Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy
1 lipca 2022
Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Ekonomiczny i wydajny protokół izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.One.Wprowadzenie. Wraz ze wzrostem badań nad odpornością nowotworową zapotrzebowanie na komórki DC stopniowo rośnie.
Jednak DC są rzadkie we wszystkich tkankach. Tradycyjna metoda polegająca głównie na indukowaniu różnicowania szpiku kostnego w DC jest skomplikowana i kosztowna. Dwa. Izolacja szpiku kostnego i przygotowanie komórek BM Składamy w ofierze myszy i mocujemy na stole operacyjnym myszy.
Przeciąć skórę lewej odsłoniętych mięśni i tętnicy udowej. Nie przecinaj tętnicy udowej bezpośrednio. W przeciwnym razie spowoduje obfite krwawienie i zanieczyszczenie pola widzenia.
Przetnij wszystkie mięśnie wokół kości udowej. Powoli rozciągaj dolne kończyny myszy na zewnątrz, aż do wypadnięcia głowy kości udowej i można je zaobserwować. Oddziel kończyny dolne od ciała.
Przetnij tylną nogę, aby uzyskać wolną i kompletną kość udową. Usuń mięśnie za pomocą gazy. Nie rozrywaj mięśni bezpośrednio.
Kość udowa myszy jest delikatna. Umieść kość udową w 75% alkoholu na dwie do pięciu minut. Trzy. Kultura iniekcyjna BMDC Przepłukać pozostały alkohol PBS.
Zacisnąć środkową i dolną część kości udowej za pomocą kleszczy hemostatycznych, a dolny koniec kości udowej zacisnąć za pomocą innych kleszczy hemostatycznych. Kleszcze hemostatyczne są przykładane dosłownie do kości udowej, a kość udowa jest odrywana od linii nasady. Za pomocą jednej strzykawki ml przebić jamę szpiku kostnego z linii nasadowej.
Użyj kompletnego podłoża w dwóch częściach, przepłucz jamę szpiku kostnego, aż kość stanie się biała. Zebrać płyny do płukania. Uzupełnienie kompletnej pożywki zawierającej GM CSF/IL-4 do 24 ml i nasion na 6-dołkowej płytce po 4 ml na dołek. Cztery. Wyniki.
Po dwóch dniach wymienić wszystkie podłoża zawierające GM-CSF/IL-4. Połowa wymieniona na kompletną pożywkę zawierającą GM-CSF/IL-4 w czwartym, szóstym i ósmym dniu. Liczba komórek osiągnęła szczyt w siódmym dniu, a następnie stopniowo spadała.
Komórki DC tworzyły dużą liczbę synaps wykazujących typową morfologię dojrzałych komórek DC. Analizy podmetryk przepływu pokazują, że stosunek CD11c narzucił co 71% w szóstym dniu, szeroki współczynnik wzrósł do 96,1% w 10 dniu. Ekspresja CD11c, CD80 i MSC2 stopniowo wzrastała wraz z wydłużaniem się czasu uprawy. Pięć. Wniosek.
Krótko mówiąc, opracowaliśmy ekonomiczny i wydajny protokół izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy, który zajmuje tylko 10 minut, aby oddzielić komórki szpiku kostnego. Dużą liczbę DC o wysokiej czystości zebrano po sześciu do siedmiu dniach hodowli z 10 ng na ml, GM-CSF i IL-4.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia ekonomiczną i wydajną metodę izolacji i generowania komórek dendrytycznych o wysokiej czystości, pochodzących z szpiku kostnego myszy. Protokół obejmuje 7-dniową hodowlę z zastosowaniem GM-CSF/IL-4.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Komórki dendrytyczne (DCs) są kluczowe dla badań nad odpornością przeciwnowotworową.
- Komórki DCs występują w tkankach rzadko, co utrudnia ich izolację.
- Tradycyjne metody różnicowania DCs są złożone i kosztowne.
- Celem niniejszego badania jest uproszczenie procesu generowania DCs z szpiku kostnego.
Cel badania
- Opracowanie kosztowo efektywnej metody izolacji komórek dendrytycznych (DC).
- Poprawa wydajności generowania DC z szpiku kostnego myszy.
- Wsparcie badań nad odpornością przeciwnowotworową poprzez zapewnienie wysokiej czystości DC.
Zastosowane metody
- Izolacja szpiku kostnego z myszy.
