Name: Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka siatkówki myszy zoptymalizowaną pod kątem wysokiego plonu i żywotności. Technika umożliwia sekwencjonowanie nowej generacji oraz badanie mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Ośrodkowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Wirginii, Centrum Analizy Genomowej Uniwersytetu Wirginii oraz Ośrodkowi Analizy Genomu i Technologii Uniwersytetu Wirginii za ich wysiłek, wiedzę i rady w przyczynieniu się do prezentowanych eksperymentów. Badanie to zostało sfinansowane z grantów NIH dla N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), SC (T32 HL007284), KW (R01 HL142650) i K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach wymienione w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Yale oraz Uniwersytetu Wirginia.
1. Pozyskanie oczu myszy w celu izolacji siatkówki
<ol>
	<li>Przygotować 1x lodowaty PBS i dodać 500 μL do każdego dołka płytki 48-dołkowej.</li>
	<li>Uśmiercić noworodki myszy w szóstym dniu po urodzeniu (P6) zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi. W tym doświadczeniu lęgi składające się z około 4-8 noworodków myszy są uśmiercane w dniu P6 poprzez inhalację izofluranem przez co najmniej trzy minuty po zatrzymaniu oddechu, a następnie poddawane dekapitacji.</li>
	<li>Wyjąć oczy z każdej z myszy. Odciąć skórę i błonę nad okiem, wykonując cięcie prostopadle do powieki za pomocą nożyczek sekcyjnych. Następnie użyć pincety, aby delikatnie nacisnąć obszar powyżej i poniżej oka, tak aby oko wysunęło się z oczodołu.
	<ol>
		<li>Ostrożnie ucisnąć pincetą obszar pod okiem i przeciąć nerw wzrokowy, który utrzymuje oko w miejscu. Następnie umieścić każde oko w płytce 48-dołkowej w przygotowanym 1x lodowatym PBS do czasu zakończenia pobierania wszystkich próbek. 
		UWAGA: Należy używać jednego dołka na mysz, umieszczając oba oczy z jednej myszy w tym samym dołku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja tkanki siatkówki myszy
<ol>
	<li>Napełnij szalkę Petriego, wyłożoną na dnie podkładką do sekcji, 500 μL lodowatego 1x PBS, aby zanurzyć oczy, a następnie umieść ją pod mikroskopem sekcyjnym ustawionym na powiększenie 4.0x.
	<ol>
		<li>Zawieś oczy w podkładce do sekcji, używając pipety transferowej z szeroką końcówką, aby nie uszkodzić tkanek. 
		UWAGA: Upewnij się, że oczy są całkowicie przykryte PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając dwóch precyzyjnych pincet sekcyjnych, przytrzymaj nerw wzrokowy jedną z pincet dla stabilizacji, a drugą przebij otwór w komorze przedniej w miejscu połączenia rogówki i twardówki (Ryc. 1B). Rozdarcia wykonaj w okręgu, obejmując około 75% obwodu rogówki.
	<ol>
		<li>Nadal trzymając nerw wzrokowy jedną z pincet, użyj drugiej pincety, aby delikatnie oddzielić twardówkę od tkanki siatkówki.</li>
		<li>Podobnie jak powyżej, użyj drugiej pincety, aby delikatnie oddzielić ciało szkliste od tkanki siatkówki.</li>
		<li>Ponownie, używając drugiej pincety, delikatnie usuń soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego, które nie zostały usunięte wraz z ciałem szklistym. Aby to zrobić, wprowadź otwartą pincetę do wnętrza siatkówki, niemal dotykając jej, zamknij pincetę, aby chwycić soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego, a następnie wyciągnij pincetę z siatkówki. Czynność tę można powtarzać do momentu usunięcia wszystkich naczyń. 
		UWAGA: Splot hialoidalny przypomina przezroczystą, pajęczynowatą strukturę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL ilością 500 μL lodowatego 1x PBS i umieść w nich siatkówki. Izoluj wszystkie siatkówki z oczu i umieszczaj je w lodowatym PBS przed przejściem do kolejnego kroku. 
