Name: Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Poznaj ekonomiczną metodę izolacji komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy z użyciem GM-CSF/IL-4. Protokół zapewnia wysoką czystość komórek w 7 dni, wspierając badania nad odpornością przeciwnowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Planu Nauki i Technologii Tianjin (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 i TJWJ202021QN034).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.
1. Izolacja szpiku kostnego i przygotowanie komórek BM
<ol>
	<li>Uśmierc myszy C57BL/6 (18-22 g, 6-8 tygodni) poprzez uduszenie CO2. Zamocuj mysz na stole operacyjnym myszy. Zdezynfekuj powierzchnie 70% etanolem.</li>
	<li>Przetnij skórę nogi, aby odsłonić mięśnie i tętnicę udową. Zaciśnij i oderwij tętnicę udową za pomocą dwóch kleszczy, a następnie pociągnij bliższy koniec w kierunku brzucha. 
	UWAGA: Nie przecinaj tętnicy udowej bezpośrednio. W przeciwnym razie spowoduje to nadmierne krwawienie i zanieczyszczenie pola widzenia.</li>
	<li>Przetnij wszystkie mięśnie wokół kości udowej.</li>
	<li>Powoli rozciągnij dolne kończyny myszy na zewnątrz, aż usłyszysz dźwięk zwichnięcia stawu biodrowego i zobaczysz wypadnięcie głowy kości udowej.</li>
	<li>Oddziel kończyny dolne od ciała za pomocą nożyczek wzdłuż wewnętrznej strony głowy kości udowej.</li>
	<li>Odetnij tylne nogi od końca stawu kolanowego, aby uzyskać wolną i kompletną kość udową.</li>
	<li>Usuń mięśnie przyczepione do kości udowej za pomocą gazy. 
	UWAGA: Nie narzynaj mięśni bezpośrednio. Kość udowa myszy jest delikatna, należy zachować jej integralność.</li>
	<li>Zanurz kość udową w 75% alkoholu na 2-5 minut.</li>
</ol>
2. Hodowla indukcyjna BMDC
<ol>
	<li>Wypłucz pozostały alkohol za pomocą PBS. Użyj kleszczy hemostatycznych, aby zacisnąć środkową i dolną część kości udowej, a drugi zestaw do zaciśnięcia dolnego końca kości udowej. Kleszcze hemostatyczne są przykładane bocznie do kości udowej, a kość udowa jest oddzielona od linii nasady. 
	UWAGA: Linia nasady nie jest łatwo widoczna, dopóki kość udowa nie pęknie. Ten i kolejne kroki są wykonywane w sterylnym środowisku.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (igła: 0,6 mm x 25 mm) należy wniknąć do jamy szpiku kostnego od przerwania linii nasadowej i obrócić igłę, aby przebić głowę kości udowej i jamę szpiku kostnego. Pulsować i przepłukiwać jamę szpiku kostnego za pomocą 1 ml kompletnego podłoża zawierającego GM-CSF/IL-4, aż kość stanie się biała. 
	UWAGA: Kompletna pożywka hodowlana: 10% FBS, 1% penicylina-streptomycyna, 55 μM β-merkaptoetanolu, 10 ng/mL GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wszystkie komórki w 24 ml kompletnej pożywki hodowlanej (~5 x 105 komórek/ml). Po wymieszaniu całe podłoże wysiewano na 6-dołkowej płytce z 4 ml/dołk, a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni. 
	UWAGA: Nie jest konieczna liza erytrocytów.</li>
	<li>Po 2 dniach zastąp całą pożywkę podłożem zawierającym GM-CSF/IL-47. W czwartym, szóstym i ósmym dniu zastąp połowę pożywki kompletną pożywką zawierającą 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, 
	UWAGA: Na tym etapie usuwane są zawieszone komórki, takie jak erytrocyty i limfocyty.</li>
	<li>Rób zdjęcia każdego dnia, aby rejestrować wzrost komórek. Począwszy od szóstego dnia, zbieraj jedną studzienkę komórek, aby policzyć liczbę komórek i wykryć CD11c, CD80 i MHC II expression6,7.</li>
</ol>
3. Cytometryczne wykrywanie ekspresji CD11c, CD80 i MHC II metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po przemyciu DC PBS ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 100 μl buforu FACS, dodać 0,5 μg przeciwciała anty-mysiego CD16/32 i inkubować przez 10 minut na lodzie w celu zablokowania niespecyficznych miejsc antygenowych.</li>
	<li>Dodać 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 i 0,04 μg przeciwciał APC-MHC II i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, dodać 1 ml 4% paraformaldehydu, utrwalić na 30 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu FACS.</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów i że nie mają nic do ujawnienia.

