Test mikrowzorcowy do pomiaru chiralności komórek

Test chiralności komórek łykowych z mikrowzorcami jest potężnym narzędziem do badania wielokomórkowej morfogenezy chiralnej w rozwoju choroby. Jest to również ważne dla badań nad komórkami. Ten system makrowzorców jest łatwy w produkcji i obsłudze, jest w stanie generować wysoce wiarygodne i powtarzalne wyniki, a także jest kompatybilny z automatycznym przetwarzaniem o wysokiej przepustowości dla dużych rozmiarów próbek.

Zacznij od pocięcia szkiełka pokrytego tytanowym złotem na małe kwadratowe kawałki o wymiarach około 12 na 12 milimetrów. Za pomocą noża do szkła przesuń po powierzchni, aby pozostawić wgniecioną ścieżkę, a następnie przytrzymaj szkiełko po obu stronach i zegnij w miejscu wgniecenia, aby rozbić się na małe ćwiartki. Aby wyczyścić szkiełko, zanurz je złotą stroną do góry w 100% etanolu zawartym na szalce Petriego na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 10 minut.

Po zassaniu etanolu osuszyć szkiełko, przedmuchując je strumieniem azotu. Wyczyść stempel z polidimetylosiloksanu lub PDMS wodą z mydłem przed wysuszeniem stempla gazowym azotem. Rozpuść 5,74 miligrama oktadekanetiolu lub C18 w 10 mililitrach 100% etanolu, aby uzyskać dwumilimolowy roztwór C18, a następnie wyczyść znaczki PDMS 100% etanolem.

Namocz stempel PDMS powierzchnią wzoru skierowaną w dół w roztworze C18 przez 10 sekund, a następnie delikatnie osusz go azotem przez 60 sekund. Po wyschnięciu połóż stempel ekranem do dołu na złotym szkiełku na 60 sekund przed usunięciem. Aby zapewnić prawidłowe stemplowanie, delikatnie postukaj pęsetą w stempel, aby prawidłowo przenieść wzory.

Następnie przygotuj komory wilgotnościowe, pipetując jeden mililitr 70% etanolu do odwróconej pokrywki szalki Petriego. I za pomocą pęsety połóż kawałek parafilmu, aby przykryć powierzchnię, upewniając się, że nie pozostały żadne pęcherzyki. W razie potrzeby usuń nadmiar etanolu.

Dodaj 40 mikrolitrów kropelek roztworu EG3 na każdą ćwiartkę szkła na parafilm w komorze wilgotnościowej, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między kropelkami, aby uwzględnić odstępy między złotymi szkiełkami. Użyj pęsety, aby umieścić wydrukowane w kolorze C18 złote szkiełko skierowane w dół na kropli, upewniając się, że pod szkiełkiem nie pozostały żadne bąbelki. Delikatnie dociśnij szkiełka do siebie, nie podnosząc ich, aby zminimalizować parowanie.

Po szczelnym zamknięciu szalki Petriego parafilmem, pozostaw ją w temperaturze pokojowej na co najmniej trzy godziny. W komorze bezpieczeństwa biologicznego namocz i opłucz złote szkiełko trzykrotnie skierowane do góry w 70% etanolu, aby usunąć EG3, a następnie pozostaw w etanolu na 10 minut w celu sterylizacji. Po zaessaniu etanolu dodać sterylny PBS.

Przygotuj kolejną komorę wilgotnościową z PBS zamiast etanolu, jak pokazano. Następnie dodaj 50 mikrolitrów kropelek roztworu fibronektyny na każdą ćwiartkę szkiełka na parafilm, pozostawiając trochę miejsca między kropelkami. Następnie umieścić szkiełko skierowane w dół na kropli, jak pokazano wcześniej, i pozostawić szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut.

Po trzykrotnym wypłukaniu szkiełka pokrytego złotem, umieść szkiełko skierowane do góry w PBS. Przed wysianiem komórek podgrzej pożywkę i trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby uzyskać lepsze przyleganie komórek, namocz szkiełko wzorcowe w 12-dołkowej płytce zawierającej pożywkę hodowlaną i podgrzej ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.