	UWAGA: Używaj jednej probówki na mysz, tak aby dwie siatkówki z tej samej myszy znajdowały się w jednej probówce. Jeśli tkanka siatkówki zostanie przerwana, przenieś ją w kilku fragmentach. Całkowity czas sekcji tkanki siatkówki dla miotu myszy powinien wynieść od 15 do 60 min, licząc od momentu eutanazji do końcowej izolacji tkanki siatkówki.</li>
</ol>
<img alt="Proces izolacji tkanki siatkówki z użyciem FACS; obejmuje schematy przekroju oka i obrazy pelletu komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63133/63133fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu izolacji. (A) Schemat osi czasu izolacji z szacowanym czasem dla każdego etapu: izolacja tkanki siatkówki, trawienie, barwienie przeciwciałami, FACS oraz okno żywotności komórek. (B) Instrukcja krok po kroku izolacji tkanki siatkówki z oka, z ponumerowanymi etapami sekcji: 1) przebicie rogówki, 2) rozerwanie rogówki, 3) rozerwanie twardówki, 4) usunięcie twardówki z siatkówki, 5) dalsze usuwanie twardówki i tkanki łącznej z siatkówki, 6) usunięcie ciała szklistego i naczyń ciała szklistego z siatkówki. (C) Reprezentatywne obrazy tkanki siatkówki podczas różnych etapów trawienia: przed trawieniem, po trawieniu, pellet (czarne strzałki wskazują tkankę siatkówki lub pellet komórkowy). Przedrukowano za zgodą Chavkin et al., opublikowano w S. Karger AG, Basel17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63133/63133fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
3. Trawienie tkanki siatkówki do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Przygotować 500 μL roztworu do trawienia na każdą parę wyizolowanych siatkówek. Dodać FBS i kolagenazę typu II do DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 10% FBS i 1 mg/mL kolagenazy typu II. Wymieszać i ogrzać roztwór do 37 °C w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Usunąć nadmiar PBS z probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL, ostrożnie odpipetowując płyn. Pozostawić ilość PBS wystarczającą do całkowitego pokrycia tkanki siatkówki, około 100 μL w każdej probówce.</li>
	<li>Dodać 500 μL roztworu do trawienia do każdej probówki z tkanką siatkówki (Rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Używając pipety P1000 z odpowiednim końcem, wykonać pięciokrotne pipetowanie w górę i w dół, aby wymieszać tkankę siatkówki z roztworem do trawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować mieszaninę do trawienia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
	<ol>
		<li>Używając pipety P1000 z odpowiednim końcem, pipetować mieszaninę do trawienia w górę i w dół co 5 min. Po inkubacji tkanka siatkówki powinna rozpaść się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a mieszanina do trawienia powinna stać się mętna (Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zliczanie komórek
<ol>
	<li>Ustaw wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieść w niej probówki z mieszaniną trawienną. Odwirowaj mieszaninę trawienną przy 375 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń supernatant roztworu trawiennego za pomocą pipety. Nie naruszaj osadu komórkowego (Rysunek 1C). Resuspenduj osad w 500 μL lodowatego 1x PBS, delikatnie mieszając go pipetą w górę i w dół.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hematocytometru pod mikroskopem. 
	UWAGA: Liczba komórek wynosi w przybliżeniu 1 x 106 komórek z dwóch siatkówek.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki zostały prawidłowo zresuspendowane poprzez delikatne mieszanie, a następnie odlicz 20 μL zawiesiny komórkowej do trzech probówek do barwienia kontrolnego (probówka 1: kontrola IgG, probówka 2: kontrola CD31 i probówka 3: kontrola CD45), zgodnie z wcześniejszym opisem i zastosowaniem17,18.</li>
	<li>Ustaw wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieść w niej probówki zawierające komórki. Odwirowaj komórki przy 375 x g przez 5 min.</li>
</ol>
5. Immunobarwienie komórek przeciwciałami
<ol>
	<li>Przygotować 100 μL buforu do barwienia na dwie barwione siatkówki oraz cztery probówki kontrolne. Do buforu HBSS dodać FBS, HEPES i D-glukozę do uzyskania stężenia końcowego 10% FBS, 10 mM HEPES i 1 mg/mL D-glukozy.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała sprzężone z fluorochromem przeciwko CD31 i CD45. Dodać przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 do buforu do barwienia (probówka 1: tylko przeciwciało IgG, probówka 2: tylko przeciwciało CD31, probówka 3: tylko przeciwciało CD45). Dodać 1 μL przeciwciała na 100 μL buforu do barwienia, aby uzyskać końcowe stężenie przeciwciał 2 μg/mL.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć PBS z przemytego osadu komórkowego za pomocą pipety.</li>
	<li>Resuspender osad w 100 μL roztworu do barwienia przeciwciałami na każde 0,5 x 106 komórek.
