Name: Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Poznaj model ścierania nabłonka rogówki u myszy do badania gojenia ran i stanów zapalnych. Technika z użyciem trepanu i łopatki tworzy precyzyjną, powtarzalną ranę bez uszkodzenia błony podstawnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie: Wspierane przez: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. i R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) oraz Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie reprezentują one oficjalnych poglądów National Institutes of Health ani Sigma Xi.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt na Uniwersytecie w Houston oraz w Baylor College of Medicine. Podczas obchodzenia się z myszami i ich wykorzystywania przestrzegano wytycznych zawartych w oświadczeniu Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach nad wzrokiem i okulistyką.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu fluoresceiny
	<ol>
		<li>Przygotować 1% roztwór fluoresceiny, rozpuszczając 10 mg soli sodowej fluoresceiny w 1 mL sterylnej soli fizjologicznej lub sterylnego 1x fosforanu buforu solnego (PBS). 
		UWAGA: Roztwór fluoresceiny sodowej należy przygotować w dniu użycia lub dzień wcześniej, aby uniknąć kontaminacji mikrobiologicznej. W przypadku przygotowania dzień przed użyciem, roztwór fluoresceiny należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Probówki należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu.</li>
		<li>Podzielić roztwór na alikwoty odpowiednie do użycia w pojedynczym eksperymencie. Na jedną mysz w jednym punkcie czasowym zużywa się 1-1,5 µL roztworu fluoresceiny. Do obliczenia objętości alikwoty odpowiedniej dla pojedynczego eksperymentu należy zastosować następujący wzór: 
		<img alt="Równanie obliczania objętości alikwoty; wzór obejmuje liczbę myszy, punkty czasowe; metoda badawcza." src="/files/ftp_upload/63112/63112eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> 
		UWAGA: Na przykład, jeśli w pojedynczym eksperymencie bada się sześć myszy, a wielkość rany monitoruje się w pięciu punktach czasowych, objętość alikwoty odpowiednia dla tego pojedynczego eksperymentu wyniesie: 
		<img alt="Wzór obliczania objętości, 1,5 x 6 x 5 = 45μL, przedstawiony dla analizy rozcieńczeń." src="/files/ftp_upload/63112/63112eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie koktajlu ketaminy/ksylazyny do znieczulenia myszy.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 10 mL koktajlu, zmieszać 2,0 mL ketaminy (100 mg/mL) z 1,0 mL ksylazyny (20 mg/mL) i dodać 7,0 mL sterylnego PBS. Koktajl ketaminy/ksylazyny należy przygotować dzień przed lub w dniu operacji. 
		UWAGA: Wszystkie roztwory należy stosować w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Zważ mysz (myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego w wieku 8-12 tygodni), aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego. W celu unieruchomienia i manipulacji myszami podczas iniekcji środka znieczulającego zastosuj technikę dwuręcznego unieruchamiania myszy18. Podaj cocktail ketaminy i ksylazyny drogą doszpikową (i.p.) w końcowym stężeniu 80 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny.</li>
	<li>Odczekaj do momentu pełnego znieczulenia przed wykonaniem uszkodzenia rogówki u myszy. Oceń głębokość znieczulenia poprzez sprawdzenie odruchu stopy po uciśnięciu palca. Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia mysz nie powinna reagować ruchem na uciśnięcie palca. 
	UWAGA: Ponieważ myszy szybko tracą ciepło ciała podczas znieczulenia, ważne jest zapewnienie im źródła ciepła, aby zapobiec hipotermii. Umieść myszy na źródle ciepła (macie grzewczej) podczas fazy znieczulenia oraz wybudzania.</li>
</ol>
3. Wykonanie rany rogówki
<ol>
	<li>Wykonaj uraz tylko w prawym lub lewym oku. Zachowaj spójność w wyborze oka (tj. lewego lub prawego) poddawanego zabiegowi przy przechodzeniu z jednej myszy na drugą. 