Ludzie i myszy mają różne podzbiory DC, w tym klasyczne DC (cDC, w tym cDC1 i cDC2), plazmocytoidalne DC (pDC) i DC pochodzące z monocytów (MoDCs)9,10,11. Ogólnie przyjmuje się, że cDC1 regulują odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na patogeny wewnątrzkomórkowe i raka, a cDC2 regulują odpowiedź immunologiczną na patogeny zewnątrzkomórkowe, pasożyty i alergeny12. Znaczna liczba DC może być wytwarz...

Komórki dendrytyczne (DC) są najpotężniejszymi komórkami prezentującymi antygen (APC) do aktywacji naiwnych limfocytów T i indukowania specyficznych odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL) przeciwko chorobom zakaźnym, alergiom i komórkom nowotworowym1,2,3. DC są głównym ogniwem między odpornością wrodzoną a odpornością nabytą i odgrywają istotną rolę w obronie immunologicznej i utrzymaniu tolerancji immunologicznej. W ciągu ostatnich 40 lat wielu badaczy starało się zdefiniować podzbiory DC i ich funkcje w zapaleniu i odporności. Zgodnie z tymi badaniami, DC rozwijają się wzdłuż linii szpikowej i limfatycznej z komórek szpiku kostnego. Szczepionki przeciwnowotworowe osiągnęły w ostatnich latach znaczące kamienie milowe i mają przed sobą obiecującą przyszłość. Mechanicznie szczepionki przeciwnowotworowe modulują odpowiedź immunologiczną i zapobiegają wzrostowi guza poprzez aktywację cytotoksycznych limfocytów T za pomocą antygenów nowotworowych. Szczepionka oparta na DCs odgrywa ważną rolę w immunoterapii nowotworów i została uznana za jedną z najbardziej obiecujących terapii przeciwnowotworowych1,4. Ponadto, DC są szeroko stosowane w testowaniu nowych leków ukierunkowanych molekularnie i inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych5.
Naukowcy pilnie potrzebują dużej liczby DC o wysokiej czystości, aby dalej badać rolę DC. Jednak DC są rzadkie w różnych tkankach i krwi, stanowiąc tylko 1% komórek krwi u ludzi i zwierząt. Hodowla in vitro komórek dendrytycznych szpiku kostnego (BMDC) jest ważną metodą pozyskiwania dużych ilości komórek prądu stałego. Tymczasem protokół Lutza do generowania DC ze szpiku kostnego jest szeroko stosowany przez badaczy6. Chociaż protokół jest skuteczny w pozyskiwaniu komórek DC, jest złożony i kosztowny, obejmuje dodanie wysokich stężeń cytokin i lizę czerwonych krwinek.
W tym badaniu opisujemy metodę izolowania prawie wszystkich komórek szpiku kostnego od szpiku kostnego myszy (BM) i wywoływania różnicowania do BMDC po 7-9 dniach inkubacji in vitro, przy niższym stężeniu GM-CSF i IL-4. Ta procedura zajmuje tylko 10 minut, aby zebrać prawie wszystkie komórki szpiku kostnego i zawiesić je w kompletnym pożywce. Krótko mówiąc, w tych badaniach zapewniamy wydajną i opłacalną metodę hodowli BMDC.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td></td><td>Mysz</td> rekombinowana Thermo 11875093 <td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowana IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (anty-mysz CD16/32) Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Zapotrzebowanie na komórki dendrytyczne (DC) stopniowo wzrasta wraz z postępem badań immunologicznych. Jednak DC są rzadkie we wszystkich tkankach. Tradycyjna metoda izolowania DC polega przede wszystkim na indukowaniu różnicowania szpiku kostnego (BM) w DC poprzez wstrzykiwanie dużych dawek (>10 ng/ml) czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów/interleukiny-4 (GM-CSF/IL-4), co sprawia, że procedura jest skomplikowana i kosztowna. W tym protokole, wykorzystując wszystkie komórki BM hodowane w pożywce 10 ng / mL GM-CSF / IL-4, po 3-4 wymianach półhodowli, pobrano do 2,7 x 107 komórek CD11c+ (DC) na mysz (dwie kości udowe) o czystości 80%-95%. Po 10 dniach w hodowli ekspresja CD11c, CD80 i MHC II wzrosła, podczas gdy liczba komórek zmniejszyła się. Liczba komórek osiągnęła szczyt po 7 dniach hodowli. Co więcej, ta metoda zajęła tylko 10 minut, aby zebrać wszystkie komórki szpiku kostnego, a dużą liczbę DC uzyskano po 1 tygodniu hodowli.

Od 1 x 107 do 1,7 x 107 komórek wyizolowano z dwóch kości udowych, a następnie zawieszono w 24 mL pożywki przed wysianiem na płytkę 6-dołkową (Rysunek 1A). Po 2 dniach komórki nieprzylegające usunięto poprzez całkowitą wymianę pożywki hodowlanej. Przed wymianą pożywki zaobserwowano znaczną liczbę komórek w zawiesinie (Rysunek 1B). Po 3 dniach hodowli zaczęły tworzyć się małe kolonie komórek. Szóstego dnia rozmiar i liczba kolonii znacznie w...

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Ekonomiczny i wydajny protokół izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.One.Wprowadzenie. Wraz ze wzrostem badań nad odpornością nowotworową zapotrzebowanie na komórki DC stopniowo rośnie.Jednak DC są rzadkie we wszystkich tkankach. Tradycyjna metoda polegająca głównie na indukowaniu różnicowania szpiku kostnego w DC jest skomplikowana i kosztowna. Dwa. Izolacja szpiku kostnego i przygotowanie komórek BM Składamy w ofierze myszy i mocujemy na stole operacyjnym myszy.Przeciąć skórę lewej odsłoniętych mięśni i tętnicy udowej. Nie przecinaj tętnicy udowej bezpośrednio. W przeciwnym razie spowoduje obfite krwawienie i zanieczyszczenie pola widzenia.Przetnij wszystkie mięśnie wokół kości udowej. Powoli rozciągaj dolne kończyny myszy na zewnątrz, aż do wypadnięcia głowy kości udowej i można je zaobserwować. Oddziel kończyny dolne od ciała.Przetnij tylną nogę, aby uzyskać wolną i kompletną kość udową. Usuń mięśnie za pomocą gazy. Nie rozrywaj mięśni bezpośrednio.Kość udowa myszy jest delikatna. Umieść kość udową w 75% alkoholu na dwie do pięciu minut. Trzy. Kultura iniekcyjna BMDC Przepłukać pozostały alkohol PBS.Zacisnąć środkową i dolną część kości udowej za pomocą kleszczy hemostatycznych, a dolny koniec kości udowej zacisnąć za pomocą innych kleszczy hemostatycznych. Kleszcze hemostatyczne są przykładane dosłownie do kości udowej, a kość udowa jest odrywana od linii nasady. Za pomocą jednej strzykawki ml przebić jamę szpiku kostnego z linii nasadowej.Użyj kompletnego podłoża w dwóch częściach, przepłucz jamę szpiku kostnego, aż kość stanie się biała. Zebrać płyny do płukania. Uzupełnienie kompletnej pożywki zawierającej GM CSF/IL-4 do 24 ml i nasion na 6-dołkowej płytce po 4 ml na dołek. Cztery. Wyniki.Po dwóch dniach wymienić wszystkie podłoża zawierające GM-CSF/IL-4. Połowa wymieniona na kompletną pożywkę zawierającą GM-CSF/IL-4 w czwartym, szóstym i ósmym dniu. Liczba komórek osiągnęła szczyt w siódmym dniu, a następnie stopniowo spadała.Komórki DC tworzyły dużą liczbę synaps wykazujących typową morfologię dojrzałych komórek DC. Analizy podmetryk przepływu pokazują, że stosunek CD11c narzucił co 71% w szóstym dniu, szeroki współczynnik wzrósł do 96,1% w 10 dniu. Ekspresja CD11c, CD80 i MSC2 stopniowo wzrastała wraz z wydłużaniem się czasu uprawy. Pięć. Wniosek.Krótko mówiąc, opracowaliśmy ekonomiczny i wydajny protokół izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy, który zajmuje tylko 10 minut, aby oddzielić komórki szpiku kostnego. Dużą liczbę DC o wysokiej czystości zebrano po sześciu do siedmiu dniach hodowli z 10 ng na ml, GM-CSF i IL-4.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.

Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Poznaj ekonomiczną metodę izolacji komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy z użyciem GM-CSF/IL-4. Protokół zapewnia wysoką czystość komórek w 7 dni, wspierając badania nad odpornością przeciwnowotworową.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Przeglądaj więcej filmów