Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten pozwala nam stworzyć złożoną strukturę 3D, która bardzo przypomina rozwijające się ludzkie serce, w prosty, opłacalny sposób, który jest powtarzalny na wszystkich liniach komórkowych. Składa się z jednego protokołu z trzema etapami różnicowania, który daje początek wszystkim typom komórek serca, w tym komorom i sieci naczyniowej. Technika ta pozwala nam modelować szeroki zakres chorób sercowo-naczyniowych u ludzi i badać przesiewowe skuteczne leczenie farmakologiczne.

Dzięki wysokiej przepustowości jego konstrukcji. Metoda ta jest przydatna do badania rozwijającego się ludzkiego serca, a także chorób powszechnie z nim związanych. Jedną z nich są wrodzone wady serca.

Protokół ten wymaga podstawowych umiejętności w zakresie hodowli komórkowych. Zalecamy uważne i delikatne pipetowanie, a także delikatne obchodzenie się z organoidami. Zacznij od stworzenia ciał zarodkowych lub EB na dwa dni przed różnicowaniem.

Myj HPSC za pomocą DBPS przez co najmniej 10 sekund. Następnie odessać DPBS. Dodaj jeden mililitr ACUTA o temperaturze pokojowej i delikatnie postukaj w płytkę około pięć razy na minutę przez trzy do pięciu minut, aby wywołać oderwanie, jednocześnie sprawdzając pod mikroskopem.

Następnie dodaj jeden mililitr pożywki PSC i Thias Avin lub Thias, aby zatrzymać reakcję. Pipetować pożywkę w górę i w dół w studzience dwa do trzech razy, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki i zebrać komórki. Następnie przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do probówki wirówkowej i wiruj przez pięć minut z prędkością 300 razy G. Odessać supernatant i ponownie wydać komórki w jednym mililitrze pożywki PSC i Thias.

Rozcieńczyć komórki w DPBS. Policz komórki za pomocą licznika komórek lub cystometru hemologicznego i rozcieńcz komórki w pożywce PSC z Thiasem do stężenia 100 000 komórek na mililitr. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny rozcieńczonych komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, o bardzo niskim nasadce.

Odwirować płytkę w temperaturze 100 razy G przez trzy minuty i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach ostrożnie usuń 50 mikrolitrów podłoża z każdej studzienki i dodaj 200 rdzeni świeżej pożywki PSC, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, aby uzyskać objętość 250 mikrolitrów na studzienkę. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Usuń 166 mikrolitrów lub dwie trzecie pożywki z jednej strony każdej studzienki i dodaj 166 mikrolitrów RPMI 1640 zawierającego bezinsulinowy suplement B27, sześć mikromolowych 990211 pocieszenia, 0,875 nanograma na mililitr białka morfogenetycznego kości cztery i 1,5 nanograma na mililitr Activin A. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach usuń 166 mikrolitrów pożywki z jednej strony każdej studzienki i dodaj 166 mikrolitrów świeżego RPMI 1640 z bezinsulinowym suplementem B27. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby wywołać specyfikację mezodermy serca w drugim dniu, usuń 166 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 mikrolitrów RPMI 1640, zawierającego bezinsulinowy suplement B27 i trzy mikromolowe Wnt-C59 i kontynuuj inkubację przez 48 godzin. Czwartego dnia usuń 166 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 mikrolitrów świeżego RPMI 1640 z bezinsulinowym suplementem B27, a następnie inkubuj przez kolejne 48 godzin. Szóstego dnia usuń 166 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 mikrolitrów RPMI 1640 z dodatkiem B27.

Do tej i wszystkich kolejnych zmian pożywki należy stosować suplement B27 z insuliną, inkubować przez kolejne 24 godziny. W siódmym dniu hodowla komórkowa jest gotowa do różnicowania pro nasierdziowego. Usuń 166 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 mikrolitrów świeżego RPMI 1640 zawierającego suplement B27 i trzy mikromolowe cheer 99021.

Następnie w inkubacji przez godzinę, po godzinie wyjąć płytkę z inkubatora, usunąć 166 mikrolitrów pożywki z jednej strony każdej studzienki i dodać 166 mikrolitrów świeżego RPMI 1640 zawierającego suplement B27, kontynuować inkubację przez kolejne 48 godzin. Powtarzaj ten proces co 48 godzin, aż do odbioru. Organoidy są gotowe do analiz i eksperymentów w dniu 15 Aby przenieść całe organoidy, odetnij końcówkę pipety P200 w odległości od pięciu do 10 milimetrów od otworu o średnicy około dwóch do trzech milimetrów.

Nacisnąć tłok pipety i włożyć końcówkę pionowo do studzienki z okrągłym dnem za pomocą organoidu. Pobrać około 100 do 200 mikrolitrów pożywki wystarczającej do zebrania organoidów i przeniesienia ich do miejsca docelowego. Zanim różnicowanie EBS pojawi się jako czarne kuliste masy, proces różnicowania rozpoczyna się w dniu zerowym od aktywacji szlaku Wnt i dodania czynnika wzrostu przez dokładnie 24 godziny.

Dalsza edycja Wnt C59 w drugim dniu skutkuje powiększeniem organoidu z około 200 mikrometrów do maksymalnie jednego milimetra. Organoidy ludzkiego serca zaczęły bić już w szóstym dniu, a 100% organoidów wykazało widoczne bicie w 10 dniu. Obrazy organoidów z siódmego dnia w dużym powiększeniu ujawniły, że większość komórek eksprymujących pierwszą rękę pochodziła z kardiomiocytów, a druga ręka była niemiozytyczna z drugiego Heartfield, komórek progenitorowych.

Transkrypty RNA zarówno dla ręki pierwszej, jak i drugiej były wyrażane od trzeciego dnia w danych sekwencjonowania RNA. Markery FHF były silnie eksprymowane w dniach trzecim i jedenastym, podczas gdy marker SF był bardziej ekspresyjny po 13 dniu. Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło obecność różnych linii komórek ludzkiego serca, które tworzą ludzkie serce.

Takich jak tkanka mięśnia sercowego i nasierdzia, komórki wsierdzia, komórki śródbłonka i fibroblasty serca. Markery wyrażające powyższe linie komórkowe obserwowano również w profilach ekspresji genu RNA SAC. Do pomiaru funkcji elektrofizjologicznej organoidów wykorzystano obrazowanie na żywo pojedynczych komórek w całych organoidach.

Intensywność fluorescencji Fluo-4 zmieniała się w czasie ze względu na wejście wapnia z komórki, ujawniające regularne potencjały czynnościowe. Mapy cieplne pokazujące intensywność wapnia w obszarze organoidu o dużym powiększeniu, pokazują zwiększoną intensywność z powodu stanów przejściowych wapnia i pojedynczych komórek. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że EB i kolejne organoidy nie są przyczepione do dolnej części płytki, a my będziemy poruszać się z usunięciem oprócz pożywek wymagających uważnej zmiany pożywki.

Organoidy mogą być hodowane przez dłuższy czas, wprowadzane do technik dojrzewania, a nawet wystawione na bodźce zewnętrzne, takie jak kondycjonowanie mechaniczne lub elektryczne, a nawet stresory, takie jak toksyny. Technika ta umożliwia dostęp do etapów rozwoju ludzkiego serca płodu, które są w inny sposób niedostępne w badaniach, torując drogę do nowego wglądu w rozwój serca i etiologię choroby.