	UWAGA: Ponieważ ścierania uszkadzają nerwy rogówki i zmniejszają ostrość widzenia, uszkodzenie obu oczu może spowodować znaczny dyskomfort i upośledzenie funkcji wzrokowych. Ze względu na to, że leki przeciwbólowe mogą tłumić odpowiedzi zapalne, ich stosowanie może stanowić czynnik zakłócający w niektórych eksperymentach mających na celu zrozumienie stanu zapalnego rogówki. Rezygnacja z leków przeciwbólowych w eksperymentach z ranieniem rogówki została zatwierdzona przez naszą Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).</li>
	<li>Aby stworzyć ranę nabłonkową rogówki:
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym użyj trepanu o średnicy 2 mm (patrz Rysunek 1), aby wyznaczyć środek rogówki, trzymając oko szeroko otwarte za pomocą kciuka i palca wskazującego podtrzymujących powieki. Delikatnie obróć trepan, aby odcisnąć go na nabłonku rogówki. 
		UWAGA: Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku podczas korzystania z trepanu, ponieważ może to doprowadzić do perforacji rogówki. Należy również zadbać o centralne ustawienie trepanu. Jako punkt orientacyjny do zlokalizowania środka rogówki można wykorzystać źrenice.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym trzymaj tępy zgłębnik (patrz Rysunek 1) pod kątem około 45° względem powierzchni rogówki w obszarze wyznaczonym trepanem. Ostrożnie i w sposób ciągły zeskrob nabłonek w wyznaczonym obszarze za pomocą zgłębnika, aby usunąć warstwę nabłonkową. 
		UWAGA: Podczas usuwania nabłonka nie stosuj nadmiernej siły, ponieważ może to również spowodować perforację rogówki. Oczy myszy mogą wysychać podczas procesu ranienia, co utrudnia usuwanie nabłonka. W takim przypadku nanieś sterylny PBS na powierzchnię oka, aby zachować optymalne nawodnienie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Narzędzia chirurgiczne: trepan 2,0 mm i tępy zgłębnik typu golf pokazujące sprzęt do oczyszczania rany." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Trepan 2 mm i tępy zgłębnik typu golf. Trepan służy do wyznaczenia okrągłego obszaru w centrum rogówki, a zgłębnik typu golf do usunięcia nabłonka wewnątrz wyznaczonego obszaru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Monitorowanie zamykania się rany i reepitelializacji
<ol>
	<li>Nanieść pipetą 1-1,5 µL 1% roztworu fluoresceiny na uszkodzoną powierzchnię i sfotografować rogówkę za pomocą mikroskopu cyfrowego z niebieskim źródłem światła.</li>
	<li>Zdjęcia należy wykonać w ciągu pierwszej minuty od dodania roztworu fluoresceiny, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się barwnika na otaczający nabłonek, co mogłoby prowadzić do zawyżenia wielkości rany. Uszkodzone rogówki są obrazowane w określonych odstępach czasu (tj. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h i 30 h) po zadaniu rany. 
