Name: Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu ludzkich komórek progenitorowych nerwowych do mózgu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji i fluorescencji GFP. Technika umożliwia długoterminowe śledzenie migracji i przeżycia komórek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy RR i CT dziękują za wsparcie ze strony Fundacji Mäxi i Centrum Kompetencji 3R.

<ol><li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Nogo-A+antibodies+prevent+vascular+leakage+and+act+as+pro-angiogenic+factors+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20040(2019).</li>
<li>Weber, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+blood+brain+barrier+disruption+in+the+photothrombotic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model.</a> Frontiers in Physiology. 11, 58226(2020).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3K3A-APC+stimulates+post-ischemic+neuronal+repair+by+human+neural+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).</li>
<li>Llorente, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+glial+enriched+progenitors+repair+functional+deficits+due+to+white+matter+stroke+and+vascular+dementia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents.</a> Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).</li>
<li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+brain+cells+for+stroke+patients+using+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells.</a> Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+current+treatment+strategies+and+future+endeavors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li>
<li>Schweitzer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+iPSC-derived+dopamine+progenitor+cells+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).</li>
<li>Muir, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+implantation+of+human+neural+stem+cells+and+motor+recovery+after+stroke%3A+multicentre+prospective+single-arm+study+%28PISCES-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery+%26+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).</li>
<li>Kawabori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+chronic+TBI%3A+interim+analysis+of+the+randomized+controlled+STEMTRA+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial.</a> Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+stem+cell+mimics+to+enhance+stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery.</a> Biomaterials. 178, 63-72 (2018).</li>
<li>Sancho-Martinez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+iPSC-based+models+for+the+study+and+targeting+of+glioma+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+progenitor+cells+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%2C+compact%3A+The+coronal+plates+and+diagrams%22">Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Baker, S., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+local+insult+of+okadaic+acid+in+wild-type+mice+induces+tau+phosphorylation+and+protein+aggregation+in+anatomically+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 32(2016).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+myelination+events+in+a+myelin+basic+protein+promoter-driven+luciferase+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model.</a> ASN Neuro. 10, (2018).</li>
<li>Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+bioluminescence+neuroimaging%3A+an+optimized+protocol+for+brain+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies.</a> PLoS One. 8 (2), 55662(2013).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-released+alarmins+and+stress+response+synergize+in+accelerating+atherosclerosis+progression+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke.</a> Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).</li>
<li>Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+promotes+systemic+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).</li>
<li>Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-+and+antiangiogenic+therapies%3A+current+status+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications.</a> FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).</li>
<li>Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refueling+the+ischemic+CNS%3A+guidance+molecules+for+vascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair.</a> Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642(2018).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+degeneration+causes+white+matter+dysfunction+in+the+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system.</a> Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOE4+leads+to+blood-brain+barrier+dysfunction+predicting+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline.</a> Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stroke+therapeutics%3A+unraveling+stroke+pathophysiology+and+its+impact+on+clinical+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Weber, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+based+behavioral+profiling+of+rodent+stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Nair, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+for+humanised+mouse+models+in+precision+medicine+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease.</a> Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).</li>
<li>Kirabali, T., Rust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS-derived+pericytes+for+neurovascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration.</a> European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601(2021).</li>
<li>Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+for+brain+repair%3A+More+than+just+a+neuron%27s+sidekick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick.</a> Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999(2021).</li>
<li>Johansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tet-on+system+to+avoid+transgene+down-regulation+in+ex+vivo+gene+transfer+to+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS.</a> Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).</li>
<li>Vogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+graft+size+and+not+the+innate+immune+response+limit+survival+of+engrafted+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania potencjalnego konfliktu interesów.

