Name: Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo infekcji SARS-CoV-2 u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu wirusów reporterowych. Technika ta umożliwia skuteczną ocenę terapii przeciwwirusowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom naszego instytutu (Texas Biomedical Research Institute) za ich wysiłki w utrzymaniu naszych obiektów w pełni funkcjonalnych i bezpiecznych podczas pandemii COVID-19. Chcielibyśmy również podziękować naszemu Instytucjonalnemu Komitetowi ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) i firmie Spell (IACUC) za przegląd naszych protokołów w sposób efektywny czasowo. Dziękujemy dr Thomasowi Moranowi z Icahn School of Medicine w Mount Sinai za dostarczenie reaktywnego krzyżowo przeciwciała monoklonalnego białka nukleokapsydu (N) SARS-CoV. Badania nad SARS-CoV-2 w laboratorium Martinez-Sobrido są obecnie wspierane przez granty NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 i R43AI165089-01; Departament Obrony (DoD) przyznaje W81XWH2110095 i W81XWH2110103; San Antonio Partnership for Precision Therapeutic (Partnerstwo na rzecz Terapii Precyzyjnej); Forum Instytutu Badań Biomedycznych w Teksasie; Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio; Fundacja Medyczna San Antonio; oraz przez Centrum Badań nad Patogenezą i Przenoszeniem Grypy (CRIPT), finansowane przez NIAID Centrum Doskonałości ds. Badań i Reagowania na Grypę (CEIRR, umowa # 75N93021C00014).

Protokoły z udziałem transgenicznych myszy K18 hACE2 zostały zatwierdzone przez Teksański Instytut Badań Biomedycznych (TBRI), Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie eksperymenty są zgodne z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowej Rady ds. Badań Naukowych40. Podczas pracy z myszami wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
1. Użycie myszy transgenicznych K18 hACE2
<ol>
	<li>Zakup i utrzymanie 4-6-tygodniowej suczki B6. Myszy Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (myszy transgeniczne K18 hACE2) w placówce opieki nad zwierzętami o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 w określonych warunkach wolnych od patogenów.
	<ol>
		<li>Po przybyciu do obiektów BSL2 należy pozwolić zwierzętom zaaklimatyzować się przez 7 dni i przenieść je do obiektu dla zwierząt BSL-3 w celu przeprowadzenia infekcji i innych procedur eksperymentalnych.</li>
		<li>Postępując zgodnie z protokołami IACUC, umieść 4 myszy w klatce. Aby upewnić się, że zwierzę nie żyje, po zakażeniu myszy rSARS-CoV-2 i obrazowaniu in vivo, należy poddać zwierzęta eutanazji za pomocą śmiertelnej dawki Fatal-Plus (>100 mg/kg).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bezpieczeństwo biologiczne
UWAGA: W tym manuskrypcie rSARS-CoV-2 jest generowany przy użyciu odwrotnych systemów genetycznych opartych na BAC dla szczepu SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, jak wcześniej opisano37. Wszystkie procedury in vivo obejmujące zakażenia rSARS-CoV-2/Nluc lub rSARS-CoV-2/Venus muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach BSL-3.
<ol>
	<li>Wyczyść komorę bezpieczeństwa biologicznego 2% środkiem dezynfekującym Wexicide i 70% Ethanol kolejno przed i po wykonaniu wszystkich procedur eksperymentalnych opisanych w tym artykule.</li>
	<li>Wysterylizuj cały materiał preparacyjny (nożyczki, kleszcze preparacyjne itp.) oraz homogenizator przed i po każdym użyciu.</li>
	<li>Wyczyść komorę izolacyjną i zdezynfekuj za pomocą tabletek MB10 przed i po każdym użyciu zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Odrzucić cały materiał biologiczny wytworzony podczas procedur zgodnie z wytycznymi IBC i IACUC.</li>
</ol>
3. Charakterystyka in vivo rSARS-CoV-2
<ol>
	<li>Infekcje myszy
	<ol>
		<li>Umieść samice 4-6-tygodniowych myszy transgenicznych K18 hACE2 w oznakowanych klatkach, zidentyfikuj myszy w każdej klatce za pomocą kodu dziurkacza w uchu i umieść 4 myszy w klatce. Użyj grupy myszy do pomiaru masy ciała i przeżycia, a innej grupy zwierząt do miareczkowania wirusa i obrazowania.</li>
		<li>Przed infekcją należy ogolić klatkę piersiową myszy po stronie brzusznej od brodawki piersiowej do okolicy brodawki pachwinowej, aby ułatwić sygnał bioluminescencji.</li>
		<li>Przygotować inokulum rSARS-CoV-2 z 105 jednostkami tworzącymi płytkę (PFU)/mysz w sterylnych warunkach w całkowitej objętości 50 μL przy użyciu sterylnego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS). 