	UWAGA: We wszystkich punktach czasowych obrazowanie jest wykonywane w znieczuleniu; w momencie zadawania rany stosuje się ketaminę/ksylazynę, natomiast w kolejnych punktach czasowych stosuje się izofluran. Myszy są utrzymywane indywidualnie w osobnych klatkach przez cały okres monitorowania gojenia rany. W przypadku wspólnego przebywania myszy mają tendencję do wylizywania oczu współmieszkańców klatki, co – jak wykazano – wpływa na gojenie ran w różnych tkankach19,20.</li>
	<li>Przeanalizować wykonane zdjęcia, wyznaczając obszar rany za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Powierzchnia rany dla każdego punktu czasowego jest wyrażona jako procent pierwotnej powierzchni rany w czasie 0 h.</li>
</ol>
5. Obrazowanie i analiza immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Uśmierć myszy metodą zatwierdzoną przez IACUC (w tym przypadku przedawkowanie dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcie szyi) w wybranych punktach czasowych po zranieniu.</li>
	<li>Pobierz gałki oczne, delikatnie naciskając zewnętrzny kącik oka, aby przesunąć gałkę za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki. Poprowadź nożyczki za gałką oczną, aby pewnie chwycić nerw wzrokowy, a następnie przetnij nerw, co umożliwi usunięcie gałki ocznej.</li>
	<li>Utrwal każdą gałkę oczną w 1 mL 1x PBS zawierającego 2% paraformaldehydu przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj trzy razy w 1 mL 1x PBS po 5 min każdy.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym, używając skalpela chirurgicznego, wykonaj nacięcie w twardówce, około 500 µm dystalnie od limbusa, a następnie przetnij gałkę oczną. Używając pęsety, delikatnie usuń tkankę tęczówki z rogówki, a następnie ostrożnie odetnij tkankę twardówki, dbając o pozostawienie nienaruszonego limbusa.</li>
	<li>Wykonaj cztery częściowe nacięcia radialne, każde o długości około 1 mm, rozciągające się od obwodowej części rogówki i kończące się przed jej centrum, aby umożliwić spłaszczenie rogówki.</li>
	<li>Przeprowadź permeabilizację i blokowanie rogówek w 1 mL 2% albuminy surowicy wołowej (BSA) i 0,01% TritonX -100 w 1x PBS przez 15 min, a następnie blokowanie w 2% BSA w 1x PBS przez kolejne 45 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubuj rogówki przez noc w 4 °C w koktajlu bezpośrednio znakowanych przeciwciał sprzężonych z unikalnymi fluorochromami, przygotowanym w 1x PBS zawierającym 2% BSA. 
	UWAGA: Przeciwciała są dobierane w celu znakowania konkretnych komórek i tkanek zainteresowania. Na przykład śródbłonek, neutrofile i płytki krwi są znakowane odpowiednio przeciwciałami anty-CD3121,22, anty-Ly-6G23,24 oraz anty-CD4125,26. Do koktajlu przeciwciał dodaje się 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) w celu wizualizacji jąder komórkowych.</li>
	<li>Po inkubacji przemyj rogówki trzy razy w 1x PBS po 15 min każdy.</li>
	<li>Zamocuj rogówki na szkiełku przedmiotowym w kropli medium montażowego do fluorescencji typu anti-fade, przykryj szkiełkiem nakrywnym i wykonaj obrazowanie z pożądanym powiększeniem (obiektyw od 4x do 100x) przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu świetlnego. Wykonaj obrazy pełnej grubości rogówki w różnych obszarach, zgodnie z ilustracją na Rysunku 2A. 
	UWAGA: Schemat analizy mikroskopowej przedstawiony na Rysunku 2A służy do analizy specyficznych regionalnych zmian w procesach zapalnych i podziałach komórkowych. Barwienia DAPI i Ly-6G są wykorzystywane do identyfikacji neutrofili naczyniowych. W barwieniu DAPI sferyczne neutrofile mają charakterystyczne jądro w kształcie podkowy lub pączka (Rysunek 2B).</li>
</ol>
<img alt="Schemat obszaru rogówki i obraz fluorescencyjny z mikroskopu; struktura komórkowa i analiza przekroju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia obrazowania rogówki i infiltracja neutrofili po centralnym zniesieniu nabłonka. (A) Schematyczna reprezentacja preparatu całej rogówki, pokazująca dziewięć pól mikroskopowych wzdłuż średnicy rogówki. Obszar szary reprezentuje pierwotną powierzchnię rany. Szerokość każdego regionu wynosi 500 µm. (B) Zwróć uwagę na charakterystyczny kształt podkowy lub pączka jąder neutrofili po barwieniu DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem tej pracy metodycznej było opisanie protokołu tworzenia centralnej rany ścierania nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten mysi model został wykorzystany do badania zapalenia rogówki i jego udziału w gojeniu się ran. Ten typ modelu może być używany do badania mechanizmów gojenia się ran rogówki w normalnych warunkach fizjologicznych oraz w patologiach 17,28,29,41,42.<...