Regeneracja uszkodzonego mózgu, aby umożliwić powrót do sprawności, pozostaje niespełnionym wyzwaniem. Rozwinęło się wiele innowacyjnych podejść przedklinicznych ukierunkowanych na przykład modulację immunologiczną19,20, angiogenezę 1,21,22,23, integralność bariery krew-mózg 2,3,24,25 i wymianę komórek 5,26. Szczególnie w ostatnich latach terapie komórkowe stały się obiecującą strategią leczenia mózgu ze względu na znaczne postępy w technologii komórek macierzystych i skuteczne protokoły różnicowania15,28. Artykuł ten dostarcza cennego protokołu do przeszczepiania i śledzenia komórek nerwowych w mózgu myszy. Metoda ma zastosowanie do wszystkich transdukowalnych linii komórkowych do zastosowań in vivo w mózgu myszy.
Prezentowany układ wykorzystuje przeszczepy pochodzenia ludzkiego u myszy. Przeszczepy te nie są opłacalne w dłuższej perspektywie u immunokompetentnych myszy typu dzikiego ze względu na immunogenność. W związku z tym do pokonania tego ograniczenia wykorzystano myszy z NSG z niedoborem odporności. Alternatywnie, stosowanie przeszczepów myszy może być preferowane w celu przezwyciężenia aspektów immunogennych. Jeśli wymagany jest przeszczep komórek ludzkich, humanizowane modele myszy stanowią pojawiającą się alternatywę zmniejszającą prawdopodobieństwo odrzucenia przeszczepu29.
Do wizualizacji przeszczepów wykorzystano komercyjny wektor wirusowy z podwójnym reporterem, składający się z lucyferazy świetlika i eGFP pod promotorem EF1α. Ten promotor został wybrany w celu osiągnięcia wysokiej intensywności sygnału15. Jednak oprócz NPC wykazano, że inne typy komórek promują funkcjonowanie mózgu po urazie, w tym perycyty30 i astrocyty31; W związku z tym, w zależności od użytej linii komórkowej, inne promotory mogą być bardziej odpowiednie do osiągnięcia wysokich poziomów ekspresji. Ponadto stosowanie promotorów transgenów, takich jak CMV, może prowadzić do obniżenia regulacji, zwłaszcza w długoterminowych eksperymentach32. Skuteczność transdukcji wektora lentiwirusowego silnie zależy od użytej linii komórkowej i może się różnić w zależności od pojedynczych eksperymentów. W związku z tym skuteczność transdukcji musi być oceniona przed rozpoczęciem doświadczeń in vivo i w celu skorygowania różnic w skuteczności transdukcji między doświadczeniami. Obszar mózgu przeszczepu również wpływa na siłę sygnału. Chociaż osiągnięto granicę wykrywalności wynoszącą <6 000 komórek w przypadku przeszczepów kory mózgowej, może to wymagać większej liczby komórek do wykrycia sygnału w głębszych obszarach mózgu, na przykład prążkowiu lub hipokampie.
Objętości przeszczepu w mózgu myszy są ograniczone do 1-2 μl. Dlatego ważne jest, aby zidentyfikować odpowiedni numer komórki do eksperymentów. Wcześniej zaobserwowano, że wzrost liczby komórek prowadzi do zmniejszenia wskaźnika przeżycia, najprawdopodobniej z powodu ograniczonej dostępności składników odżywczych i tlenu w regionie przeszczepu33. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo zapewnia stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną w porównaniu z innymi metodami obrazowania in vivo , takimi jak MRI lub CT. W związku z tym krótkie drogi migracji przeszczepionych komórek można wiarygodnie ocenić dopiero w późniejszej analizie post-hoc .
Bezwzględna siła sygnału bioluminescencji jest na ogół proporcjonalna do liczby przeszczepionych komórek. Jednak siła sygnału może być zmniejszona, jeśli przeszczepy są przeszczepiane w głębsze struktury mózgu lub jeśli siła sygnału wykracza poza liniowe spektrum wykrywania systemu obrazowania in vivo . Obecnie opracowywane są nowe substraty, aby zapewnić skuteczniejszą penetrację przez barierę krew-mózg niż D-lucyferyna, w tym cycluc1. Substraty te mogą w przyszłości jeszcze bardziej poprawić granicę wykrywalności przeszczepionych komórek18. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na prostą, minimalnie inwazyjną procedurę przeszczepu i obserwacji przeszczepów w mózgu myszy.

