Name: Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę analizy strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym do oceny bioenergetyki osteoblastów. Technika ta mierzy zużycie tlenu i produkcję ATP, ujawniając aktywność mitochondrialną i glikolityczną komórek kostnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Zdrowia (NIH), Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (NIAMS) Grant AR072123 oraz National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (do ERR).

<ol><li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li>
<li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li>
<li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073(2020).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT3%2FSOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li>
<li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li>
<li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).</li>
<li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li>
<li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li>
<li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li>
<li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+studies+of+bone+in+vitro%3A+I.+Normal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li>
<li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+studies+of+bone+in+vitro%3A+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li>
<li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li>
<li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li>
<li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRomero%2C+N+%22Quantifying+cellular+ATP+production+rate+using+agilent+seahorse+XF+technology%22">Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology</a>. , (2018).</li>
<li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1(2016).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918(2016).</li>
<li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081(2017).</li>
<li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).</li>
<li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer%3A+applications+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22GeroScience%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li>
<li>What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology+-+Series+A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>XF cell energy phenotype test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021).</li>
<li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidative+stress%3A+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).</li>
<li>XF ATP rate assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021).</li>
<li>XF cell mito stress test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021).</li>
<li>XF cell mito fuel flex test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750(2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li>
<li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004(2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKam%2C+Y+%22Normalization+of+agilent+seahorse+XF+data+by+in-situ+cell+counting+using+a+BioTek+cytation+5+application+note%22">Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note</a>. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analizator strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym może być używany do badania energetyki komórkowej w różnych warunkach. Protokół ilustruje skuteczną izolację BMSC, hodowlę komórek na odpowiednich płytkach do hodowli komórkowych oraz ich różnicowanie do dojrzałych osteoblastów, które można wykorzystać do różnych testów przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Ponadto szczegółowo wyjaśniono krytyczne etapy badania strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym, w tym hydratację wkł...