	<ol>
		<li>Inkubować zawiesinę pojedynczych komórek z roztworem do barwienia przeciwciałami przez 30 min na lodzie, w ciemności. Opukiwać probówki co 10 min, aby delikatnie wymieszać komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)
<ol>
	<li>Ustaw wirówkę stołową na 4 °C i umieść w niej probówki zawierające komórki. Odwiruj komórki przy 375 x g przez 5 min.
	<ol>
		<li>Odlej supernatant i resuspenderuj komórki w 500 μL 1x PBS w celu ich przemycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw wirówkę stołową na 4 °C i umieść w niej probówki zawierające komórki. Odwiruj komórki przy 375 x g przez 5 min</li>
	<li>Przygotuj 1,5 mL buforu do FACS (1% FBS w 1x PBS).
	<ol>
		<li>Odlej supernatant i resuspenderuj osad komórkowy w 300 μL buforu do FACS, delikatnie mieszając za pomocą pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj jodek propidyny (PI) do probówek z próbkami zawierającymi bufor do FACS do uzyskania końcowego stężenia 0,5 μg/mL. PI służy jako marker żywotności.</li>
	<li>Przenieś i połącz zawiesiny komórkowe do probówek testowych o pojemności 5 mL, używając nakrętki z filtrem do komórek. Nakrętka powinna zawierać filtr 35 μm; zawiesiny komórkowe można pipetować bezpośrednio na filtr.
	<ol>
		<li>Przechowuj probówki do FACS w ciemności na lodzie, a następnie przenieś je do sortera komórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Konfiguracja instrumentu FACS
<ol>
	<li>Zainstaluj dyszę 100 µm w urządzeniu FACS. 
	UWAGA: Dysza tej wielkości minimalizuje objętość zbieranego materiału i maksymalizuje gęstość izolowanych komórek.</li>
	<li>Przygotuj 250 μL 1x PBS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL jako probówce do zbierania, która zostanie zainstalowana w urządzeniu FACS.</li>
</ol>
8. Izolacja żywych komórek śródbłonka za pomocą FACS
<ol>
	<li>Włącz instrument FACS oraz komputer. Kliknij ikonę oprogramowania FACS, aby uruchomić program na komputerze w celu sterowania instrumentem FACS i jego obsługi. Przeprowadź rutynowe testy kontroli jakości.</li>
	<li>Wgraj próbki z barwieniem kontrolnym do instrumentu FACS, aby dostroić osie. Zacznij od komórek barwionych wyłącznie przeciwciałem IgG, aby wygenerować i dostroić FSC oraz SSC, następnie użyj przeciwciała CD31, aby wygenerować i dostroić CD31, a potem przeciwciała CD45, aby wygenerować i dostroić CD45. Zapisz dane z próbek kontrolnych.</li>
	<li>Wgraj zbarwione komórki z próbki do instrumentu FACS i przeprowadź analizę próbki.</li>
	<li>Wyznacz bramkę dla komórek na podstawie parametrów rozproszenia światła w przód i z boku (odpowiednio FSC-A i SSC-A) (Ryc. 2A). 
	UWAGA: Parametry FSC-A i SSC-A służą do wyboru komórek na podstawie ich rozmiaru, gęstości, ziarnistości, właściwości powierzchniowych i współczynnika załamania światła.</li>
	<li>Wyznacz bramkę dla komórek na podstawie FSC-A i FSC-H, aby zidentyfikować dublety komórkowe i zebrać wyłącznie pojedyncze komórki (Ryc. 2A). 