Mózg ssaków ma ograniczone zdolności regeneracyjne po urazie lub chorobie, co wymaga innowacyjnych strategii wspomagających naprawę tkanek i funkcji. Strategie przedkliniczne koncentrują się na różnych aspektach regeneracji mózgu, w tym neuroprotekcji, neurogenezie, angiogenezie1,2, naprawa bariery krew-mózg3,4, lub terapia komórkowa5,6. Terapia komórkowa ma tę zaletę, że jest w stanie promować wiele z tych procesów pronaprawczych jednocześnie. W eksperymentach z przeszczepianiem komórek naprawa tkanek następowała poprzez (1) bezpośrednią wymianę komórek i (2) produkcję cytokin prowadzącą do angiogenezy i neurogenezy7. Ostatnie postępy w technologii komórek macierzystych jeszcze bardziej ułatwiły rozwój skalowalnych, dobrze scharakteryzowanych źródeł komórek nerwowych, które są obecnie w przygotowaniu do badań klinicznych (recenzowane w 7,8,9). Chociaż terapie komórkowe osiągnęły stadium kliniczne w przypadku kilku chorób neurologicznych (np. choroby Parkinsona10, stroke11 i uraz rdzenia kręgowego12), ich skuteczność była zmienna i potrzebne są dalsze badania przedkliniczne, aby zrozumieć mechanizmy interakcji przeszczep-gospodarz.
Jednym z głównych ograniczeń wielu badań przedklinicznych jest ciągłe śledzenie przeszczepionych komórek wewnątrz gospodarza. Często wykonywane są tylko pomiary punktu końcowego, z pominięciem dynamicznych procesów migracji i przetrwania w host6,13. Ograniczenia te skutkują słabą charakterystyką przeszczepionych komórek i wymagają dużej liczby zwierząt, aby zrozumieć zmiany podłużne. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w tym badaniu transdukujemy indukowane pluripotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z nerwowych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą dostępnego na rynku wektora lentiwirusowego z podwójnym reporterem składającego się z lucyferazy świetlika czerwonego i wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (rFluc-eGFP). Komórki te są przeszczepiane za pomocą stereotaktycznego wstrzyknięcia intrapażowego, do mózgu myszy i są śledzone podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo przez 5 tygodni. Po pobraniu tkanki mózgowej przeszczepione komórki wykazujące ekspresję GFP są identyfikowane i dalej charakteryzowane w histologicznych skrawkach mózgu. Metodę tę można płynnie dostosować do alternatywnych źródeł transdukcyjnych komórek i dróg przeszczepu do zastosowań in vivo w mózgu gryzoni. Ogólnie rzecz biorąc, procedura jest cenna dla uzyskania podłużnych informacji na temat przeżycia i migracji przeszczepu w mózgu myszy oraz ułatwia późniejszą charakterystykę histologiczną.