Tworzenie kości przez osteoblasty towarzyszy skoordynowana destrukcja lub resorpcja kości przez osteoklasty. Równowaga między osteoblastyczną formacją kości a resorpcją osteoklastyczną jest procesem sprzężonym, opisującym obrót lub przebudowę kości, co jest niezbędne dla homeostazy szkieletowej. Dysfunkcja osteoblastów prowadzi do upośledzenia formowania kości i skutkuje różnymi chorobami, w tym osteoporozą1,2,3. Różnicowanie ex vivo/in vitro mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSCs) w prekursory osteoblastów i dojrzałe osteoblasty prowadzi z czasem do tworzenia i odkładania zmineralizowanej macierzy kostnej w naczyniu hodowlanym4,5,6. Tworzenie kości przez osteoblasty wymaga znacznej ilości energii komórkowej. Wykazano w szczególności, że synteza i sekrecja kolagenu w dużym stopniu zależą od stosunku ATP:ADP w komórce, a transport i sekrecja zmineralizowanych pęcherzyków prawdopodobnie wymagają dodatkowego ATP7,8,9,10,11. Wielu badaczy udowodniło, że proces osteoblastogenezy oraz funkcja osteoblastów wymagają odpowiedniej podaży energii, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne związane z formowaniem kości12,13,14,15,16. Celem niniejszej metody jest zatem charakterystyka stanu bioenergetycznego pierwotnych mysich komórek zrębowych podczas różnicowania w osteoblasty przy użyciu analizatora przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym. Techniki te pomagają w lepszym zrozumieniu homeostazy szkieletowej, co w ostateczności może prowadzić do opracowania nowych opcji terapeutycznych zdolnych do leczenia zaburzeń szkieletu.
Analizator metabolicznego przepływu komórkowego w czasie rzeczywistym może być wykorzystywany do pomiaru szybkości zużycia tlenu (OCR) oraz szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w żywych osteoblastach, co odpowiada odpowiednio mitochondrialnej i glikolitycznej produkcji ATP. Podstawą tej metodologii jest fakt, że podczas glikolizy, w procesie przekształcania glukozy w mleczan, uwalniany jest jeden jon H+ na cząsteczkę mleczanu, co zmienia pH medium, co znajduje odzwierciedlenie w wartościach ECAR. Z kolei podczas cyklu TCA (cyklu kwasu trójkarboksylowego) fosforylacja oksydacyjna via mitochondria produkuje CO2 poprzez wykorzystywanie lub zużywanie tlenu, zatem monitorowanie OCR odzwierciedla ten proces metaboliczny. Analizator mierzy jednocześnie i w czasie rzeczywistym zarówno OCR, jak i ECAR w mikrośrodowisku zewnątrzkomórkowym, co stwarza ogromny potencjał w badaniu bioenergetyki komórkowej6,17. Ponadto przeprowadzanie tych testów jest stosunkowo proste i łatwo modyfikowalne w zależności od celu eksperymentalnego. Podobne techniki były stosowane w celu lepszego zrozumienia regulacji metabolicznej limfocytów T w układzie odpornościowym18,19, inicjacji i progresji nowotworów20, a także w badaniach nad wieloma innymi typami komórek przyczyniającymi się do zespołów metabolicznych21,22.
Zalety analizatora strumieni metabolicznych w czasie rzeczywistym w porównaniu do alternatywnych technik obejmują (1) możliwość pomiaru bioenergetyki komórkowej żywych komórek w czasie rzeczywistym, (2) zdolność do przeprowadzania analiz przy stosunkowo niewielkiej liczbie komórek (wymagane jest zaledwie 5 000 komórek), (3) porty wtryskowe umożliwiające równoległe wprowadzanie wielu substancji testowych w wysokoprzepustowym systemie 96-dołkowym, (4) zastosowanie zautomatyzowanego obrazowania komórek bez użycia znaczników radioaktywnych w celu normalizacji18,23,24. Poniższe metody mają na celu zapewnienie ogólnego, lecz szczegółowego opisu monitorowania bioenergetyki komórkowej w mysich BMSCs podczas różnicowania w osteoblasty z wykorzystaniem tego analizatora. Opis obejmie rutynowo wykonywane analizy; jednak, jak w przypadku wielu technik i metod, zaleca się, aby poszczególne laboratoria samodzielnie określiły szczegóły specyficzne dla swoich eksperymentów.
Wybór analizy oraz dostępne rodzaje analiz: Dostępna jest szeroka gama zestawów do analiz i odczynników pozwalających na badanie bioenergetyki komórek przy jednoczesnym zapewnieniu wiarygodności i spójności wyników eksperymentalnych. Ponadto oprogramowanie komputerowe oferuje szablony analiz, które można łatwo dostosować. Analizę można zdefiniować w zależności od potrzeb użytkownika, aby zmierzyć różne parametry metaboliczne. Analizy te można modyfikować na różne sposoby, w zależności od celu eksperymentalnego i/lub pytania naukowego. Na przykład, dzięki czterem portom wtryskowym do medium analitycznego można wprowadzić wiele związków w celu analizy odpowiedzi komórkowej specyficznej dla każdego szlaku metabolicznego.
Test fenotypu energetycznego komórek: Ten test mierzy fenotyp metaboliczny oraz potencjał metaboliczny żywych komórek. Jest on również zalecany jako pierwszy krok w celu uzyskania ogólnego obrazu metabolizmu specyficznego dla danej ścieżki. Aby zbadać potencjał energetyczny komórek, wstrzykuje się mieszaninę oligomycyny A – inhibitora syntazy ATP – oraz cyjanorku karbonylowego 4-(trifluorometoksy) fenylohydrazonu (FCCP), który jest czynnikiem rozprzęgającym mitochondrialnym. Wstrzyknięcie oligomycyny A hamuje syntezę ATP, co prowadzi do zwiększenia tempa glikolizy (ECAR), aby umożliwić komórkom zaspokojenie ich zapotrzebowania energetycznego; z kolei wstrzyknięcie FCCP skutkuje wyższym OCR ze względu na depolaryzację błony mitochondrialnej. W istocie test ten obrazuje podstawowe oddychanie metaboliczne, a po podwójnych wstrzyknięciach, impulsach lub stresach – odpowiedź metaboliczną. Na podstawie tych parametrów oprogramowanie wykreśla OCR i ECAR komórek, klasyfikując je w czasie jako będące w stanie tlenowym, spoczynkowym, glikolitycznym lub energetycznym25,26.
Analiza tempa produkcji ATP w czasie rzeczywistym: Metoda ta pozwala na jednoczesny pomiar komórkowej produkcji ATP pochodzącej z glikolizy oraz oddychania mitochondrialnego. Analiza ta ilościowo mierzy przesunięcia metaboliczne między tymi dwiema ścieżkami energetycznymi i dostarcza danych na temat tempa produkcji ATP mitochondrialnego i glikolitycznego w czasie. W badaniu uzyskuje się podstawowe dane OCR i ECAR, a następnie oblicza tempo produkcji ATP mitochondrialnego poprzez wstrzyknięcie oligomycyny A oraz tempo produkcji ATP glikolitycznego poprzez wstrzyknięcie mieszaniny rotenonu i antymycyny A (całkowite zahamowanie funkcji mitochondriów), co prowadzi do zakwaszenia mitochondrialnego17,27.