	UWAGA: Parametry FSC-A i FSC-H są wykorzystywane do wyboru pojedynczych komórek w oparciu o zasadę, że podczas rozproszenia światła w przód dublety komórkowe będą stanowiły krople o większym stosunku pola do wysokości.</li>
	<li>Wyznacz bramkę dla komórek na podstawie PI i SSC-A, aby zidentyfikować komórki żywe (Ryc. 2A). 
	UWAGA: Komórki żywe będą PI-ujemne.</li>
	<li>Za pomocą kontroli ustaw bramkę CD31+/CD45- i wyznacz bramkę dla komórek na podstawie CD31 i CD45 (Ryc. 2A,B).
	<ol>
		<li>Włóż probówkę odbiorczą zawierającą 250 μL buforu FACS.</li>
		<li>Rozpocznij sortowanie komórek CD31-dodatnich/CD45-ujemnych do zainstalowanej probówki odbiorczej.</li>
		<li>Przechowuj probówki odbiorcze na lodzie do dalszych analiz. Na tym etapie próbki mogą zostać poddane procesom do zastosowań w sekwencjonowaniu nowej generacji1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Wykonanie testu żywotności
<ol>
	<li>Wymieszaj 10 μL komórek z 10 μL 0,4% roztworu błękitu trypanowego w celu oceny żywotności komórek.</li>
	<li>Policz żywe komórki, nienosząc zabarwionej mieszaniny na szkiełko hemocytometru. Umieść szkiełko pod mikroskopem, aby dokładnie ocenić żywotność. Komórki zabarwione na niebiesko uznaj za nieżywe, a komórki bezbarwne za żywe.
	<ol>
		<li>Podziel liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć procent żywotności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Wykonanie analizy ekspresji genów
<ol>
	<li>Przygotować od 10 000 do 20 000 komórek na próbkę i przeprowadzić izolację RNA w celu analizy ekspresji genów w komórkach śródbłonka siatkówki myszy. Izolację RNA przeprowadza się przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu opartego na wytrącaniu RNA etanolem, a następnie wirowaniu i zastosowaniu kolumn membranowych do przemycia i elucji oczyszczonego RNA z lizatu komórkowego. Na tym etapie próbki mogą zostać poddane obróbce do wybranych zastosowań sekwencjonowania następnej generacji1.</li>
	<li>Przeprowadzić konwersję RNA do cDNA z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy oraz odpowiednich odczynników wspomagających19.</li>
	<li>Oznaczyć ilość cDNA za pomocą barwnika wiążącego się z DNA oraz urządzenia do ilościowej PCR (qPCR)20. Nanieść próbki cDNA na płytkę qPCR z 384 dołkami wraz z primerami do amplifikacji wybranych genów. Całkowita objętość reakcji powinna wynosić 10 µL, wliczając barwnik wiążący się z DNA, który posłuży do ilościowego oznaczenia amplifikacji genów.
	<ol>
		<li>Do pomiaru ekspresji genów należy zastosować primery bezpośrednie i odwrotne dla CD31, VE-Cadherin, CD45 oraz β-actin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystać próbkę do zastosowań w sekwencjonowaniu następnej generacji1.</li>
</ol>

<ol><li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).</li>
<li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li>
<li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li>
<li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Single+Cell+Methods%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li>
<li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
<li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li>
<li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li>
<li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+versus+venous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li>
<li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366(2016).</li>
<li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).</li>
<li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+PartB%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li>
<li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31%3A+beyond+a+marker+for+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li>
<li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li>
<li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li>
<li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li>
<li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+is+required+for+CNS%2C+but+not+non-CNS%2C+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li>
<li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li>
<li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations%3A+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li>
<li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049(2019).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li>
<li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li>
<li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li>
<li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li>
<li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).</li>
<li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li>
<li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCENIC%3A+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych istotnych informacji.