		UWAGA: Oblicz ilość rSARS-CoV-2, która ma być użyta w rozcieńczeniu wirusa, według wzoru: potrzebny wirus = (105 PFU na mysz / 50 μL) x objętość końcowa) / podstawowe miano wirusa.</li>
		<li>Przechowywać inokulum wirusa w stanie schłodzonym na lodzie.</li>
		<li>Użyj myszy zakażonych pozorami (1x PBS) i rSARS-CoV-2/WT jako kontroli wewnętrznej. Umieść pozorowane zakażone myszy w osobnej klatce niż myszy zakażone rSARS-CoV-2.</li>
		<li>Znieczulić myszy za pomocą 5% uspokojenia gazowego izofluranem w komorze anestezjologicznej i utrzymywać z 3% izofluranem.</li>
		<li>Po potwierdzeniu reakcji posturalnej i odruchu prostowania umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej.</li>
		<li>Chwyć szyję myszy między palcem wskazującym a kciukiem i przytrzymaj ogon przy dłoni małym palcem, aby utrzymać zwierzę w pozycji grzbietowej.</li>
		<li>Umieścić końcówkę pipety zawierającą 50 μl inokulum wirusa w nozdrzu i powoli wysunąć roztwór. Upewnij się, że inokulum wirusa jest wdychane i nie ma refluksu, obserwując, jak kropla inokulum znika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie bioluminescencji Transgeniczne myszy K18 hACE2 zakażone rSARS-CoV-2/Nluc (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) 
	UWAGA: Ten eksperyment jest zgodny ze schematem i wykorzystuje wirusy wyświetlane w Rysunek 1. Do systemu obrazowania in vivo (IVIS) wymagana jest nasadka do znieczulenia izofluranem. Szczegółowe informacje na temat wymaganych przyrządów i systemów można znaleźć w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw parametry, kliknij tryb obrazu na Bioluminescencja, otwórz filtr i ustaw czas ekspozycji na automatyczny.</li>
		<li>Po zainicjowaniu maszyny IVIS umieść myszy w komorze izolacyjnej, będąc jeszcze w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Indukuj myszy izofluranem w stężeniu 5%. Po potwierdzeniu utraty reakcji posturalnej i odruchu prostowania należy utrzymywać z 3% izofluranem.</li>
		<li>Gdy myszy zostaną znieczulone, usuń je z komory izolacyjnej i podaj po orbicie substrat lucyferazy rozcieńczony 1:10 w 1x PBS (końcowa objętość 100 μL / mysz) za pomocą igły 25 G.</li>
		<li>Po podaniu substratu lucyferazy umieść myszy z powrotem w komorze izolacyjnej z klatką piersiową skierowaną do góry i jamą nosową wewnątrz stożka kolektora, aby utrzymać zwierzę w stanie znieczulenia podczas procedury obrazowania.</li>
		<li>Przenieś komorę izolacyjną do maszyny IVIS i natychmiast po zamknięciu drzwiczek imagera IVIS wybierz Acquire w oprogramowaniu, aby zainicjować (Rysunek 2A).</li>
		<li>Aby przeanalizować uzyskane obrazy bioluminescencyjne, użyj narzędzia ROI (region zainteresowania) w oprogramowaniu, aby wyznaczyć dokładny sygnał i zmierzyć strumień (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Kliknij Zmierz i pozwól systemowi rozpocząć ocenę bioluminescencji fotonów, aby zapewnić bezwzględną emisję fotonów porównywalną z pomiarami wyjściowymi zapewnianymi przez różne parametry.</li>
		<li>Obrazuj myszy po 1, 2, 4 i 6 dniach od infekcji.</li>
		<li>Po obrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza fluorescencji u transgenicznych myszy K18 hACE2 zakażonych rSARS-CoV-2/Venus (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 4) 
	UWAGA: Ten eksperyment jest zgodny ze schematyczną reprezentacją i rSARS-CoV-2 pokazanym na <silna klasa="xfig">Rysunek 3. Szczegółowe informacje na temat wymaganych przyrządów i systemów można znaleźć w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw parametry, ustaw wzbudzenie (500 nm) i filtry emisyjne (530 nm), kliknij tryb obrazu na Fluorescencja i ustaw czas ekspozycji na automatyczny.</li>
		<li>Uśpienie dootrzewnowe myszy za pomocą śmiertelnej dawki Fatal-Plus (>100 mg/kg). Po eutanazji należy zdezynfekować miejsce nacięcia 70% etanolem.</li>
		<li>Za pomocą pęsety pociągnij skórę, wykonaj nacięcie od mostka do brzucha i odetnij nacięcie z boków nożyczkami. Przeciąć żyłę wątrobową, aby zminimalizować ilość krwi w płucach i uniknąć wysokich sygnałów tła podczas obrazowania.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek przetnij mostek i otwórz klatkę piersiową. Następnie odetnij koniec tchawicy nożyczkami i usuń płuca pęsetą.</li>
		<li>Umieść wycięte płuca w 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml 1x PBS i spłucz w celu usunięcia nadmiaru krwi. Zminimalizuj możliwość zanieczyszczenia między próbkami, dezynfekując i czyszcząc narzędzia chirurgiczne między próbkami przy użyciu 70% etanolu.</li>
		<li>Po zainicjowaniu urządzenia IVIS umieść płuca w czarnej tacce i oddziel tkanki od siebie.</li>
		<li>Umieść tacę w komorze izolacyjnej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego, a następnie przenieś komorę izolacyjną do IVIS. Zamknij drzwi i kliknij Pobierz, aby uruchomić system obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
