchom teraz, aby przechwycić Fast TimeLapse. Po zainstalowaniu niezbędnego oprogramowania i przyborników skopiuj odpowiednie niestandardowe skrypty analizy i folder skryptów pomocy technicznej na dysk lokalny komputera.

Następnie po oprogramowaniu komputerowym kliknij kartę Strona główna, a następnie Ustaw ścieżkę. W wyskakującym okienku kliknij Dodaj z podfolderami. W ścieżce wyszukiwania MATLAB wybierz wyświetlony folder.

Następnie kliknij Zapisz i zamknij. Upewnij się, że skrypty analizy są połączone z oprogramowaniem komputerowym, sprawdzając, czy są wyświetlane w panelu po lewej stronie. Następnie przenieś uzyskane przykładowe pliki obrazów RAW na dysk lokalny komputera.

Następnie kliknij plik skryptu analizy BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m w oprogramowaniu komputerowym. Aby uruchomić skrypt, kliknij kartę Edytor, a następnie zielony przycisk Odtwórz.

W wyświetlonym oknie monitu wybierz pliki obrazów RAW do analizy. Wprowadź czas naświetlania dla czasu akwizycji na klatkę. Następnie kliknij OK. Uruchom polecenie GetFirstAmplitude.

m w folderze zawierającym pliki AveSpectrum. Poczekaj, aż skrypt wyświetli FirstAmplitudeStacked. plik XLSX, który zawiera najwyższą częstotliwość amplitudy i mieści się w fizjologicznym zakresie bicia rzęsek nabłonka dróg oddechowych.

Skopiuj wartości częstotliwości z pliku FirstAmplitudeStacked. xlsx i wykreśl je za pomocą oprogramowania do analizy naukowej. Przedstawiono wyniki częstości uderzeń rzęsek mierzonej w modelach ALI komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących od trzech uczestników z mukowiscydozą i trzech zdrowych uczestników z grupy kontrolnej.

W 14 dniu różnicowania kultur obecne były bijące rzęski. Od 14 dnia, 21 dnia różnicowania kultur, nie zaobserwowano statystycznie istotnego wzrostu częstości uderzeń rzęsek między kohortami. W 21 dniu różnicowania kultur średnia częstość bicia rzęsek u zdrowych uczestników z grupy kontrolnej była znacznie wyższa niż u uczestników z mukowiscydozą.

Ponadto, gdy częstotliwość uderzeń rzęsek została zobrazowana w tych samych modelach komórkowych po usunięciu śluzu, nastąpił statystycznie istotny wzrost częstotliwości uderzeń rzęsek, gdy śluz został usunięty w modelach ALI zarówno osób zdrowych, jak i tych z mukowiscydozą. Środowisko obrazowania musi być ściśle regulowane, ponieważ funkcja rzęsek jest niezwykle podatna na zmiany czynników środowiskowych. Platforma ta ma potencjał do stworzenia na potrzeby badań przesiewowych leków specyficznych dla pacjenta, aby móc identyfikować leki, które modulują funkcję CFTR.