Protokół ten opisuje metodę izolacji komórek śródbłonka z postnatalnej mysiej tkanki siatkówki, która została zoptymalizowana pod kątem wysokiej liczby komórek, czystości i żywotności. Czystość komórek uzyskuje się przez izolację FACS populacji komórek śródbłonka z strawionej zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą barwienia immunologicznego CD31+/CD45-. Jakość izolacji określa się ilościowo w testach żywotności za pomocą barwienia błękitem trypanowym i ekspresji genów za pomocą qPCR dla CD31, CD45 i VE-kadheryny (chocia...

Wysoka przepustowość sekwencjonowania kwasów nukleinowych za pomocą metod sekwencjonowania nowej generacji znacznie poszerzyła wiedzę badaczy na temat biologii molekularnej i komórkowej. Te zaawansowane techniki obejmują sekwencjonowanie RNA całego transkryptomu, sekwencjonowanie DNA docelowych regionów w celu identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), sekwencjonowanie DNA związanych czynników transkrypcyjnych w sekwencjonowaniu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) lub otwarte regiony chromatyny w teście sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC) oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki1. W biologii naczyniowej postępy te pozwoliły naukowcom wyjaśnić skomplikowane mechanizmy rozwoju i choroby, a także rozróżnić wzorce ekspresji genów wzdłuż kontinuum różnych fenotypów2,3. Przyszłe eksperymenty mogą jeszcze bardziej zdefiniować złożone mechanizmy poprzez połączenie sekwencjonowania nowej generacji z ocenianymi modelami rozwoju naczyń krwionośnych, ale metody przygotowania próbek muszą być kompatybilne z zaawansowanymi technikami sekwencjonowania.
Jakość, dokładność i powtarzalność metod sekwencjonowania nowej generacji zależą od metody przygotowania próbki. Podczas izolowania podzbioru komórek lub generowania zawiesin pojedynczych komórek z tkanek, optymalne metody trawienia i oczyszczania są niezbędne do maksymalizacji liczby komórek, żywotności i czystości populacji komórek4,5. Wymaga to równowagi w metodzie trawienia: silne trawienie jest konieczne, aby uwolnić komórki z tkanki i uzyskać wystarczającą liczbę komórek do dalszych podejść, ale żywotność komórek będzie negatywnie naruszona, jeśli trawienie będzie zbyt silne6,7. Ponadto czystość populacji komórek jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych wyników i dokładnej analizy danych, co można osiągnąć za pomocą FACS. Podkreśla to znaczenie optymalizacji metod izolacji komórek w celu zastosowania sekwencjonowania nowej generacji do ustalonych modeli rozwoju naczyń krwionośnych.
Dobrze scharakteryzowanym modelem do badania rozwoju naczyń krwionośnych jest mysi model rozwoju naczyniowego. Unaczynienie siatkówki myszy rozwija się po urodzeniu w dwuwymiarowym splocie powierzchownym, z początkowym angiogennym kiełkowaniem nerwu wzrokowego widocznym w dniu pourodzeniowym (P)3, przodem angiogennym z komórkami łodygi i wierzchołka oraz początkowym dojrzewaniem naczynia widocznym w P6 i dojrzewaniem splotu naczyniowego widocznym po P98,9. Podczas przebudowy początkowego splotu naczyniowego, komórki śródbłonka przechodzą specyfikację w kierunku fenotypów tętniczych, naczyń włosowatych i żylnych w różnych naczyniach, aby wytworzyć sieć krążenia10,11. Dlatego metoda ta pozwala naukowcom na wizualizację tworzenia się angiogennych splotów naczyniowych oraz specyfikacji i dojrzewania śródbłonka tętniczo-żylnego w różnych punktach czasowych podczas rozwoju9. Ponadto model ten zapewnia metodę badania wpływu transgenicznej manipulacji na angiogenezę i rozwój splotu naczyniowego, która została zastosowana do badania rozwoju naczyń, malformacji tętniczo-żylnych i neowaskularyzacji indukowanej tlenem12,13,14,15,16. Aby połączyć metody sekwencjonowania nowej generacji z modelem rozwoju naczyń krwionośnych siatkówki myszy, konieczny jest zoptymalizowany protokół izolacji komórek śródbłonka z tkanki siatkówki.
Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę trawienia tkanki siatkówki od myszy w P6 w celu maksymalizacji wydajności, czystości i żywotności komórek. Tkanka siatkówki jest izolowana od myszy P6, trawiona przez 20 minut, barwiona immunologicznie dla CD31 i CD45 i oczyszczana przez FACS w celu wyizolowania jednokomórkowej zawiesiny komórek śródbłonka w ciągu około 2,5 godziny (<silna klasa = "xfig">Figura 1A). Stwierdzono, że te komórki śródbłonka zachowują wysoką żywotność przez 60 minut po izolacji17, co pozwala na przygotowanie biblioteki do metod sekwencjonowania nowej generacji. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki dla bramkowania FACS i wyników kontroli jakości z dwóch oddzielnych metod sekwencjonowania nowej generacji wykorzystujących ten protokół izolacji: sekwencjonowania RNA całego transkryptomu i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na zastosowanie podejść sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z modelem unaczynienia siatkówki w celu wyjaśnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

<table><tbody><tr><td>2 ml Eppendorf&nbsp; probówki safe-lock</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3352</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówki Falcon z sitkiem do komórek Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Naczynie hodowlane bez TC</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat IgG2a &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSChorus Software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCHORUS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSMelody Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSMELODY</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234115</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, indywidualnie pakowane, sterylne</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety z podziałką</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Wosk do patelni preparacyjnej</td><td>Carolina</td><td>629100</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparacji</td><td>Narzędzia do nauki o napięciu</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy M165 FC</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-052</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Probówki do mikrowirówek Flex-Tubes 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do drobnego rozwarstwiania</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-00</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630130</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Zestaw do syntezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp General Purpose Deluxe Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD20</td><td></td></tr><tr><td>Podkład: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Elementarz: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Elementarz: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Elementarz: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Podkład: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Podkład: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Podkład: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>jodku propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend Micro 21R, chłodzona</td><td>ThermoFisher</td><td>75002477</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Green iTaq Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V450 Szczurzy anty-mysz CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>V450 Szczur IgG2b i kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>560457</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Ostatnie ulepszenia w sekwencjonowaniu nowej generacji poszerzyły wiedzę badaczy na temat biologii molekularnej i komórkowej, a kilka badań ujawniło nowe paradygmaty w biologii naczyniowej. Zastosowanie tych metod do modeli rozwoju naczyń krwionośnych wymaga optymalizacji technik izolacji komórek z tkanek embrionalnych i postnatalnych. Wydajność, żywotność i czystość komórek muszą być maksymalne, aby uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki z metod sekwencjonowania nowej generacji. Model unaczynienia siatkówki noworodków myszy jest wykorzystywany przez naukowców do badania mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych. Naukowcy wykorzystali ten model do zbadania mechanizmów angiogenezy i specyfikacji losu tętniczo-żylnego podczas tworzenia i dojrzewania naczyń krwionośnych. Zastosowanie technik sekwencjonowania nowej generacji do badania modelu rozwoju naczyń krwionośnych siatkówki wymaga optymalizacji metody izolacji komórek śródbłonka siatkówki, która maksymalizuje wydajność, żywotność i czystość komórek. Protokół ten opisuje metodę izolacji, trawienia i oczyszczania tkanki siatkówki myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Wyniki wskazują, że oczyszczona przez FACS populacja komórek śródbłonka CD31 + / CD45 jest wysoce wzbogacona o ekspresję genów komórek śródbłonka i nie wykazuje zmian w żywotności przez 60 minut po FACS. Uwzględniono reprezentatywne wyniki podejść do sekwencjonowania nowej generacji na komórkach śródbłonka wyizolowanych tą metodą, w tym sekwencjonowania masowego RNA i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, wykazując, że ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki jest kompatybilna z aplikacjami sekwencjonowania nowej generacji. Ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki pozwoli na zastosowanie zaawansowanych technik sekwencjonowania w celu ujawnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

Trawienie tkanki siatkówki oraz immunostaining na CD31 i CD45 pozwalają na zidentyfikowanie populacji komórek śródbłonka CD31+/CD45- po bramkowaniu na komórki, pojedyncze komórki oraz żywotność (Rysunek 2A). Immunostaining na CD45 jest niezbędny do wyeliminowania komórek CD31+/CD45+, do których należą płytki krwi oraz niektóre leukocyty21. Dla każdego eksperymentu należy przeprowadzić kontrole w celu wykazania swoistości przeciwciał i wyznaczenia strategii bramkowania...