Test stresu mitochondriów komórkowych (lub test stresu mito komórkowego): Metoda ta służy do pomiaru funkcji mitochondriów poprzez oddychanie powiązane z ATP, kwantyfikacji bioenergetyki komórkowej, identyfikacji dysfunkcji mitochondriów oraz pomiaru odpowiedzi komórek na stres. W ramach jednego testu można uzyskać różne parametry, w tym bazową i rezerwową pojemność oddechową, oddychanie powiązane z ATP, oddychanie maksymalne oraz niemitochondrialne zużycie tlenu. Analiza ta obejmuje sekwencyjne wstrzykiwanie oligomycyny A, FCCP (odsprzęgacza mitochondriów) oraz mieszaniny inhibitorów rotenonu/antymycyny A w celu efektywnego zbadania ich wpływu na funkcje mitochondriów28.
Test elastyczności wykorzystania paliw mitochondrialnych (Flexibility mito fuel flex test): Metoda ta mierzy tempo oddychania mitochondrialnego poprzez utlenianie trzech głównych paliw mitochondrialnych w obecności i przy braku ich inhibitorów. Sekwencyjne hamowanie utleniania glukozy, glutaminy oraz kwasów tłuszczowych pomaga w pomiarze zależności, wydajności i elastyczności komórek, a także zależności komórek od różnych szlaków komórkowych w celu zaspokojenia zapotrzebowania energetycznego. Gdy mitochondria nie są w stanie zaspokoić zapotrzebowania zablokowanego szlaku za pomocą utleniania innych paliw, komórki wchodzą w stan zależności. Wydajność komórek oblicza się poprzez zahamowanie dwóch pozostałych alternatywnych szlaków, a następnie zahamowanie szlaku badanego. Elastyczność komórek pozwala zrozumieć zdolność mitochondriów do kompensacji i zaspokojenia zapotrzebowania na paliwo w zablokowanym szlaku. Oblicza się ją poprzez odjęcie wartości zależności komórek od ich wydajności. Do skutecznego obliczenia parametrów testu stosuje się trzy różne inhibitory, oddzielnie lub w mieszaninach po dwa. Kwas 2-cyjano-3-(1-fenylo-1H-indol-3-yl)-2-propenowy (UK5099) hamuje utlenianie glukozy poprzez blokowanie transportera pirogronianu w glikolizie. Bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-yl) (BPTES) siarczek etylu hamuje szlak utleniania glutaminy, a etomoksyra hamuje utlenianie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych29.
<img alt="Proces różnicowania hodowli BMSC do osteoblastów w czasie rzeczywistym w analizie strumienia z użyciem obrazowania mikropłytek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie metodologii hodowli i przygotowania osteoblastów do analizy. Mysie BMSC są izolowane z kości długich, hodowane i wysiewane na płytki 96-dołkowe z gęstością 25,000 komórek/dołek. Hodowlę tych komórek w specyficznym medium dla osteoblastów rozpoczyna się po osiągnięciu 80%-100% konfluencji, aby zainicjować ich różnicowanie. Analizy są przeprowadzane na różnych etapach różnicowania. Płytki kartridżowe są nawilżane na jeden dzień przed analizą. W dniu analizy do portów kartridży sensorowych wstrzykuje się różne inhibitory, zgodnie z wymaganiami analizy, a do 96-dołkowej płytki kalibracyjnej dodaje się bufor kalibracyjny. Po kalibracji przeprowadza się analizę metabolicznego strumienia komórkowego w czasie rzeczywistym, a następnie wykonuje obrazowanie mikropłytki z hodowlą komórkową za pomocą obrazownika mikropłytek, aby znormalizować dane z analizatora metabolicznego strumienia komórkowego w czasie rzeczywistym względem liczby komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-cyjano-3-(1-fenylo-1H-indol-3-ylo)-2-propenowy</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczek bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-ylo)etylu</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td> Czytnik obrazowania <td>FCCP</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Microplate</td></tr><tr><td>Hydrolat soli sodowej Etomoxir</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Roztwór (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy-Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna A - 5 mg</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 1.0 M Roztwór glukozy</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 100mM Pirogronian Rozwiązanie</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 200mM Roztwór glutaminy</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Pożywka DMEM</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Pożywka do oznaczania DMEM o napięciu 5 mM HEPES, pH 7,4, bez czerwieni fenolowej, wodorowęglanu sodu, glukozy, pirogronianu i L-glutaminy</td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XFe96</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>Analizator strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>Zawiera wkłady z czujnikiem XFe96, mikropłytki do hodowli komórkowych i roztwór Seahorse XF Calibrant</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania komórek 1.1.0.11</td><td>Agilent Technologies - Oprogramowanie BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wave 2.6.1</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-fosforan glicerolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Tworzenie kości przez osteoblasty jest niezbędnym procesem dla prawidłowego pozyskiwania kości i obrotu kostnego w celu utrzymania homeostazy szkieletu i ostatecznie zapobiegania złamaniom. W celu optymalizacji szczytowej masy kostnej i zwalczania różnych chorób układu mięśniowo-szkieletowego (tj. osteoporozy pomenopauzalnej, jadłowstrętu psychicznego, cukrzycy typu 1 i 2), w dziedzinie biologii kości podjęto niesamowite wysiłki, aby w pełni scharakteryzować osteoblasty w całym procesie różnicowania. Biorąc pod uwagę podstawową rolę dojrzałych osteoblastów w wydzielaniu białek macierzy i pęcherzyków mineralizacyjnych, zauważono, że procesy te wymagają niesamowitej ilości energii komórkowej, czyli adenozynotrójfosforanu (ATP). Ogólny stan energii komórkowej jest często określany jako bioenergetyka komórkowa i obejmuje szereg reakcji metabolicznych, które wyczuwają dostępność substratu w celu uzyskania ATP w celu zaspokojenia potrzeb komórkowych. W związku z tym obecna metoda szczegółowo opisuje proces izolowania pierwotnych, mysich komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) i monitorowania ich stanu bioenergetycznego za pomocą analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym na różnych etapach różnicowania osteoblastów. Co ważne, dane te wykazały, że profil metaboliczny zmienia się dramatycznie podczas różnicowania osteoblastów. W związku z tym użycie tego fizjologicznie istotnego typu komórki jest konieczne, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób status bioenergetyczny komórki może regulować ogólną funkcję.