		<li>Aby przeanalizować fluorescencję, użyj narzędzia ROI i narysuj ROI wokół każdego z poszczególnych płuc. Zmierz każdy zwrot z inwestycji ręcznie, a następnie użyj podanych średnich wartości wydajności promieniowania i odejmij od wartości pozorowanych zainfekowanych myszy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B).</li>
		<li>Po zakończeniu obrazowania umieść tkanki na lodzie do analizy tego samego dnia lub w krioprobówce do zamrażania suchego lodu w celu przechowywania w temperaturze -80 °C do późniejszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie i ocena patologii płuc w jasnym polu transgenicznych myszy K18 hACE2 zakażonych rSARS-CoV-2 / Nluc (<silna klasa = "xfig" >Figura 2A-C) i rSARS-CoV-2 / Venus (<silna klasa = "xfig">Figura 4A-C)
	<ol>
		<li>Po zobrazowaniu bioluminescencji myszy zakażonych rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT i pozorowanych zakażonych, należy przywrócić myszy do ich klatek. Kontynuuj eutanazję i obrazowanie ex vivo w jasnym polu płuc myszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Po zobrazowaniu ex vivo fluorescencji płuc zakażonych myszy, wykonaj obrazy płuc w jasnym polu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A).</li>
		<li>Przeanalizuj duże zmiany na powierzchni płuc za pomocą ImageJ (<silna klasa="xfig">Rysunki 2C i 4C).</li>
		<li>Otwórz obraz płuca, który ma zostać przeanalizowany w ImageJ.</li>
		<li>Oblicz stosunek pikseli do cm, użyj narzędzia Prosty i zmierz rzeczywistą długość obrazu.</li>
		<li>Po wybraniu kliknij Analizuj > mierz, aby obliczyć długość pikseli dla długości.</li>
		<li>Kliknij Analiza > Ustaw skalę i wprowadź liczby obliczone w poprzednim kroku.</li>
		<li>Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne i zaznacz całą powierzchnię płuca. Kliknij Analizuj > Mierz, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię płuc.</li>
		<li>Kliknij Edytuj > Zaznaczenie > Odwróć, aby zaznaczyć resztę obszaru płuc, a następnie naciśnij Usuń lub Backspace, aby usunąć tło.</li>
		<li>Usuń zaznaczony obszar, a następnie kliknij Obraz > Dostosuj próg koloru >.</li>
		<li>Aby wybrać obszar zmiany patologicznej, ustaw jasność na minimum (od 1 do 50) i maksimum (od 50 do 200), w zależności od obecnego poziomu zatorów i krwotoków.</li>
		<li>Po wybraniu zmian patologicznych kliknij Wybierz u dołu panelu kolorów progu, a następnie kliknij Analizuj > mierz, aby zmierzyć obszary patologiczne.</li>
		<li>Obliczyć procent zmian patologicznych za pomocą wzoru: % obszaru patologicznego = (pomiar obszaru patologicznego/całkowitej powierzchni płuc) x 100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miareczkowanie wirusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D i <silna klasa="xfig">Rysunek 4D)
	<ol>
		<li>Po obrazowaniu zakończ eutanazję myszy i zbierz płuca, mózg i błonę śluzową nosa.</li>
		<li>Umieść płuca, mózg i błonę śluzową nosa w oddzielnych sterylnych homogenizatorach tkankowych i dodaj 1 ml zimnego 1x PBS.</li>
		<li>Homogenizować próbki, odwirowując przy 21 500 x g przez 10 minut, aby uzyskać resztki komórek. Zebrać i przenieść supernatanty do nowej sterylnej probówki i wyrzucić osad.</li>
		<li>Jeżeli miareczkowanie wirusa przeprowadza się tego samego dnia, supernatanty należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, supernatant z homogenizowanych próbek należy zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu późniejszej oceny.</li>
		<li>Wykorzystując supernatanty uzyskane z homogenatów tkankowych, wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia i zainfekuj zlewające się monowarstwy komórek Vero E6 1 ml każdego rozcieńczenia supernatantu (format płytki 6-dołkowej, 1,2 × 106 komórek / dołek, trzykrotnie).</li>
		<li>Pozwól wirusowi adsorbować się przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
		<li>Po adsorpcji wirusa przemyć komórki 1 ml 1x PBS i inkubować w 2 ml pożywki poinfekcyjnej zawierającej 1% agaru w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji inaktywować płytki w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, upewnić się, że cała płytka jest zanurzona.</li>
		<li>Wyjmij płytki z BSL3 i umyj komórki trzykrotnie 1 ml 1x PBS i przepuszczaj 1 ml 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Zablokować komórki 1 ml 2,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie inkubować w 1 ml 1 μg/ml wirusa monoklonalnego reagującego krzyżowo białka nukleokapsydu (N) SARS-CoV (1C7C7), rozcieńczonego w 2,5% BSA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie 1 ml 1x PBS i rozwiń blaszki za pomocą zestawu ABC i zestawu substratu peroksydazy DAB zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Oblicz miana wirusa jako PFU/mL. 