- Hodowla komórek szpiku kostnego z dodatkiem GM-CSF/IL-4.
- Ocena czystości i żywotności komórek.
- Zgoda Instytucjonalnego Komitetu Etyki ds. Zwierząt.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja wysokiej czystości komórek DC pochodzących z szpiku kostnego.
- Wykazana efektywność nowego protokołu.
- Potencjał do szerszego zastosowania w badaniach nad odpornością przeciwnowotworową.
- Zmniejszenie nakładów czasu i kosztów w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi切实 alternatywę dla generowania komórek DC.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania w dziedzinie immunologii.
- Przyszłe badania mogą zgłębić zastosowania w różnych kontekstach terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy protokół rozwiązuje problem ograniczonej dostępności komórek dendrytycznych w badaniach nad immunologią i odpornością przeciwnowotworową, oferując ekonomiczną, wysokowydajną metodę izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy. Umożliwia on skalowalną generację fenotypowo scharakteryzowanych DC przy zmniejszonym zużyciu odczynników i krótszym czasie pracy laboratoryjnej, co wspiera wczesną walidację celów oraz badania mechanistyczne w ramach opracowywania immunoterapii. Podejście to zwiększa wiarygodność predykcyjną w modelach przedklinicznych, dostarczając powtarzalny, istotny chorobowo system do oceny modulacji immunologicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji komórek dendrytycznych w procesach prezentacji antygenu i szlakach aktywacji limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza koszt i stopień złożoności generowania komórek DC przy użyciu standaryzowanej dyferencjacji z zastosowaniem GM-CSF/IL-4.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez charakterystykę fenotypową ekspresji CD11c, CD80 i MHC II w czasie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie populacji komórek dendrytycznych o wysokiej czystości (80%-95% CD11c+), odpowiednich do standaryzowanych testów immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia pozyskanie do 2,7 x 107 komórek z jednej myszy, co pozwala na zastosowanie formatów przesiewowych o wysokiej przepustowości.
- Wartość naukowa: Zapewnia spójny system biologiczny do oceny wpływu związków na dojrzewanie komórek dendrytycznych i funkcję immunologiczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na stworzenie istotnego w kontekście chorobowym układu do modelowania odpowiedzi komórek dendrytycznych w warunkach odporności przeciwnowotworowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera przedkliniczną ocenę agentów immunomodulujących przy określonych danych wejściowych komórkowych.
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie fenotypu komórek dendrytycznych z efektami funkcjonalnymi w systemach kokultur.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – zapewniając odnawialne źródło komórek dendrytycznych do analiz ukierunkowanych na układ odpornościowy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków odpornościowych zależnych od komórek dendrytycznych oraz angażowania celów terapeutycznych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki komórkowe do oceny aktywności immunomodulacyjnej.
- Analityka: Umożliwia pomiar CD11c, CD80 i MHC II za pomocą cytometrii przepływowej jako wskaźników dojrzewania.
- Badania translacyjne: Łączy generowanie komórek dendrytycznych in vitro z przedklinicznymi modelami aktywacji i tolerancji immunologicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia znormalizowany, skalowalny protokół produkcji komórek dendrytycznych w ramach projektów immunologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dzięki wykorzystaniu wejść z komórek dendrytycznych zdefiniowanych fenotypowo.
- Wartość operacyjna: Redukuje czas i koszty dzięki 10-minutowemu pobieraniu szpiku kostnego oraz niskiemu dawkowaniu cytokin (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wiarygodnych modeli komórek dendrytycznych do przesiewu immunoterapii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów immunomodulujących z uwzględnieniem ryzyka przy użyciu standaryzowanych efektorowych komórek odpornościowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w izolacji szpiku kostnego myszy oraz w technikach aseptycznych hodowli komórkowej.
- Metoda zależy od dostępu do płytek 6-dołkowych, pęsety hemolitycznej oraz cytometrii przepływowej w celu walidacji fenotypowej.
- Konieczna jest standaryzacja stężenia cytokin oraz harmonogramu wymiany medium dla wszystkich użytkowników.
- Przeniesienie metody na inne szczepy myszy lub tła genetyczne wymaga uwzględnienia odpowiednich adaptacji.
- Metoda jest ograniczona 7–10 dniowym oknem hodowlanym oraz związanym z tym spadkiem żywotności komórek po osiągnięciu szczytu.