<img alt="Wykresy potencjału energetycznego komórek przedstawiające szybkość produkcji ATP, oddychanie mitochondrialne oraz dane ECAR i OCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wykresy dla rutynowo wykonywanych analiz w celu zrozumienia profilu bioenergetycznego komórek grupy kontrolnej w porównaniu z grupą badaną wraz z odpowiednimi błędam...

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Metoda ta jest przydatna w określaniu energetyki komórkowej, takiej jak szybkość produkcji ATP, a także w określaniu preferencji komórkowych w stosunku do określonego metabolitu w czasie rzeczywistym. Na początek dodaj 200 mikrolitrów kalibru XF i inkubuj płytkę użytkową przez co najmniej godzinę przed testem. Przygotuj 80 mililitrów pożywki testowej XF, używając uzupełnionego XF DMEM.Rozmrozić oligomycynę A, rotenon i antymycynę A na lodzie. Pipetuj związki w górę iw dół, aby je rozpuścić przed użyciem. Dodaj trzy mililitry przygotowanej pożywki testowej do każdej probówki, oznaczonej A i B. Dodaj 26,4 mikrolitrów 2,5 milimolowej oligomycyny A do probówki A i 3,1 mikrolitra 12,67 milimolowego rotenonu, 4,1 mikrolitra 9,4 milimolowej antymycyny A i 30 mikrolitrowej plamy Hooka do probówki B. Załaduj 10-krotne stężenie tych inhibitorów do odpowiedniego portu iniekcyjnego.I wreszcie, 20 mikrolitrów tych związków zostanie załadowanych do komórek w 200 mikrolitrach pożywki testowej. Wyjmij mikropłytkę z hodowli komórkowej z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i obserwuj komórki pod mikroskopem. Usunąć pożywkę do oznaczania z łaźni wodnej.Delikatnie umyj komórki dwukrotnie 200

using-real-time-cell-metabolic-flux-analyzer-to-monitor-osteoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Źródło:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumenty OroborosTen film wyjaśnia, w jaki sposób strumień tlenu jest wykorzystywany do oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach ssaków. Demonstruje sekwencyjne zastosowanie digitoniny, substratów metabolicznych, ADP, rozprzęgacza i inhibitora w celu scharakteryzowania różnych stanów oddechowych. Uzyskany w ten sposób profil strumienia tlenu ujawnia funkcję mitochondriów i wydajność...

Pomiary strumienia tlenu w celu oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach

Ten film demonstruje metodę analizy metabolizmu energetycznego w aktywowanych ludzkich komórkach NK za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Różne inhibitory kompleksów łańcucha transportu elektronów wpływają na syntezę ATP, która jest mierzona za pomocą wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, dostarczając wglądu w metabolizm komórkowy i bioenergetykę.

Monitorowanie metabolizmu energetycznego w ludzkich komórkach NK w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Przedstawiamy protokół selektywnego przepuszczania błony plazmatycznej, umożliwiając ukierunkowane dostarczanie substratów i inhibitorów do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w hodowanych komórkach, pokonując bariery transportowe błony plazmatycznej, które zazwyczaj utrudniają takie analizy. Stosując tę technikę, wykazaliśmy, jak funkcja OXPHOS jest modulowana przez agonistów muskarynowych i antagonistów.

Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę analizy strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym do oceny bioenergetyki osteoblastów. Technika ta mierzy zużycie tlenu i produkcję ATP, ujawniając aktywność mitochondrialną i glikolityczną komórek kostnych.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Przeglądaj więcej filmów