Gdy komórki zostaną wytrypsynizowane, zneutralizuj komórki za pomocą pożywki zawierającej FBS, osadzaj komórki w temperaturze 100 razy G przez trzy minuty, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w świeżej pożywce. Policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórek, aby osiągnąć stężenie 200 000 komórek na mililitr. Dodaj 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdej studzienki zawierającej jedno złote szkiełko.

Delikatnie potrząśnij płytką kilka razy, aby uzyskać równomierny wysiew komórek, a następnie inkubuj przez 15 minut w celu przyłączenia komórek. Po 15 minutach sprawdź przyczepienie komórek pod mikroskopem i, jeśli to konieczne, inkubuj jeszcze przez jakiś czas. Po przyłączeniu komórek odessać pożywkę zawierającą nieprzyłączone komórki z każdej studzienki i dodać jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej.

Hoduj komórki w inkubatorze przez 24 godziny i sprawdzaj konfluencję, aby określić, czy utworzyła się chiralności. Po osiągnięciu wymaganej konfluencji utrwal komórki, usuwając pożywkę hodowlaną. Po jednokrotnym spłukaniu PBS dodać 4% roztwór paraformaldehydu do szkiełka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie ponownie spłukać PBS trzy razy.

Aby uzyskać obrazy, użyj mikroskopu z kontrastem fazowym z funkcją kamery i uchwyć każdy pierścień na szkiełku w wysokiej rozdzielczości. Aby scharakteryzować chiralności, pobierz pliki kodu MATLAB, dodaj folder kodu i podfoldery do ścieżki MATLAB i otwórz ROI_selection. m pliku.

W wierszu czwartym zmień katalog na żądany folder danych. Zmień rozmiar obrazu w wierszu 14, tak aby pierwsze dwie cyfry reprezentowały rozmiar wewnętrznego okręgu pierścienia, a pozostałe dwie reprezentowały zewnętrzny. Aby określić obszar zainteresowania lub ROI na obrazach kontrastu fazowego, wykonaj kod MATLAB ROI_selection.

m, klikając przycisk Uruchom. Ręcznie przeciągnij kwadrat zaznaczenia, aby pasował do pierścienia, a następnie kliknij dwukrotnie obraz, aby potwierdzić wybór. Po wybraniu ROI ze wszystkich obrazów w folderze, zostanie wygenerowany plik mat do przechowywania informacji o ROI dla każdego obrazu.

Następnie otwórz plik analysis_batch. m i zmień katalog folderu, jak pokazano wcześniej. Kliknij przycisk Uruchom, aby wykonać kod analysis_batch.

m w celu określenia chiralności wielu komórkowych wzorców pierścieni. A datatoexcel. Zostanie wygenerowany plik txt zawierający statystyki kołowe dla każdego pierścienia, a także liczby pierścieni niechiralnych i przeciwnych do ruchu wskazówek zegara.

Obecne wyniki wskazują na użyteczność eksperymentalnie opracowanego testu chiralności wzoru pierścieniowego, a także wrażliwość tego testu na zmiany w cytoszkielecie. W niniejszym badaniu stwierdzono, że poprzez zakłócenie polimeryzacji aktyny za pomocą 50 nanomolowych latrunkuliny A, mysie komórki mioblastu C2C12 wykazywały zmianę odchylenia chiralnego w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara lub CCW na CW.In zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub dodatkowo, ludzkie komórki śródbłonka naczyń pępowinowych lub hUVEC, które były traktowane octanem 12-o-tetradekanoiloforbol-13 lub TPA w celu aktywacji kinazy białkowej C, wykazywały zależne od dawki przesunięcie chiralności komórek z CW do CCW. Po wysiewie komórek do wzorców, chemikalia lub leki mogą być uzupełnione do pożywki w celu zbadania odpowiedzi, a system transwell może być włączony do badania kohodowli komórek.

Test ten stanowi skuteczne narzędzie do badania chiralności wielokomórkowej w różnych warunkach eksperymentalnych, oferując ważne informacje na temat roli chiralności komórek w różnych zjawiskach i procesach biologicznych.