<table><tbody><tr><td>Transduction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (wirus Lenti-Labeler)</td><td>Systembio</td><td>LL410VA-1</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td>Eppendorf; 1,5 ml probówki Sigma Aldrich Z606340 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon; 15 ml</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe mikroskopu Produkt</td><td></td><td></td><td>do wyboru</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td> mikroskopowe <td>Produkt do wyboru</td></tr><tr><td>Waciki</td><td></td><td></td> bawełniane <td>Sterlie Produkt do wyboru</td></tr><tr><td>Szewy; 5/0 jedwab z zakrzywioną igłą</td><td>B. Braun</td><td>G0762482</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy; 0,22 i mikro; m</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka; 1 ml i 0,5 ml</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej (24-dołkowa)</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek (Vi-CELL XR)</td><td>Beckmann Coulter Life Science</td><td>383721</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki precyzyjnej11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, drobne</td><td>narzędzia do nauki</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka</td><td></td><td></td> grzewcza <td>Produkt do wyboru</td></tr><tr><td>Zestaw szybkobieżnych bezszczotkowych mikrosilników</td><td>Foredom</td><td>K.1060-22.</td><td></td></tr><tr><td>Idealny zestaw mikro wierteł z 5 specyficznymi</td><td>dla punktów</td> komórkowych systemem obrazowania <td>60-1000</td><td></td></tr><tr><td>In-Vivo (pakiet oprogramowania IVIS Lumina III z pakietem oprogramowania Living Imaging 4.2)</td><td>Parownik izofluranowy Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Provet AG</td><td>330724</td><td></td></tr><tr><td>System pomp strzykawkowych do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa; Seria 700; Objętość: 5-10 i mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>HM430</td><td></td></tr><tr><td>NanoFill-33 G-Needle (wyjmowany i wielokrotnego użytku)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna i rurka</td><td>Masterflex</td><td>HV-77120-42</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do małych bonn, proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe małe, proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Merck</td><td>Z243213-2EA</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna dla gryzoni; zmotoryzowane</td><td>World Precision Instruments</td><td>99401</td><td></td></tr><tr><td>Farmaceutyki i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Proteolityczny i kolagenolilityczny; odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko jądrom ludzkim, klon 235-1, koniugat biotyny</td><td>Merck</td><td>MAB1281B</td><td></td></tr><tr><td>B27 &ndash; Suplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (11 mg Jod als Povidon-Iod pro 1 ml L&ouml; sung)</td><td>Mundipharma Medical Company</td><td>Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący (3% surowica osła; 0,1% Triton-X-100 w PBS)</td><td></td><td></td><td>Produkt do wyboru; może być domowym</td></tr><tr><td>CHIR99021 (10 mM &ndash; 2,500x)</td><td>StemMACS</td><td>130-103-926</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> <td>krioprotektantuProdukt z wyboru; może to być domowy</td></tr><tr><td>roztwór DAPI (1 mg / ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferin Sól potasowa</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko myszy, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td></td><td></td> osła<td>Produkt do wyboru</td></tr><tr><td>Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg)</td><td>Streuli Pharma AG</td><<td>em>Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Etanol; 70%</td><td></td><td></td><td>Produkt do wyboru</td></tr><tr><td>FGF Podstawowe rekombinowane białko ludzkie, wolne od pochodzenia zwierzęcego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHG6015</tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>hLif (10 &mikro; g/ml &ndash; 1,000x)</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-05-25UG</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluoretylo-difluorometylo&shy; eter) 99,9%)</td><td>Provet AG</td><<td>em>Wszystkie leki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-L521 (L-521)</td><td>Biolaminina LN</td><td>LN521</td><td></td></tr><tr><td>Maść lidokainowa (Lidocaina: 25 mg, Prilocain: 25 mg)</td><td>Aspen Pharma Schweiz GmbH</td><td>Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Montaż Średni</td><td></td><td></td><td>Produkt do wyboru; może być domowej roboty</td></tr><tr><td>N2- Suplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 75202-001</td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td> <td>neuropodstawny</td><td>&nbsp; 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Smar oftalmiczny (Retinol palmitat: 15 000 UI)</td><td>Bausch & Lomb Swiss AG</td><<td>em>Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną w Zurychu, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> paraformaldehydu <td>Produkt do wyboru</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Może być również domowej roboty</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-ornityny (pLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Karprofen 50 mg)</td><td>Zoetis Schweiz GmbH</td><td>Wszystkie produkty farmaceutyczne zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan Ringera</td><td>B. Braun</td><td>3570500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Ringera</td><td>B. Braun</td><td>3570030</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9% NaCl)</td><td>B. Braun</td><td>3570160</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 (10 mM &ndash; 3,333.3x)</td><td>StemMACS</td><td>130-106-543</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy (Histoacryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050060</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Terapia komórkowa od dawna jest nowym paradygmatem leczenia w neurobiologii eksperymentalnej. Jednak badania nad przeszczepianiem komórek często opierają się na pomiarach punktu końcowego i dlatego mogą oceniać podłużne zmiany migracji komórek i przeżycia tylko w ograniczonym zakresie. Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny, minimalnie inwazyjny protokół przeszczepiania i podłużnego śledzenia nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w mózgu dorosłej myszy. Przed przeszczepem komórki są transdukowane wektorem lentiwirusowym składającym się z bioluminescencyjnego (świetlik-lucyferaza) i fluorescencyjnego (zielone białko fluorescencyjne [GFP]) reportera. NPC są przeszczepiane do prawej półkuli kory mózgowej za pomocą stereotaktycznych zastrzyków w korę sensomotoryczną. Po przeszczepie przeszczepione komórki wykrywano przez nienaruszoną czaszkę przez okres do pięciu tygodni (w dniach 0, 3, 14, 21, 35) z limitem rozdzielczości 6000 komórek przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Następnie przeszczepione komórki są identyfikowane w histologicznych skrawkach mózgu i dalej charakteryzowane za pomocą immunofluorescencji. W ten sposób protokół ten stanowi cenne narzędzie do przeszczepiania, śledzenia, ilościowego określania i charakteryzowania komórek w mózgu myszy.