		UWAGA: Obliczyć za pomocą wzoru PFU/ml = współczynnik rozcieńczenia x liczba blaszek x (1 ml/objętość inokulum).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywność Nluc w tkankach transgenicznych myszy K18 hACE2 zakażonych rSARS-CoV-2/Nluc (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E)
	<ol>
		<li>Określ ilościowo obecność Nluc w homogenatach narządowych od pozorowanych, zakażonych rSARS-CoV-2/WT i rSARS-CoV-2/Nluc transgenicznych myszy K18 hACE2 za pomocą testu lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena zachorowalności i śmiertelności (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F, G i <silna klasa="xfig">Rysunek 4E, F)
	<ol>
		<li>Inkażować donosowo 4-6-tygodniowe samice transgenicznych myszy K18 hACE2 za pomocą 105 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc lub pozorowanego zakażenia, jak opisano w sekcji 3.1.</li>
		<li>Monitoruj i waż myszy przez 12 dni w tym samym czasie, aby zminimalizować różnice w wadze spowodowane spożyciem pokarmu. Poddaj eutanazji myszy, które tracą 25% początkowej masy ciała, odkąd osiągnęły humanitarny punkt końcowy i zauważ, że myszy te ulegają infekcji wirusowej.</li>
		<li>Po 12 dniach poddaj eutanazji myszy, które przeżyły infekcję wirusową i oblicz % zmiany masy ciała i przeżycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+biology+and+replication%3A+implications+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).</li>
<li>Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus-2+%28SARS-CoV-2%29%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update.</a> Cureus. 12 (3), 7423(2020).</li>
<li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+genetic+recombination%2C+and+pathogenesis+of+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses.</a> Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).</li>
<li>Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+pathogenic+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of pathogenic coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+characterisation+and+epidemiology+of+2019+novel+coronavirus%3A+implications+for+virus+origins+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.</a> Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).</li>
<li>Evans, J. P., Liu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+host+factors+in+SARS-CoV-2+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of host factors in SARS-CoV-2 entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).</li>
<li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li>
<li>Alfaraj, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+predictors+of+mortality+of+Middle+East+Respiratory+Syndrome+Coronavirus+%28MERS-CoV%29+infection%3A+A+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Travel+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study.</a> Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).</li>
<li>Harvey, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+variants%2C+spike+mutations+and+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).</li>
<li>Dong, E., Du, H., Gardner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+web-based+dashboard+to+track+COVID-19+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).</li>
<li>Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARS-CoV-2+%28COVID-19%29+by+the+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers.</a> Elife. 9, 57309(2020).</li>
<li>Roussel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+fear+versus+data%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: fear versus data.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).</li>
<li>Scialo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+One+year+in+the+pandemic.+What+have+we+learned%2C+the+new+vaccine+era+and+the+threat+of+SARS-CoV-2+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants.</a> Biomedicines. 9 (6), 611(2021).</li>
<li>Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19</a> (2021).</li>
<li>Dougan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bamlanivimab+plus+Etesevimab+in+Mild+or+Moderate+Covid-19%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19.</a> New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID+antibody+treatments+show+promise+for+preventing+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease.</a> Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).</li>
<li>Tuccori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+preclinical+discovery+and+development+of+bamlanivimab+for+the+treatment+of+novel+coronavirus+infection+%28COVID-19%29%3A+reasons+for+limited+clinical+use+and+lessons+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).</li>
<li>Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+inpatient+administration+of+casirivimab+and+imdevimab+antibody+cocktail+for+the+treatment+of+COVID-19+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia.</a> Cureus. 13 (5), 15280(2021).</li>
<li>O'Brien, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+REGEN-COV+antibody+combination+in+early+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li>
<li>Beigel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remdesivir+for+the+treatment+of+Covid-19+-+Final+report%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report.</a> New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+convalescent+plasma+therapy+on+time+to+clinical+improvement+in+patients+with+severe+and+life-threatening+COVID-19%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).</li>
<li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Pfizer-BioNTech+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+December+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Janssen+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+February+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+and+bioluminescent+bireporter+Influenza+A+Virus+to+evaluate+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections.</a> Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+fluorescent-expressing+influenza+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus.</a> Virus Research. 213, 69-81 (2016).</li>
<li>Welsh, D. K., Noguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cellular bioluminescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).</li>
<li>Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+real-time+in+vivo+imaging+of+an+influenza+reporter+virus+reveals+dynamics+of+replication+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread.</a> Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).</li>
<li>Schoggins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+viruses+reveal+viral+dynamics+in+interferon+receptor-deficient+mice+and+sensitivity+to+interferon+effectors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).</li>
<li>Luker, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+and+therapy+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+antiviral+screening+assay+based+on+eGFP+reporter+virus+of+Mayaro+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus.</a> Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).</li>
<li>Kirui, J., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+validation+of+a+highly+sensitive+bioluminescent+HIV-1+reporter+vector+that+simplifies+measurement+of+virus+release%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release.</a> Retrovirology. 17 (1), 12(2020).</li>
<li>Shang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+eGFP+enterovirus+71+for+antiviral+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening.</a> Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+SARS-CoV-2+from+a+single+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome.</a> mBio. 11 (5), 02168(2020).</li>
<li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).</li>
<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
<li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22National+Research+Council+%28US%29%22%5BJournal%5D)">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakiegokolwiek komercyjnego, finansowego i niefinansowego lub osobistego konfliktu interesów w związku z opisywaną pracą.