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki pozwoli na zastosowanie zaawansowanych technik sekwencjonowania w celu ujawnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem wysokiego stopnia żywotności i czystości, które są niezbędne w zastosowaniach sekwencjonowania nowej generacji. Procedurę zademonstruje Shelby Cain, doktorantka z Hershey Laboratory.Rozpocznij usuwanie oczu od uśpionej myszy noworodka, odcinając skórę i błonę nad okiem prostopadłym nacięciem do powieki za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie użyj kleszczy, aby docisnąć powyżej i poniżej oka, aby oko wysunęło się z oczodołu. Ostrożnie ściśnij pod okiem kleszczemi i przetnij nerw wzrokowy, który utrzymuje oko przyczepione.Następnie umieść oba oczy myszy w dołku 48-dołkowej płytki w świeżo przygotowanym, lodowatym PBS, aż do zakończenia zbiorów. Aby wyizolować tkankę siatkówki myszy, zawieś oczy w podkładce preparacyjnej na szalce Petriego wypełnionej 500 mikrolitrami lodowatego PBS za pomocą podkładki z rurką transferową z szeroką końcówką. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, przytrzymaj nerw wzrokowy jednym cienkim kleszkiem i użyj drugich kleszczyków, aby przebić otwór przez przednią komorę oka, w której łączą się rogówka i twardówka.Następnie rozerwij otwór w kółko około 75% drogi wokół rogówki. Trzymając nerw wzrokowy jednym kleszkiem, użyj drugich kleszczy, aby delikatnie oderwać twardówkę i ciało szkliste od tkanki siatkówki. Aby usunąć naczynia soczewki i splotu hialoidalnego, sięgnij do siatkówki otwartymi kleszczami, aż prawie jej dotkniesz, a następnie zamknij kleszcze, aby chwycić i wyciągnąć soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego z siatkówki.Po usunięciu wszystkich naczyń umieść siatkówki w dwóch mililitrowych probówkach wirówkowych wypełnionych 500 mikrolitrami jednego x lodowatego PBS. Usuń nadmiar PBS z dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety, pozostawiając około 100 mikrolitrów PBS w probówce, aby całkowicie pokryć tkankę siatkówki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wytrawiającego do probówki.Za pomocą pipety P1000 i końcówki pipety pięciokrotnie pipetować w górę i w dół tkankę siatkówki w roztworze wytrawiającym. Po zakończeniu inkubuj mieszaninę wytrawiającą w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, pipetując mieszaninę wytrawiania w górę iw dół co pięć minut, jak wyjaśniono wcześniej. Po inkubacji tkanka siatkówki rozpuści się w zawiesinę jednokomórkową, powodując, że mieszanina trawienna stanie się mętna.Następnie granuluj komórki przez odwirowanie w 375 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć PBS z przemytego osadu komórkowego za pomocą pipetowania, a następnie wybarwić komórki immunologicznie, ponownie zawieszając osad w 100 mikrolitrach roztworu barwiącego przeciwciała na 0,5 razy 10 do szóstej komórki. Zawiesinę pojedynczej komórki inkubować z roztworem barwiącym przeciwciała przez 30 minut na lodzie w ciemności, stukając w probówkę co 10 minut, aby delikatnie wymieszać komórki.W przypadku sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, osadzaj komórki przez odwirowanie w stężeniu 375 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu umyć i zagnieździć komórki w 500 mikrolitrach PBS, jak opisano powyżej. A następnie ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub buforu FACS, delikatnie mieszając z pipettą.Następnie dodaj jodek propidyny lub PI jako marker żywotności do probówek z próbkami zawierających bufor FACS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mikrograma na mililitr. Za pomocą pipety przenieś zawiesiny komórek przez zatrzask sitka zawierającego filtr 35 mikronów do pięciomililitrowej probówki. Po filtracji trzymaj probówkę FACS na lodzie w ciemności, a następnie przenieś probówkę do sortera komórek.Włącz przyrząd