Naszym celem jest długotrwałe śledzenie przeszczepionych neuralnych komórek progenitorowych w mózgu myszy przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz identyfikacja przeszczepionych komórek w późniejszej analizie histologicznej (Rysunek 1A). W związku z tym neuralne komórki progenitorowe są transdukowane wektorem lentiwirusem składającym się z EF1α-rFluc-eGFP. Przed przeszczepieniem sprawdzono sukces transdukcji komórek poprzez ekspresję eGFP in vitro (Rysunek 1B). Pomyślnie transdukowane komórki zostały przeszczepione stereotaktycznie do mózgu myszy we wskazanych współrzędnych (np. do kory czuciowo-ruchowej). Po przeszczepieniu myszom podano systemowo D-lucyferynę, która jest substratem dla rFluc, a następnie zmierzono intensywność sygnału z przeszczepionych komórek, aby potwierdzić powodzenie zabiegu (Rysunek 1C).
Aby ocenić granicę wykrywalności obrazowania bioluminescencyjnego in vivo, do prawej kory czuciowo-ruchowej myszy przeszczepiono liczbę komórek w zakresie od 6 000 do 180 000 (Rycyna 2A). Bezpośrednio po transplantacji wykryto &lt;6 000 komórek oraz sygnał bioluminescencyjny proporcjonalny do liczby przeszczepionych komórek (Rycyna 2B). Ponieważ ludzkie źródła komórek są immunogenne dla myszy immunokompetentnych, w celu obserwacji długoterminowego przeżycia przeszczepów komórkowych wykorzystano myszy immunodeficyjne NOD scid gamma (NSG). Po transplantacji komórek potwierdzono długoterminowe przeżycie oraz wykrywalność sygnału bioluminescencyjnego przez okres do 5 tygodni (Rycyna 2C,D). Przeszczepione komórki zostały pomyślnie wykryte ex vivo w późniejszej analizie histologicznej za pomocą reportera eGFP oraz immunobarwienia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko ludzkim jądrom oraz ludzkim mitochondriom (Rycyna 2E).
<img alt="Schemat transdukcji lentiwirusowej; transplantacja stereotaktyczna, NPC rFluc-eGFP, obrazowanie in vivo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Transplantacja komórek progenitorowych neuronów. (A) Schematyczna analiza generowania i transplantacji NPC rFluc-eGFP. (B) Reprezentatywne zdjęcie immunofluorescencyjne transdukowanych NPC (reporter GFP, zielony) z przeciwbarwieniem DAPI (niebieski); paski skali = 5 µm. (C) Detekcja sygnału bioluminescencji in vivo w transplantowanych komórkach; skala kolorystyczna = niebieski (0, min, brak sygnału), czerwony (4 flux, p/s × 105, sygnał maksymalny) Skróty: NPCs = komórki progenitorowe neuronów; GFP = zielone białko fluorescencyjne; rFluc-eGFP = czerwona lucyferaza świetlika i ulepszone zielone białko fluorescencyjne; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; p/s = fotony/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Badanie transplantacji komórek mysich; obrazowanie bioluminescencyjne, liczba komórek, GFP, HuNu, wykres strumienia, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przebieg czasowy przeżycia przeszczepionych komórek. (A) Schematyczny widok liczby komórek do transplantacji. (B) Granica detekcji przeszczepionych komórek 1 h po transplantacji. (C, D) Przebieg czasowy transplantacji (180 000 komórek) do 35 dni u myszy NSG; pasek kolorów = niebieski (0, min, brak sygnału), czerwony (4 flux, p/s × 105, maksymalny sygnał). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). (E) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów histologicznych i przeszczepionych komórek 5 tygodni po transplantacji. Pasek skali = 10 µm. Skróty: D = dzień po transplantacji; NSG = immunodeficient NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; GFP = zielone białko fluorescencyjne; HuNu = przeciwciało przeciwjądrowe ludzkie, klon 235-1; p/s = fotony/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

