Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Terapia komórkowa ma ogromny potencjał w zakresie regeneracji mózgu. Protokół, który tutaj demonstrujemy, jest cenny, ponieważ umożliwia podłużne obrazowanie in vivo przeszczepionych komórek w mózgu myszy. Protokół ten jest szczególnie przydatny do uzyskania wglądu w migrację i przeżycie przeszczepu u tego samego zwierzęcia w pewnym okresie czasu.

Procedura ta może być zastosowana do dowolnej linii komórkowej z ekspresją lucyferazy przeszczepionej do mózgu myszy. Jednak siła sygnału może się różnić w zależności od głębokości przeszczepu lub ekspresji lucyferazy w danej linii komórkowej. Procedurę zademonstruje Rebecca Weber, znakomita doktorantka w naszym laboratorium.

Zacznij od pobrania fiolki z komórkami z pamięci w temperaturze minus 150 stopni Celsjusza i przenieś ją do laboratorium. Szybko przenieś fiolkę do łaźni wodnej zahartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut, aż kryształki lodu się rozpuszczą. Następnie przenieś fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odpipetuj całą zawartość do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Dodać dziewięć mililitrów sterylnego PBS i wirować przy 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez aspirację bez naruszania osadu i policzyć komórki przed ostatnim wirowaniem za pomocą automatycznego licznika komórek. Przetransportuj zwierzę z komory indukcyjnej do ramy stereotaktycznej, utrzymując znieczulenie za pomocą maski na twarz.

Zastosuj lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Ogol skórę głowy myszy elektryczną maszynką do golenia i zdezynfekuj skórę 5% roztworem betadyny za pomocą wacików. Zabezpiecz głowę myszy i włóż nauszniki do zewnętrznego przewodu moczowego.

Wywierć otwór o średnicy od dwóch do trzech milimetrów przez czaszkę za pomocą chirurgicznego wiertła dentystycznego. Ponownie zawiesić przygotowane komórki w probówce i pobrać dwa mikrolitry zawiesiny komórek do strzykawki. Umieść strzykawkę nad miejscem docelowym i powoli przesuń igłę na powierzchnię opony twardej i oblicz współrzędne głębokości.

Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania Living Image i wybierz identyfikator użytkownika z listy rozwijanej. Następnie kliknij przycisk Zainicjuj w wyświetlonym Panelu sterowania. W oprogramowaniu Living Image zaznacz pola Luminescent (Luminescencyjny) i Photograph (Zdjęcie) w Panelu sterowania (Control Panel) i wybierz opcję Auto exposure (Automatyczna ekspozycja).

Wybierz pole widzenia. Wprowadź wysokość obiektu i wybierz opcję Użyj ostrości na wysokości obiektu. Ręcznie ustaw parametry filtrowania, w tym duże binningowanie, F/Stop, zablokowany filtr wzbudzenia i otwarty filtr emisji.

Wstrzyknij lucyferynę dootrzewnowo, a po pięciu minutach znieczul zwierzęta ciągłym dopływem izofluranu. Ogol uspokojone zwierzęta w okolicy głowy za pomocą konwencjonalnej golarki do włosów. Umieść zwierzę w komorze obrazowania i rozpocznij obrazowanie 15 minut po wstrzyknięciu lucyferyny, klikając przycisk Acquire w Panelu sterowania.

Przed przeszczepieniem nerwowych komórek progenitorowych do mózgu myszy, komórki zostały przetestowane pod kątem udanej transdukcji przez ekspresję EGFP in vitro. Udany przeszczep został potwierdzony obecnością sygnału lucyferazy świetlika czerwonego. Po przeszczepieniu od 6 000 do 180 000 komórek w prawej korze czuciowo-ruchowej myszy, sygnał bioluminescencyjny był wykrywalny we wszystkich stężeniach.

Komórki przeżyły co najmniej pięć tygodni po przeszczepie. Przeszczepione komórki z powodzeniem wykryto ex vivo w późniejszej analizie histologicznej za pomocą reportera EGFP i barwienia immunologicznego jądrami antyludzkimi. Bardzo ważne jest, aby dokładnie obliczyć współrzędne iniekcji, aby uniknąć pominięcia miejsca docelowego.

A także pozostawić strzykawkę na miejscu przez co najmniej pięć minut po przeszczepie, aby uniknąć refluksu. Po obrazowaniu bioluminescencyjnym in vivo tkankę mózgową można przygotować do analizy histologicznej lub wyizolować przeszczepione komórki za pomocą FACS i scharakteryzować za pomocą różnych lub mieszanych technologii. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta zapewnia ilościowe i ciągłe śledzenie przeszczepionych komórek w mózgu i może być stosowana w ogromnej liczbie chorób neurologicznych, w tym udarach i urazach mózgu.