FACS i komputer, a następnie otwórz oprogramowanie FACS, aby uruchomić i obsługiwać przyrząd FACS. Wykonuj rutynowe testy kontroli jakości. Załaduj próbki barwienia kontrolnego do przyrządu FACS, aby wyregulować osie.Zacznij od komórek zawierających tylko przeciwciała IgG, aby wygenerować i dostosować rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne. Następnie przeciwciało CD31 tylko do generowania i dostosowywania CD31. A potem przeciwciało CD45 tylko do generowania i dostosowywania CD45.Zapisać dane z próbek kontrolnych. Następnie załaduj barwione komórki próbki do przyrządu FACS i uruchom próbkę. Chód komórek na podstawie parametrów rozproszenia do przodu lub FSC i rozrzutu bocznego lub SSC.Komórki chodu przez FSCA i FSCH do identyfikacji dubletów komórkowych i zbierania tylko pojedynczych komórek. Komórki chodu za pomocą PI i SSCA w celu identyfikacji żywotnych komórek. Wykonaj chód CD31 + CD45 z elementami sterującymi Wykonaj chód CD31 + CD45 z kontrolkami i chodzej komórki według CD31 i CD45.Włóż probówkę zbiorczą z 250 mikrolitrami buforu FACS do urządzenia. Następnie rozpocznij sortowanie komórek, które są CD31 + CD45 - do zainstalowanej probówki zbiorczej. Trzymaj probówki zbiorcze na lodzie do dalszej analizy.Próbki mogą być przetwarzane do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji. W badaniu zmiana czasu trawienia wpłynęła na wydajność komórek i procent żywotności. Czas trawienia wynoszący 20 minut zapewnił optymalną wydajność przy niskim odsetku niezdolnych do życia komórek śródbłonka.Późniejsze barwienie jodkiem propidyny wykazało, że wyizolowane komórki śródbłonka pozostawały żywotne przez 60 minut po izolacji. Czystość populacji komórek oceniano za pomocą ilościowej analizy PCR lub qPCRR ekspresji genów komórek śródbłonka wykazujących silne wzbogacenie genów komórek śródbłonka w populacji CD31+CD45. Oczyszczanie RNA z izolowanych komórek śródbłonka konwertujących i amplifikujących cDNA poprzez przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie Biblioteka cDNA zaowocowała identyfikacją ponad 16 000 genów w dziewięciu niezależnych próbkach.Spadek liczby transkryptów na milion odczytów lub TPM zaobserwowano w genach poniżej tego progu. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki izolowanych komórek śródbłonka siatkówki za pomocą linii 10x Genomics dało medianę 1 171 genów na komórkę, 15 247 wykrytych genów i medianę 2 255 unikalnych identyfikatorów molekularnych lub liczby UMI na komórkę w 917 komórkach. Krytycznymi etapami w tym protokole są izolacja tkanki siatkówki i trawienie tkanek, które powinny być wykonane dokładnie zgodnie z opisem, aby zoptymalizować wydajność i żywotność komórek.Izolowane komórki śródbłonka mogą być wykorzystywane w zaawansowanych technikach sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA całego transkryptomu, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny oraz test do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozy. Zastosowanie tej zoptymalizowanej metody w połączeniu z metodami sekwencjonowania nowej generacji i podejściami obliczeniowymi może dokładniej wyjaśnić mechanizmy wzajemnie połączonych szlaków sygnałowych, które regulują rozwój naczyń krwionośnych.

isolation-murine-retinal-endothelial-cells-for-next-generation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Ten film demonstruje procedurę izolowania mysich pierwotnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na przyszłe badania RGC, w celu lepszego zrozumienia poważnego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolowanie mysich komórek zwojowych siatkówki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka siatkówki myszy zoptymalizowaną pod kątem wysokiego plonu i żywotności. Technika umożliwia sekwencjonowanie nowej generacji oraz badanie mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów