Name: Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę NEPTUNE do nanoiniekcji lentiwirusa w jamę owodniową myszy w dniu embrionalnym 7.5, umożliwiającą jednorodną transdukcję płytki nerwowej z minimalnym wpływem na rozwój zarodka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bettiny Semsch i Jia Sun (Infinigene) za fachową opiekę nad myszami; Florian Salomons i Göran Månsson z Biomedicum Imaging Core (BIC) za pomoc w pozyskiwaniu obrazów i konsultacje. Finansowanie: Dziękujemy następującym fundatorom za wsparcie tego projektu: Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, doktorant KID funding oraz finansowanie SFO StratNeuro, Centrum Medycyny Innowacyjnej), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, Tornspiran Foundation, Jeansssons Foundation, Sven and Ebba-Christina Hagbergs Prize and Research Grant, Grant dla Knuta i Alice Wallenbergów, Fundacja Fredrika i Ingrid Thurings, Lars Hiertas Minne, Fundacja Walki z Rakiem Dziecięcym (Barncancerfonden), Fundacja Åhlen, Fundacja Ake Wibergs, Fundacja Tore Nilssons oraz Stypendium dla Rozpoczęcia Nauki Szwedzkiej Fundacji dla ERA. <silna klasa="xfig">Rysunek 4D,E zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+House+mouse.+Atlas+of+embryonic+development%22">The House mouse. Atlas of embryonic development</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).</li>
<li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarresi%2C+MJF+%22Developmental+biology%22">Developmental biology</a>. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).</li>
<li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li>
<li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li>
<li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+mouse%3A+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium%3A+Morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li>
<li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li>
<li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047(2010).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li>
<li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10(2006).</li>
<li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043(2021).</li>
<li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid%2C+robust%2C+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).</li>
<li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391(2012).</li>
<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947(2013).</li>
<li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands%3A+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li>
<li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme%2C+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li>
<li>Marmigère, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li>
<li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li>
<li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li>
<li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym protokole jest kilka etapów, które wpływają na przeżycie zarodka, jakość zastrzyków i odczyt. Wiek ciążowy zarodków określa się jako E0,5 w południe w dniu czopa pochwowego po nocnym kryciu. Wykonanie badania ultrasonograficznego ciąży w E6.5 późnym popołudniem/wieczorem zapewnia, że zarodki są wystarczająco rozwinięte, aby można je było zidentyfikować za pomocą ultradźwięków. Kontrola (1) pozwala na wstępne badanie przesiewowe, ile myszy z zatyczkami jest faktycznie w ciąży, (2) zapewnia, że żaden wirus nie jest niepotrzebnie rozmrażany i marnowany w przypadku, gdy myszy z zatyczkami dodatnimi nie są w ciąży, oraz (3) zmniejsza niepotrzebne interwencje na myszach (unika operacji u samic niebędących w ciąży).
W E7.5 zarodki są wrażliwe na siły zewnętrzne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Na przykład ciągnięcie za rogi macicy lub ściskanie decyduas może prowadzić do resorpcji zarodka. Tkanka macicy powinna być zawsze wilgotna, gdy znajduje się poza brzuchem kobiety, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Większość decyduów powinna pozostać w jamie brzusznej samicy, a tylko 3-4 powinny być wystawione na wstrzyknięcia. Ostrość igły jest kolejnym kluczowym czynnikiem decydującym o udanych iniekcjach. lub złamane końcówki igieł powodują wielokrotne nakłuwanie decyduami lub ściskanie plasteliny przed wejściem do AC, co może zwiększyć szybkość resorpcji. Dlatego dobrze zmielone i ostre igły należy zawsze bezpiecznie przechowywać i wymieniać po maksymalnie 2 samicach.
Protokół ten opisuje, w jaki sposób celować w płytkę nerwową za pomocą jednego wstrzyknięcia lentiwirusa. Co więcej, pokazuje, w jaki sposób skuteczność transdukcji można dostosować z klonów jednokomórkowych do całego mózgu. Jednak celem są również inne tkanki nienerwowe, w tym skóra i nabłonek jamy ustnej. Ponadto transdukowane są wszystkie typy komórek (komórki progenitorowe i zróżnicowane), co sprawia, że podejście to jest skuteczne, ale niespecyficzne. Zastosowanie MiniPromoterów w konstrukcie wirusowym prowadzi do specyficznej ekspresji transgenu w neuronach lub astrocytach15. Ma to tę zaletę, że pozwala uniknąć stosowania dedykowanych transgenicznych zwierząt Cre, a tym samym zmniejsza ilość pracy (utrzymanie szczepu i genotypowanie) oraz koszty.