Protokół ten demonstruje wykonalność wykorzystania tych genów reporterowych eksprymujących rSARS-CoV-2 do monitorowania infekcji wirusowych in vivo. Oba rekombinowane wirusy wykazujące ekspresję reporterową stanowią doskonałe narzędzie do badania zakażeń SARS-CoV-2 in vivo. Opisane systemy obrazowania ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) i in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) stanowią doskonałą opcję do zrozumienia dynamiki zakażenia SARS-CoV-2, patogenezy wirusa oraz identyfikacji zakażonych komórek/nar...

Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) to jednoniciowy wirus RNA, który należy do linii Betacoronavirus z rodziny Coronaviridae1. Ta rodzina wirusów jest podzielona na koronawirusa alfa, beta, gamma i delta1. Alfa- i Betakoronawirusy infekują głównie ssaki, podczas gdy Gamma- i Deltakoronawirusy infekują prawie wyłącznie ptaki2. Do tej pory siedem koronawirusów (CoV) przekroczyło bariery gatunkowe i pojawiło się jako koronawirusy ludzkie (HCoV): dwa alfa-CoV (HCoV-229E i HCoV-NL63) i pięć beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego [MERS-CoV] i SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV i SARS-CoV-2 są wysoce zjadliwe, powodując poważne infekcje dolnych dróg oddechowych7. Przed pojawieniem się SARS-CoV-2 miały miejsce dwa ogniska epidemiczne wywołane przez CoV: SARS-CoV w Guangdong Providence w Chinach w latach 2002-2003, ze wskaźnikiem śmiertelności przypadków (CFR) wynoszącym około 9,7%; oraz MERS-CoV na Bliskim Wschodzie od 2012 r. do chwili obecnej, z CFR wynoszącym około 34%7,8. SARS-CoV-2 ma ogólny CFR między 3,4%-49%, przy czym warunki podstawowe przyczyniają się do wyższego CFR8,9. Od czasu odkrycia w grudniu 2019 r. w Wuhan w Chinach SARS-CoV-2 jest odpowiedzialny za ponad 242 miliony infekcji u ludzi i ponad 4,9 miliona zgonów ludzi na całym świecie7,10,11,12. Warto zauważyć, że od końca 2020 r. nowe warianty SARS-CoV-2 budzące obawy (VoC) i warianty będące przedmiotem zainteresowania (VoI) wpłynęły na charakterystykę wirusa, w tym na transmisję i antygenowość9,13 oraz ogólny kierunek pandemii COVID-19. W leczeniu zakażeń SARS-CoV-2 istnieje obecnie tylko jeden Stany Zjednoczone (USA) Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) terapeutyczny lek przeciwwirusowy (remdesivir) i jeden lek dopuszczony do użytku w nagłych wypadkach (EUA) (baricytynib, do stosowania w połączeniu z remdesivirem)14. Istnieje również 6 zatwierdzonych przeciwciał monoklonalnych EUA: REGEN-COV (kasiriwymab i imdewymab, podawane razem), sotrowimab, tocilizumab oraz bamlaniwimab i etesewimab podawane razem15,16,17,18,19. Obecnie istnieje tylko jedna szczepionka profilaktyczna zatwierdzona przez FDA, Pfizer-BioNTech, a dwie inne szczepionki profilaktyczne (Moderna i Janssen) zostały zatwierdzone przez EUA20,21,22,23,24. Jednak przy niekontrolowanym wskaźniku zakażeń i pojawieniu się VoC i VoI, SARS-CoV-2 nadal stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. W związku z tym pilnie potrzebne są nowe podejścia w celu zidentyfikowania skutecznych środków profilaktycznych i terapeutycznych w celu kontrolowania zakażenia SARS-CoV-2 i wciąż trwającej pandemii COVID-19.