Terapia komórkowa ma ogromny potencjał w zakresie regeneracji mózgu. Protokół, który tutaj demonstrujemy, jest cenny, ponieważ umożliwia podłużne obrazowanie in vivo przeszczepionych komórek w mózgu myszy. Protokół ten jest szczególnie przydatny do uzyskania wglądu w migrację i przeżycie przeszczepu u tego samego zwierzęcia w pewnym okresie czasu.Procedura ta może być zastosowana do dowolnej linii komórkowej z ekspresją lucyferazy przeszczepionej do mózgu myszy. Jednak siła sygnału może się różnić w zależności od głębokości przeszczepu lub ekspresji lucyferazy w danej linii komórkowej. Procedurę zademonstruje Rebecca Weber, znakomita doktorantka w naszym laboratorium.Zacznij od pobrania fiolki z komórkami z pamięci w temperaturze minus 150 stopni Celsjusza i przenieś ją do laboratorium. Szybko przenieś fiolkę do łaźni wodnej zahartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut, aż kryształki lodu się rozpuszczą. Następnie przenieś fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odpipetuj całą zawartość do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Dodać dziewięć mililitrów sterylnego PBS i wirować przy 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez aspirację bez naruszania osadu i policzyć komórki przed ostatnim wirowaniem za pomocą automatycznego licznika komórek. Przetransportuj zwierzę z komory indukcyjnej do ramy stereotaktycznej, utrzymując znieczulenie za pomocą maski na twarz.Zastosuj lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Ogol skórę głowy myszy elektryczną maszynką do golenia i zdezynfekuj skórę 5% roztworem betadyny za pomocą wacików. Zabezpiecz głowę myszy i włóż nauszniki do zewnętrznego przewodu moczowego.Wywierć otwór o średnicy od dwóch do trzech milimetrów przez czaszkę za pomocą chirurgicznego wiertła dentystycznego. Ponownie zawiesić przygotowane komórki w probówce i pobrać dwa mikrolitry zawiesiny komórek do strzykawki. Umieść strzykawkę nad miejscem docelowym i powoli przesuń igłę na powierzchnię opony twardej i oblicz współrzędne głębokości.Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania Living Image i wybierz identyfikator użytkownika z listy rozwijanej. Następnie kliknij przycisk Zainicjuj w wyświetlonym Panelu sterowania. W oprogramowaniu Living Image zaznacz pola Luminescent (Luminescencyjny) i Photograph (Zdjęcie) w Panelu sterowania (Control Panel) i wybierz opcję Auto exposure (Automatyczna ekspozycja).Wybierz pole widzenia. Wprowadź wysokość obiektu i wybierz opcję Użyj ostrości na wysokości obiektu. Ręcznie ustaw parametry filtrowania, w tym duże binningowanie, F/Stop, zablokowany filtr wzbudzenia i otwarty filtr emisji.Wstrzyknij lucyferynę dootrzewnowo, a po pięciu minutach znieczul zwierzęta ciągłym dopływem izofluranu. Ogol uspokojone zwierzęta w okolicy głowy za pomocą konwencjonalnej golarki do włosów. Umieść zwierzę w komorze obrazowania i rozpocznij obrazowanie 15 minut po wstrzyknięciu lucyferyny, klikając przycisk Acquire w Panelu sterowania.Przed przeszczepieniem nerwowych komórek progenitorowych do mózgu myszy, komórki zostały przetestowane pod kątem udanej transdukcji przez ekspresję EGFP in vitro. Udany przeszczep został potwierdzony obecnością sygnału lucyferazy świetlika czerwonego. Po przeszczepieniu od 6 000 do 180 000 komórek w prawej korze czuciowo-ruchowej myszy, sygnał bioluminescencyjny był wykrywalny we wszystkich stężeniach.Komórki przeżyły co najmniej pięć tygodni po przeszczepie. Przeszczepione komórki z powodzeniem wykryto ex vivo w późniejszej analizie histologicznej za pomocą reportera EGFP i barwienia immunologicznego jądrami antyludzkimi. Bardzo ważne jest, aby dokładnie obliczyć współrzędne iniekcji, aby uniknąć pominięcia miejsca docelowego.A także pozostawić strzykawkę na miejscu przez co najmniej pięć minut po przeszczepie, aby uniknąć refluksu. Po obrazowaniu bioluminescencyjnym in vivo tkankę mózgową można przygotować do analizy histologicznej lub wyizolować przeszczepione komórki za pomocą FACS i scharakteryzować za pomocą różnych lub mieszanych technologii. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta zapewnia ilościowe i ciągłe śledzenie przeszczepionych komórek w mózgu i może być stosowana w ogromnej liczbie chorób neurologicznych, w tym udarach i urazach mózgu.

intracerebral-transplantation-vivo-bioluminescence-tracking-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Źródło: Weber, R. Z., et al. Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje stereotaktyczny przeszczep genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (NPC) do mózgu myszy. Naukowcy wstrzykują NPC eksprymujące lucyferazy i białka fluorescencyjne, umożliwiając obrazowanie bioluminescencyjne in vivo i pośmiertną mikroskopię fluorescencyjną w celu zbadania przeżycia,...

Przeszczep ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Źródło: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę obrazowania bioluminescencyjnego in vivo genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych wstrzykniętych do mózgu myszy. Proces obejmuje wstrzyknięcie lucyferyny, przygotowanie obrazowania i wykrywanie sygnałów bioluminescencyjnych z przeszczepionych komórek w miejscu...

Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Tutaj opisujemy protokół przeszczepu i śledzenia oznakowanych komórek nerwowych do ludzkich organoidów mózgowych.

Ludzki model organoidowy przeszczepu komórek nerwowych

Poznaj metodę przeszczepu ludzkich komórek progenitorowych nerwowych do mózgu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji i fluorescencji GFP. Technika umożliwia długoterminowe śledzenie migracji i przeżycia komórek in vivo.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów