Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy
July 1st, 2022
Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Ekonomiczny i wydajny protokół izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.One.Wprowadzenie. Wraz ze wzrostem badań nad odpornością nowotworową zapotrzebowanie na komórki DC stopniowo rośnie.
Jednak DC są rzadkie we wszystkich tkankach. Tradycyjna metoda polegająca głównie na indukowaniu różnicowania szpiku kostnego w DC jest skomplikowana i kosztowna. Dwa. Izolacja szpiku kostnego i przygotowanie komórek BM Składamy w ofierze myszy i mocujemy na stole operacyjnym myszy.
Przeciąć skórę lewej odsłoniętych mięśni i tętnicy udowej. Nie przecinaj tętnicy udowej bezpośrednio. W przeciwnym razie spowoduje obfite krwawienie i zanieczyszczenie pola widzenia.
Przetnij wszystkie mięśnie wokół kości udowej. Powoli rozciągaj dolne kończyny myszy na zewnątrz, aż do wypadnięcia głowy kości udowej i można je zaobserwować. Oddziel kończyny dolne od ciała.
Przetnij tylną nogę, aby uzyskać wolną i kompletną kość udową. Usuń mięśnie za pomocą gazy. Nie rozrywaj mięśni bezpośrednio.
Kość udowa myszy jest delikatna. Umieść kość udową w 75% alkoholu na dwie do pięciu minut. Trzy. Kultura iniekcyjna BMDC Przepłukać pozostały alkohol PBS.
Zacisnąć środkową i dolną część kości udowej za pomocą kleszczy hemostatycznych, a dolny koniec kości udowej zacisnąć za pomocą innych kleszczy hemostatycznych. Kleszcze hemostatyczne są przykładane dosłownie do kości udowej, a kość udowa jest odrywana od linii nasady. Za pomocą jednej strzykawki ml przebić jamę szpiku kostnego z linii nasadowej.
Użyj kompletnego podłoża w dwóch częściach, przepłucz jamę szpiku kostnego, aż kość stanie się biała. Zebrać płyny do płukania. Uzupełnienie kompletnej pożywki zawierającej GM CSF/IL-4 do 24 ml i nasion na 6-dołkowej płytce po 4 ml na dołek. Cztery. Wyniki.
Po dwóch dniach wymienić wszystkie podłoża zawierające GM-CSF/IL-4. Połowa wymieniona na kompletną pożywkę zawierającą GM-CSF/IL-4 w czwartym, szóstym i ósmym dniu. Liczba komórek osiągnęła szczyt w siódmym dniu, a następnie stopniowo spadała.
Komórki DC tworzyły dużą liczbę synaps wykazujących typową morfologię dojrzałych komórek DC. Analizy podmetryk przepływu pokazują, że stosunek CD11c narzucił co 71% w szóstym dniu, szeroki współczynnik wzrósł do 96,1% w 10 dniu. Ekspresja CD11c, CD80 i MSC2 stopniowo wzrastała wraz z wydłużaniem się czasu uprawy. Pięć. Wniosek.
Krótko mówiąc, opracowaliśmy ekonomiczny i wydajny protokół izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy, który zajmuje tylko 10 minut, aby oddzielić komórki szpiku kostnego. Dużą liczbę DC o wysokiej czystości zebrano po sześciu do siedmiu dniach hodowli z 10 ng na ml, GM-CSF i IL-4.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania wysokiej czystości komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy. Protokół obejmuje 7-dniową kulturę z GM-CSF/IL-4.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Biologia komórki
Tło
- Komórki dendrytyczne (DC) są kluczowe dla badań nad odpornością przeciwnowotworową.
- DC są rzadkie w tkankach, co sprawia, że ich izolacja jest wyzwaniem.
- Tradycyjne metody różnicowania DC są złożone i kosztowne.
- Niniejsze badanie ma na celu uproszczenie procesu generowania DC z szpiku kostnego.
Cel badania
- Opracowanie opłacalnej metody izolowania DC.
- Poprawa efektywności generowania DC ze szpiku kostnego myszy.
- Wspieranie badań nad odpornością przeciwnowotworową poprzez dostarczanie DC o wysokiej czystości.
Zastosowane metody
- Izolacja szpiku kostnego od myszy.
- Hodowla komórek szpiku kostnego z GM-CSF/IL-4.
- Oceny czystości i żywotności komórek.
- Zgoda Komitetu Etyki dla Zwierząt Instytucjonalnego.
Główne wyniki
- Udana izolacja DC o wysokiej czystości pochodzących ze szpiku kostnego.
- Wykazanie efektywności nowego protokołu.
- Możliwość szerszej aplikacji w badaniach nad odpornością przeciwnowotworową.
- Zmniejszenie czasu i kosztów w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Wnioski
- Opracowany metoda jest opłacalną alternatywą dla generowania DC.
- To podejście może ułatwić dalsze badania w dziedzinie immunologii.
- Przyszłe badania mogą eksplorować zastosowania w różnych kontekstach terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the bottleneck in dendritic cell supply for immunology and tumor immunity research by providing an economical, high-yield method for isolating bone marrow-derived dendritic cells from mice. It enables scalable generation of phenotypically characterized DCs with reduced reagent consumption and hands-on time, supporting early-stage target validation and mechanistic studies in immunotherapy pipelines. The approach improves predictive confidence in preclinical models by delivering a reproducible, disease-relevant system for evaluating immune modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell function in antigen presentation and T-cell activation pathways.
- Operational Value: Reduces cost and complexity of DC generation using standardized GM-CSF/IL-4 differentiation.
- Scientific Value: Supports functional target validation through phenotypic characterization of CD11c, CD80, and MHC II expression over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity dendritic cell populations (80%-95% CD11c+) suitable for standardized immune assays.
- Operational Value: Yields up to 2.7 x 107 cells per mouse, enabling high-throughput screening formats.
- Scientific Value: Provides a consistent biological system for assessing compound effects on dendritic cell maturation and immune function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for modeling dendritic cell responses in tumor immunity contexts.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of immunomodulatory agents with defined cellular inputs.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking dendritic cell phenotype to functional outcomes in co-culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a renewable source of dendritic cells for immune-focused assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on dendritic cell-dependent immune pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular outputs for assessing immunomodulatory activity.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of CD11c, CD80, and MHC II as maturation readouts.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell generation to preclinical models of immune activation and tolerance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for dendritic cell production across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through phenotypically defined dendritic cell inputs.
- Operational Value: Reduces time and cost via 10-minute bone marrow harvest and low cytokine dosing (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable dendritic cell models for immunotherapy screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates using standardized immune effector cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow isolation and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to 6-well plates, hemolytic forceps, and flow cytometry for phenotypic validation.
- Necessitates standardization of cytokine concentration and medium exchange schedule across users.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the 7–10 day culture window and associated decline in cell viability post-peak.