Rogówka to przezroczysta przednia jedna trzecia oka. Rogówka pełni kilka funkcji, w tym ochronę wewnętrznych struktur oka i tworzenie bariery strukturalnej, która chroni oko przed infekcjami1. Co ważniejsze, rogówka ma kluczowe znaczenie dla widzenia, zapewniając około dwóch trzecich mocy refrakcyjnej oka2,3. Kluczowe znaczenie dla roli rogówki w widzeniu ma jej przezroczystość. Jednak ze względu na swoje położenie na zewnątrz, rogówka jest codziennie narażona na wiele różnych urazów, które mogą prowadzić do zakłócenia jej funkcji barierowej, utraty przezroczystości i ostatecznie ślepoty. Utrata przezroczystości rogówki jest główną przyczyną zaburzeń widzenia na całym świecie4,5. Otarcia rogówki są częstym powodem wizyt na izbie przyjęć (ER), stanowiąc połowę przypadków związanych z oczami przedstawionych na ER6. Szacuje się, że ponad 1 milion osób rocznie cierpi z powodu urazów oczu w Stanach Zjednoczonych7. Skuteczne gojenie się ran rogówki w odpowiedzi na te urazy ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy rogówki oraz zachowania jej przezroczystości i zdolności refrakcyjnych. W przypadku upośledzonego gojenia się ran rogówki, rogówka staje się podatna na infekcje, owrzodzenia i blizny8,9. Również rosnąca popularność chirurgii refrakcyjnej stanowi wyjątkowe wyzwanie traumatyczne dla klasy cornea<sup="xref">10. Biorąc pod uwagę fundamentalne znaczenie gojenia się ran rogówki dla zachowania przezroczystości rogówki i widzenia, lepsze zrozumienie prawidłowego procesu gojenia się ran rogówki jest warunkiem wstępnym zrozumienia upośledzonego gojenia się ran rogówki związanych z infekcjami i chorobami.
W tym celu opracowano kilka zwierzęcych modeli gojenia ran rogówki11,12,13,14,15. Mysie modele gojenia się ran rogówki okazały się przydatne w pogłębianiu naszego zrozumienia mechanizmów gojenia się ran rogówki działających w normalnych warunkach fizjologicznych. Do badania gojenia się ran rogówki wykorzystano różne rodzaje ran rogówki, z których każda nadaje się do badania różnych aspektów procesu gojenia się ran. Najczęstszymi typami modeli ran stosowanych w badaniach gojenia się ran rogówki są mechaniczne i chemiczne modele ran. Chemiczne rany rogówki, głównie związane z powstawaniem zasadowych oparzeń na rogówce, są przydatne do badania owrzodzeń rogówki, zmętnienia i neowaskularyzacji13. Mechaniczne rany rogówki obejmują rany oczyszczone (otarcia) i rany po keratektomii14,15,16. Nienaruszona lub przerwana błona podstawna nabłonka rogówki definiuje odpowiednio rany po oczyszczeniu i keratektomii. W ranach po oczyszczeniu błona podstawna nabłonka pozostaje nienaruszona, podczas gdy w ranach po keratektomii błona podstawna zostaje przerwana z penetracją głównie do zrębu przedniego. Rany pozabiegowe są najbardziej przydatne do badania reepitelializacji, proliferacji komórek nabłonka, odpowiedzi immunologicznej i regeneracji nerwów po zranieniu rogówki. Z drugiej strony rany po keratetektomii są najbardziej przydatne do badania bliznowacenia rogówki14,15.
Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten prosty model gojenia ran rogówki jest wysoce powtarzalny i dobrze opublikowany, a obecnie jest używany do oceny pogorszonego gojenia się ran rogówki w kontekście choroby17.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-CD31</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD41</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>553847</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ly6G</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny do dekonwolucji DeltaVision</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczne wagi ładowane od góry (waga ważenia)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>T038181000CS</td><td></td></tr><tr><td>Kij golfowy</td><td>Instrumenty Stephens</td><td>S2-1135</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do krzywej tęczówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>31212</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Patterson weterynaryjny</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson weterynaryjny</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Sól fluoresceiny sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46970</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne (ostrze scapel)</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>TritonX -100</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11923-13</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson weterynaryjne</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr></tbody></table>

model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Rogówka jest kluczowa dla widzenia, odpowiada za około dwie trzecie mocy refrakcyjnej oka. Kluczowe znaczenie dla roli rogówki w widzeniu ma jej przezroczystość. Jednak ze względu na swoje zewnętrzne położenie rogówka jest bardzo podatna na wiele różnych urazów, które mogą prowadzić do utraty przezroczystości rogówki i ostatecznej ślepoty. Skuteczne gojenie się ran rogówki w odpowiedzi na te urazy ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy rogówki oraz zachowania przezroczystości rogówki i zdolności refrakcyjnych. W przypadku upośledzonego gojenia się ran rogówki, rogówka staje się podatna na infekcje, owrzodzenia i blizny. Biorąc pod uwagę fundamentalne znaczenie gojenia się ran rogówki dla zachowania przezroczystości rogówki i widzenia, lepsze zrozumienie prawidłowego procesu gojenia się ran rogówki jest warunkiem wstępnym zrozumienia upośledzonego gojenia się ran rogówki związanych z infekcjami i chorobami. W tym celu mysie modele zranień rogówki okazały się przydatne w pogłębianiu naszego zrozumienia mechanizmów gojenia się ran rogówki działających w normalnych warunkach fizjologicznych. W tym miejscu opisano protokół tworzenia centralnego ścierania nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. W tym modelu do wyznaczenia obszaru rany stosuje się okrągłą trepanację o średnicy 2 mm, wyśrodkowaną nad rogówką. Kij golfowy jest używany z ostrożnością do oczyszczenia nabłonka i stworzenia okrągłej rany bez uszkadzania błony podstawnej nabłonka rogówki. Wynikająca z tego reakcja zapalna przebiega jako dobrze scharakteryzowana kaskada zdarzeń komórkowych i molekularnych, które mają kluczowe znaczenie dla skutecznego gojenia się ran. Ten prosty model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i dobrze opublikowany, a obecnie jest wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście choroby.

Rycina 3 przedstawia mikrofotografię transmisyjną elektronową rany rogówki powstałej w wyniku uderzenia tępym kijem do golfa, wykazującą, że błona podstawna nabłonka pozostaje nienaruszona po urazie.
<img alt="Struktura błony komórkowej, obraz z mikroskopu elektronowego pokazujący warstwy i mikrokosmki w skali 5 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3">...

