Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki pozwoli na zastosowanie zaawansowanych technik sekwencjonowania w celu ujawnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem wysokiego stopnia żywotności i czystości, które są niezbędne w zastosowaniach sekwencjonowania nowej generacji. Procedurę zademonstruje Shelby Cain, doktorantka z Hershey Laboratory.

Rozpocznij usuwanie oczu od uśpionej myszy noworodka, odcinając skórę i błonę nad okiem prostopadłym nacięciem do powieki za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie użyj kleszczy, aby docisnąć powyżej i poniżej oka, aby oko wysunęło się z oczodołu. Ostrożnie ściśnij pod okiem kleszczemi i przetnij nerw wzrokowy, który utrzymuje oko przyczepione.

Następnie umieść oba oczy myszy w dołku 48-dołkowej płytki w świeżo przygotowanym, lodowatym PBS, aż do zakończenia zbiorów. Aby wyizolować tkankę siatkówki myszy, zawieś oczy w podkładce preparacyjnej na szalce Petriego wypełnionej 500 mikrolitrami lodowatego PBS za pomocą podkładki z rurką transferową z szeroką końcówką. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, przytrzymaj nerw wzrokowy jednym cienkim kleszkiem i użyj drugich kleszczyków, aby przebić otwór przez przednią komorę oka, w której łączą się rogówka i twardówka.

Następnie rozerwij otwór w kółko około 75% drogi wokół rogówki. Trzymając nerw wzrokowy jednym kleszkiem, użyj drugich kleszczy, aby delikatnie oderwać twardówkę i ciało szkliste od tkanki siatkówki. Aby usunąć naczynia soczewki i splotu hialoidalnego, sięgnij do siatkówki otwartymi kleszczami, aż prawie jej dotkniesz, a następnie zamknij kleszcze, aby chwycić i wyciągnąć soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego z siatkówki.

Po usunięciu wszystkich naczyń umieść siatkówki w dwóch mililitrowych probówkach wirówkowych wypełnionych 500 mikrolitrami jednego x lodowatego PBS. Usuń nadmiar PBS z dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety, pozostawiając około 100 mikrolitrów PBS w probówce, aby całkowicie pokryć tkankę siatkówki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wytrawiającego do probówki.

Za pomocą pipety P1000 i końcówki pipety pięciokrotnie pipetować w górę i w dół tkankę siatkówki w roztworze wytrawiającym. Po zakończeniu inkubuj mieszaninę wytrawiającą w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, pipetując mieszaninę wytrawiania w górę iw dół co pięć minut, jak wyjaśniono wcześniej. Po inkubacji tkanka siatkówki rozpuści się w zawiesinę jednokomórkową, powodując, że mieszanina trawienna stanie się mętna.

Następnie granuluj komórki przez odwirowanie w 375 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć PBS z przemytego osadu komórkowego za pomocą pipetowania, a następnie wybarwić komórki immunologicznie, ponownie zawieszając osad w 100 mikrolitrach roztworu barwiącego przeciwciała na 0,5 razy 10 do szóstej komórki. Zawiesinę pojedynczej komórki inkubować z roztworem barwiącym przeciwciała przez 30 minut na lodzie w ciemności, stukając w probówkę co 10 minut, aby delikatnie wymieszać komórki.

W przypadku sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, osadzaj komórki przez odwirowanie w stężeniu 375 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu umyć i zagnieździć komórki w 500 mikrolitrach PBS, jak opisano powyżej. A następnie ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub buforu FACS, delikatnie mieszając z pipettą.

Następnie dodaj jodek propidyny lub PI jako marker żywotności do probówek z próbkami zawierających bufor FACS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mikrograma na mililitr. Za pomocą pipety przenieś zawiesiny komórek przez zatrzask sitka zawierającego filtr 35 mikronów do pięciomililitrowej probówki. Po filtracji trzymaj probówkę FACS na lodzie w ciemności, a następnie przenieś probówkę do sortera komórek.

Włącz przyrząd FACS i komputer, a następnie otwórz oprogramowanie FACS, aby uruchomić i obsługiwać przyrząd FACS. Wykonuj rutynowe testy kontroli jakości. Załaduj próbki barwienia kontrolnego do przyrządu FACS, aby wyregulować osie.

Zacznij od komórek zawierających tylko przeciwciała IgG, aby wygenerować i dostosować rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne. Następnie przeciwciało CD31 tylko do generowania i dostosowywania CD31. A potem przeciwciało CD45 tylko do generowania i dostosowywania CD45.

Zapisać dane z próbek kontrolnych. Następnie załaduj barwione komórki próbki do przyrządu FACS i uruchom próbkę. Chód komórek na podstawie parametrów rozproszenia do przodu lub FSC i rozrzutu bocznego lub SSC.

Komórki chodu przez FSCA i FSCH do identyfikacji dubletów komórkowych i zbierania tylko pojedynczych komórek. Komórki chodu za pomocą PI i SSCA w celu identyfikacji żywotnych komórek. Wykonaj chód CD31 + CD45 z elementami sterującymi Wykonaj chód CD31 + CD45 z kontrolkami i chodzej komórki według CD31 i CD45.

Włóż probówkę zbiorczą z 250 mikrolitrami buforu FACS do urządzenia. Następnie rozpocznij sortowanie komórek, które są CD31 + CD45 - do zainstalowanej probówki zbiorczej. Trzymaj probówki zbiorcze na lodzie do dalszej analizy.

Próbki mogą być przetwarzane do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji. W badaniu zmiana czasu trawienia wpłynęła na wydajność komórek i procent żywotności. Czas trawienia wynoszący 20 minut zapewnił optymalną wydajność przy niskim odsetku niezdolnych do życia komórek śródbłonka.

Późniejsze barwienie jodkiem propidyny wykazało, że wyizolowane komórki śródbłonka pozostawały żywotne przez 60 minut po izolacji. Czystość populacji komórek oceniano za pomocą ilościowej analizy PCR lub qPCRR ekspresji genów komórek śródbłonka wykazujących silne wzbogacenie genów komórek śródbłonka w populacji CD31+CD45. Oczyszczanie RNA z izolowanych komórek śródbłonka konwertujących i amplifikujących cDNA poprzez przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie Biblioteka cDNA zaowocowała identyfikacją ponad 16 000 genów w dziewięciu niezależnych próbkach.

Spadek liczby transkryptów na milion odczytów lub TPM zaobserwowano w genach poniżej tego progu. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki izolowanych komórek śródbłonka siatkówki za pomocą linii 10x Genomics dało medianę 1 171 genów na komórkę, 15 247 wykrytych genów i medianę 2 255 unikalnych identyfikatorów molekularnych lub liczby UMI na komórkę w 917 komórkach. Krytycznymi etapami w tym protokole są izolacja tkanki siatkówki i trawienie tkanek, które powinny być wykonane dokładnie zgodnie z opisem, aby zoptymalizować wydajność i żywotność komórek.

Izolowane komórki śródbłonka mogą być wykorzystywane w zaawansowanych technikach sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA całego transkryptomu, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny oraz test do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozy. Zastosowanie tej zoptymalizowanej metody w połączeniu z metodami sekwencjonowania nowej generacji i podejściami obliczeniowymi może dokładniej wyjaśnić mechanizmy wzajemnie połączonych szlaków sygnałowych, które regulują rozwój naczyń krwionośnych.