Badanie SARS-CoV-2 wymaga pracochłonnych technik i drugorzędnych podejść do identyfikacji obecności wirusa w zakażonych komórkach i/lub zweryfikowanych zwierzęcych modelach infekcji. Zastosowanie genetyki odwrotnej pozwoliło na wytworzenie rekombinowanych wirusów, które odpowiadają na ważne pytania z zakresu biologii infekcji wirusowych. Na przykład techniki genetyki odwrotnej dostarczyły środków do odkrycia i zrozumienia mechanizmów infekcji wirusowych, patogenezy i choroby. Podobnie, podejścia oparte na genetyce odwrotnej utorowały drogę do inżynierii rekombinowanych wirusów pozbawionych białek wirusowych, aby zrozumieć ich udział w patogenezie wirusa. Ponadto techniki genetyki odwrotnej wykorzystano do wygenerowania rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję genów reporterowych do zastosowań in vitro i in vivo, w tym do identyfikacji podejść profilaktycznych i/lub terapeutycznych w leczeniu infekcji wirusowych. Białka fluorescencyjne i bioluminescencyjne są najczęściej stosowanymi genami reporterowymi ze względu na ich czułość, stabilność i łatwe wykrywanie w oparciu o ulepszenia nowych technologii25,26. W badaniach in vitro wykazano, że białka fluorescencyjne służą jako lepsza opcja do lokalizacji wirusów w zakażonych komórkach, podczas gdy lucyferazy są wygodniejsze w badaniach ilościowych27,28,29. In vivo, lucyferazy są preferowane w stosunku do białek fluorescencyjnych w obrazowaniu całych zwierząt, podczas gdy białka fluorescencyjne są preferowane do identyfikacji zakażonych komórek lub obrazowania ex vivo30,31,32. Zastosowanie rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję reporterową posłużyło jako potężne narzędzie do badania wirusów w wielu rodzinach, w tym między innymi flawiwirusów, enterowirusów, alfawirusów, lentiwirusów, arenawirusów i wirusów grypy28,33,34,35,36.
Aby przezwyciężyć potrzebę wtórnego podejścia do badania SARS-CoV-2 i scharakteryzowania infekcji SARS-CoV-2 w czasie rzeczywistym in vivo, wygenerowaliśmy rekombinowany (r)SARS-CoV-2 kompetentny replikacyjnie, który wyraża białka bioluminescencyjne (nanolucyferaza, Nluc) lub fluorescencyjne (Venus) przy użyciu naszej wcześniej opisanej genetyki odwrotnej opartej na sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC), które są utrzymywane jako pojedyncza kopia u E. coli W celu zminimalizowania toksyczności sekwencji wirusa podczas jego namnażania się w bakteriach37,38. Warto zauważyć, że rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus wykazywały patogenność podobną do rSARS-CoV-2/WT in vivo. Wysoki poziom ekspresji Venus z rSARS-CoV-2/Venus pozwolił na wykrycie infekcji wirusowej w płucach zakażonych transgenicznych myszy K18 hACE2 za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS)39. Poziomy ekspresji Wenus dobrze korelowały z mianami wirusa wykrywanymi w płucach, co wskazuje na możliwość wykorzystania ekspresji Wenus jako ważnego substytutu zakażenia SARS-CoV-2. Korzystając z rSARS-CoV-2/Nluc, byliśmy w stanie śledzić dynamikę infekcji wirusowej w czasie rzeczywistym i długookresowo oceniać infekcję SARS-CoV-2 in vivo, stosując to samo podejście IVIS u myszy transgenicznych K18 hACE2.

<table><tbody><tr><td>0,5% Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT)</td></tr><tr><td>1% DEAE-Dextran</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10% roztworem formaliny, neutralnie buforowanym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>5% wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Komórki nabłonka nerki afrykańskiej zielonej małpy (Vero E6)</td><td></td><td>ATCC CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Instrumenty spektralne Obrazowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aura Oprogramowanie do obrazowania 3.2.0</td><td>Instrumenty spektralne Obrazowanie</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Przechowuj w 4 &stopniach; C</td></tr><tr><td>Woda klasy hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia gazem</td><td>Weterynaryjne systemy anestezjologiczne, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Cztero- do sześciotygodniowych samic transgenicznych myszy K18-hACE2</td><td>Jackson Laboratory</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism w wersji 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych MARS</td><td>Tabletki BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10</td><td>QUIP Laboratories</td><td>MBTAB1.5</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania lucyferazy Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Ten odczynnik służy do pomiaru aktywności Nluc. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/L-glutamina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Evolution homogenizator</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkanek miękkich CK14 &ndash; 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, peroksydaza</td><td>Zestaw ABC Vector Laboratories</td><td>PK-4002</td><td>i zestaw substratu peroksydazy DAB</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych k18 hace2 przy użyciu rekombinowanego sars-cov-2 z ekspresją reporterową

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) została wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Do tej pory SARS-CoV-2 był odpowiedzialny za ponad 242 miliony zakażeń i ponad 4,9 miliona zgonów na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych wirusów, badanie SARS-CoV-2 wymaga zastosowania metod eksperymentalnych w celu wykrycia obecności wirusa w zakażonych komórkach i/lub w modelach zwierzęcych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy rekombinowany (r)SARS-CoV-2 z kompetencjami replikacyjnymi, który wykazuje ekspresję białek bioluminescencyjnych (nanolucyferazy, Nluc) lub fluorescencyjnych (Wenus). Te rSARS-CoV-2 wykazujące ekspresję reporterową umożliwiają śledzenie infekcji wirusowych in vitro i in vivo w oparciu o ekspresję genów reporterowych Nluc i Venus. W niniejszym badaniu opisano zastosowanie rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus do wykrywania i śledzenia zakażenia SARS-CoV-2 we wcześniej opisanym transgenicznym mysim modelu zakażenia K18 ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2) przy użyciu systemów obrazowania in vivo (IVIS). Te rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus wykazują patogenność podobną do rSARS-CoV-2/WT i replikację wirusa in vivo. Co ważne, ekspresja Nluc i Venus pozwala nam bezpośrednio śledzić infekcje wirusowe in vivo i ex vivo, u zakażonych myszy. Te rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus stanowią doskonałą opcję do badania biologii SARS-CoV-2 in vivo, zrozumienia infekcji wirusowej i związanej z nią choroby COVID-19 oraz określenia skutecznych metod profilaktycznych i/lub terapeutycznych w celu zwalczania zakażenia SARS-CoV-2.

Zakażenie rSARS-CoV-2/Nluc u myszy transgenicznych K18 hACE2 (Rycina 1 i 2) 
Rycina 1A przedstawia schematyczne ujęcie rSARS-CoV-2/WT (góra) oraz rSARS-CoV-2/Nluc (dół) wykorzystanych do oceny zakażeń in vivo. Rycina 1B pokazuje schematyczny przebieg procedury zastosowanej w celu oceny dynamiki zakażenia rSARS-CoV-2/Nluc u myszy transgenicznych K18 hACE2. Samice myszy transgenicznych K18...

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Nasz protokół opisywał zastosowanie rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją fluorescencyjną lub luminescencyjną do obrazowania na żywo in vivo i ex vivo, wykrywania wirusa i śledzenia wirusa w transgenicznym mysim modelu K18 ludzkiej myszy ACE2 zakażenia SARS-CoV-2. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie i możliwość wykrywania i śledzenia wirusów w badaniach in vivo i ex vivo SARS-CoV-2 w transgenicznym modelu myszy transgenicznej K18 ACE2. Zastosowanie obrazowania in vivo SARS-CoV-2 w transgenicznym modelu myszy transgenicznej K18 ACE2 stanowi doskonałą opcję oceny środków terapeutycznych w leczeniu zakażenia SARS-CoV-2 in vivo.Wdrożenie reporterów SARS-CoV-2 stanowi doskonałą opcję do oceny patogenności, replikacji wirusa i trofizmu in vivo. W przypadku badań in vivo z lucyferazy eksprymującej SARS-CoV-2 zaleca się golenie myszy i szybkie obrazowanie po wstrzyknięciu substratu w celu poprawy sygnału bioluminescencji. Rozpocznij monitorowanie bioluminescencji, uruchamiając system obrazowania in vivo lub IVIS i ustawiając parametry, kliknij tryb obrazu na Bioluminescencja, a następnie otwórz filtr i ustaw czas ekspozycji na Auto.Następnie wyjmij już ogoloną i znieczuloną mysz z komory izolacyjnej i użyj igły o rozmiarze 25, aby retroorbitalnie podać myszy 100 mikrolitrów substratu lucyferazy rozcieńczonego od 1 do 10 w PBS. Następnie umieść mysz z powrotem w komorze izolacyjnej, przenieś komorę izolacyjną do urządzenia IVIS, które jest wyposażone w element grzewczy zapobiegający hipotermii, i zamknij drzwiczki kamery IVIS, aby zainicjować obrazowanie, wybierając opcję Acquire w programie. Aby przeanalizować uzyskane obrazy bioluminescencyjne, użyj narzędzia ROI lub narzędzia do obszaru zainteresowania w oprogramowaniu, aby wyznaczyć dokładny sygnał i zmierzyć strumień.Uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw parametry. Kliknij tryb obrazu na Fluorescencja, ustaw wzbudzenie na 500 nanometrów i filtry emisyjne na 530 nanometrów i ustaw czas ekspozycji na Auto. Przeprowadź nekroskopię i wytnij płuca od myszy.Umieść wycięte płuca w 6-dołkowej płytce zawierającej dwa mililitry 1X PBS i spłucz w celu usunięcia nadmiaru krwi. Zdezynfekuj i wyczyść narzędzia chirurgiczne między próbkami przy użyciu 70% etanolu. Po zainicjowaniu urządzenia IVIS należy umieścić płuca na czarnym prześcieradle i oddzielić tkanki od siebie.Następnie umieść tacę w komorze izolacyjnej wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, a następnie przenieś komorę izolacyjną do IVIS. Zamknij drzwiczki imagera IVIS i kliknij przycisk Pobierz, aby uruchomić system obrazowania. Aby przeanalizować fluorescencję, użyj narzędzia ROI i narysuj ROI wokół każdego z poszczególnych płuc.Zmierz każdy zwrot z inwestycji ręcznie, a następnie użyj podanych średnich wartości wydajności promieniowania i odejmij od pozorowanych zainfekowanych myszy. Po zakończeniu obrazowania umieść tkanki w krioprobówce do zamrożenia suchego lodu, aby przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego przetworzenia. Wykorzystując supernat uzyskany z homogenatów tkankowych, wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie i zainfekuj zlewające się monowarstwy komórek Vero E6 jednym mililitrem każdego rozcieńczenia supernatantu w trzech powtórzeniach.Pozwól wirusowi adsorbować się przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po zakończeniu umyj komórki jednym mililitrem 1X PBS, a następnie inkubuj komórki w dwóch mililitrach pożywki poinfekcyjnej zawierającej 1% agaru w nawilżanym inkubatorze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po inkubacji inaktywuj płytki w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że cała płytka jest zanurzona.Wyjmij płytki z trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego i umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zablokuj permeabilizowane komórki jednym mililitrem 2,5 albuminy surowicy bydlęcej lub BSA i PBS przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie inkubację w jednym mililitrze jednego mikrograma na mililitr białka nukleokapsydu SARS-CoV, reaktywnego krzyżowo przeciwciała monoklonalnego 1C7C7 rozcieńczonego w 2,5 BSA przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem 1X PBS i rozwiń blaszki za pomocą zestawów substratów peroksydazy ABC i diaminobenzenu lub DAB zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie oblicz miana wirusa jako jednostki tworzące blaszkę na mililitr.W badaniu zaobserwowano, że bioluminescencyjna nanolucyferaza lub Nluc była łatwa do wykrycia i myszy zakażone rSARS-CoV-2 Nluc, ale nie te zakażone rSARS-CoV-2 typu dzikiego lub pozorowanego. Analizy ilościowe wykazały intensywność Nluc w różnych dniach po zakażeniu. Poważne zmiany na powierzchni płuc myszy zakażonych rSARS-CoV-2 Nluc były porównywalne z tymi w grupie zakażonych rSARS-CoV-2 typu dzikiego.Ponadto wykryte miana wirusa i myszy zakażone rSARS-CoV-2 Nluc były porównywalne z tymi zakażonymi rSARS-CoV-2 typu dzikiego we wszystkich narządach w różnych dniach po zakażeniu. W tym samym czasie aktywność Nluca wykryto tylko w narządach myszy zakażonych rSARS-CoV-2 Nluc. Oddzielna grupa pozorowanych myszy zakażonych i zakażonych wirusem była monitorowana przez 12 dni pod kątem zmian w masie ciała i przeżyciu.Myszy zakażone rSARS-CoV-2 Nluc i rSARS-CoV-2 typu dzikiego straciły do 25% masy ciała i wszystkie ulegają infekcji wirusowej w okresie od siedmiu do ośmiu dni po zakażeniu. Po zakażeniu rSARS-CoV-2 Venus, ekspresję Wenus łatwo wykryto we wszystkich płucach myszy zakażonych rSARS-CoV-2 Venus, ale nie tych zakażonych rSARS-CoV-2 typu dzikiego lub pozorowanego. Analizy ilościowe wykazały, że intensywność Wenus osiąga szczyt dwa dni po zakażeniu i zmniejsza się w trakcie infekcji i płuc zakażonych myszy.Obrazy powierzchni płuc ujawniły poważne zmiany u myszy zakażonych rSARS-CoV-2 Venus były porównywalne z tymi u myszy zakażonych rSARS-CoV-2 typu dzikiego. Ponadto zakażenie rSARS-CoV-2 Venus spowodowało porównywalne miana wirusa do tych obserwowanych u myszy zakażonych rSARS-CoV-2 typu dzikiego we wszystkich narządach. Myszy zakażone rSARS-CoV-2 Venus i rSARS-CoV-2 typu dzikiego straciły do 25% masy ciała i uległy infekcji wirusowej do dziewiątego dnia po zakażeniu, nie tracąc przeżycia.Wyniki z ekspresji reportera SARS-CoV-2 okazały się ważnymi substytutami infekcji wirusowej. W ten sposób może to prowadzić do szybkiej identyfikacji i oceny środków zaradczych w leczeniu zakażenia SARS-CoV-2.

live-imaging-quantification-viral-infection-k18-hace2-transgenic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Ten film demonstruje metodę śledzenia infekcji wirusowych w modelach mysich przy użyciu rekombinowanego wirusa grypy A z ekspresją białka rekombinowanego i fluorescencji, wyrażającego bi-reporter. Metoda ta umożliwia prowadzenie badań zarówno in vivo, jak i ex vivo, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w dynamikę wirusa i efekty interwencji.

Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji reakcji łańcuchowej (HCR)-fluorescencji in situ (FISH) do wizualizacji przestrzennego rozkładu subgenomowego RNA SARS-CoV-2. Połączenie HCR z technikami immunofluorescencji może dostarczyć informacji na temat interakcji gospodarz-wirus na poziomie pojedynczej komórki.

Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Poznaj metodę obrazowania na żywo infekcji SARS-CoV-2 u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu wirusów reporterowych. Technika ta umożliwia skuteczną ocenę terapii przeciwwirusowych in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Przeglądaj więcej filmów