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ jest doskonałym modelem do badania zapalenia rogówki i jego udziału w gojeniu się ran w normalnych i patologicznych warunkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzy precyzyjną i powtarzalną ranę nabłonkową bez naruszania błony podstawnej. Ten model zranienia rogówki jest prosty i szybki do wykonania.Procedurę zademonstruje książę Akowuah, doktorant z mojego laboratorium. Na początek przygotuj 1% roztwór fluoresceiny, rozpuszczając 10 miligramów soli fluoresceiny sodu w jednym mililitrze sterylnej soli fizjologicznej lub PBS. Następnie do znieczulenia przygotuj 10 mililitrów koktajlu ketaminowo-ksylazynowego, mieszając dwa mililitry ketaminy, jeden mililitr ksylazyny i siedem mililitrów sterylnego PBS.Po znieczuleniu 8-12-tygodniowej myszy C57 black 6 typu dzikiego, oceń głębokość znieczulenia, oceniając odruch pedałowania po uszczypnięciu palca. Aby utworzyć nabłonkową ranę rogówki, umieść znieczuloną mysz pod mikroskopem preparacyjnym. Zranij tylko prawe lub lewe oko i utrzymuj spójność z ranionym okiem podczas przechodzenia od myszy do myszy.Trzymaj oko szeroko otwarte, trzymając powieki kciukiem i palcem wskazującym. Następnie, za pomocą sterylnej trepanacji o średnicy dwóch milimetrów, wyznacz środek rogówki i delikatnie zakręć trepanacją, aby wycisnąć odcisk na nabłonku rogówki. Nie należy wywierać nadmiernego nacisku, ponieważ może to spowodować perforację rogówki.Następnie, trzymając sterylny, kij golfowy pod kątem około 45 stopni od powierzchni rogówki, oczyścić nabłonek poprzez ostrożne i ciągłe skrobanie w wyznaczonym obszarze za pomocą spud. Nie stosuj nadmiernej siły i w razie potrzeby utrzymuj nawodnienie za pomocą sterylnego PBS. W celu monitorowania zamykania się rany i ponownego nabłonkowania należy nanieść pipetą od 1 do 1,5 mikrolitra 1% roztworu fluoresceiny na zranioną powierzchnię i zobrazować rogówkę za pomocą mikroskopu cyfrowego ze źródłem światła niebieskiego.Wyobraź sobie zranioną rogówkę w określonych momentach po zranieniu. Wykonaj zdjęcia w ciągu pierwszej minuty od dodania roztworu fluoresceiny, aby uniknąć rozprzestrzeniania się roztworu na otaczający nabłonek, co może prowadzić do przeszacowania rozmiaru rany. Następnie, korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, prześledź obszar rany i wyraź obszar rany w każdym punkcie czasowym jako procent pierwotnej powierzchni rany o godzinie zero.Transmisyjny mikroskop elektronowy rany rogówki pokazuje, że błona podstawna nabłonka pozostaje nienaruszona nawet po urazie. U myszy typu dzikiego w wieku od 8 do 12 tygodni zamknięcie rany następuje po 24 godzinach od zranienia. Reakcja zapalna na zranienie charakteryzuje się obrazowaniem komórek w rąbku.Pokazano tutaj unaczynienie rąbkowe nieuszkodzonej rogówki z neutrofilami zewnątrznaczyniowymi oraz unaczynienie uszkodzonej rogówki z pozanaczyniowymi płytkami krwi i neutrofilami 30 godzin po ścieraniu. Aby pomyślnie odtworzyć ten protokół, należy użyć tego samego szczepu w każdym zakresie myszy, a rozmiar i głębokość rany muszą być wykonane zgodnie z opisem.

an-epithelial-abrasion-model-for-studying-corneal-wound-healing

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Ten protokół skupia się na uszkadzaniu powierzchni oka danio pręgowanego poprzez ścieranie, aby ocenić późniejsze zamknięcie rany na poziomie komórkowym. Podejście to wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka rogówki i wykorzystuje skaningową mikroskopię elektronową do śledzenia zmian w morfologii komórek podczas zamykania rany.

Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Opracowaliśmy małoinwazyjną technikę tworzenia modelu niedokrwiennej rany ucha u królika poprzez przerwanie tętnicy centralnej, nerwu oraz czaszkowego pęczka naczyniowo-nerwowego. Następnie wykonuje się tunel podskórny, przecinając wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Poznaj model ścierania nabłonka rogówki u myszy do badania gojenia ran i stanów zapalnych. Technika z użyciem trepanu i łopatki tworzy precyzyjną, powtarzalną ranę bez uszkodzenia błony podstawnej.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Przeglądaj więcej filmów