Do ograniczeń NEPTUNA zalicza się jego trudności techniczne, trudności związane z pozyskiwaniem ciężarnych samic w przewidywalnym i stałym tempie oraz koszty pozyskania specjalistycznego oprzyrządowania. Co więcej, nieselektywne celowanie w komórki przez lentiwirusa może być postrzegane zarówno jako korzyść, jak i ograniczenie tej techniki. Wstrzyknięcie większych objętości do AC powoduje bezmózgowie13, chociaż w przypadku opisanych tutaj objętości unika się wad rozwojowych mózgu i egzencefalii15. Negatywny wpływ na rozwój mózgu ma zatem ryzyko związane z nanoiniekcjami in utero , którego należy ostrożnie unikać, wstrzykując odpowiednie objętości dostosowane do stadium embrionalnego i wielkości AC.
Przyszłe adaptacje tej techniki mogą koncentrować się na tropizmie wirusowym. Wirusy związane z adenowirusami (AAV) mają różne serotypy, które, jak wykazano, silnie atakują różne typy komórek w OUN 17,26. Jednak AAV nie integrują się z genomem komórki gospodarza i dlatego mogą zostać utracone w komórkach o wysokim współczynniku podziału. Chociaż istnieje kilka sposobów na zwiększenie swoistości NEPTUNA, zwierzęta transgeniczne są nadal złotym standardem, jeśli chodzi o manipulację genami in vivo. Myszy Cas9 i lentiwirus kodujący sgRNA zostały wykorzystane do genetycznych badań przesiewowych w naskórku embrionalnym27 i mogą być również przystosowane do rozwijającego się OUN.
Wstrzyknięcia do AC przy E7,5 skutecznie celują w komórki neuroektodermy przed rozpoczęciem neurulacji i celują w rozwijający się mózg skuteczniej niż elektroporacja w macicy . Pozwala to na badanie sygnałów genetycznych ważnych dla rozwoju mózgu od wcześniejszego punktu czasowego. W przeciwieństwie do klasycznych mysich modeli genetycznych, NEPTUNE oferuje elastyczne podejście do przeprowadzania funkcjonalnej analizy genów. Fenotypy po nadekspresji lub delecji genu można badać w ciągu kilku dni lub tygodni, a nie miesięcy lub lat. Wstrzyknięcia wielu konstruktów wirusowych pozwalają na manipulację kilkoma genami w obrębie jednego zarodka i pozwalają uniknąć generowania zwierząt z podwójnym lub potrójnym nokautem. Dzięki temu NEPTUNE nie tylko oszczędza czas, ale także może zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach.

Mózg i rdzeń kręgowy są jednymi z pierwszych organów, które inicjują formowanie się podczas embriogenezy1,2. Chociaż geny związane z zaburzeniami neurorozwojowymi są identyfikowane, funkcjonalne badanie wariantów genetycznych pozostaje w tyle3,4. Ponieważ generowanie myszy z warunkowym nokautem może trwać miesiące lub lata, interesująca jest alternatywna technika szybkiego badania funkcji genów w rozwijającym się mózgu. W zarodkach myszy neurulacja - proces morfogenetyczny, w którym płytka nerwowa przekształca się w cewę nerwową, dając początek ośrodkowemu układowi nerwowemu (OUN) - występuje między 8 a 10 dniem po zapłodnieniu5. Przed rozpoczęciem neurulacji płytka nerwowa, jako część ektodermy, składa się z pojedynczej warstwy komórek kolumnowych, które będą się namnażać i różnicować w liczne typy komórek neuronalnych i glejowych w CNS6,7. Dlatego, aby eksperymentalnie wywołać długotrwałe zmiany w ekspresji genów w OUN, celowanie w płytkę nerwową oferuje oczywiste korzyści, w tym dostępność wszystkich komórek progenitorowych.
W neurobiologii, w elektroporacji ovo8,9 i transdukcja wirusowa embrionalnych zarodków myszy zostały wykorzystane do manipulowania embrionalną ekspresją genów OUN. Rozwijający się zarodek pisklęcia jest modelem z wyboru do badania funkcji genów podczas rozwoju rdzenia kręgowego ze względu na dostępność zarodka pisklęcia w jaju i wynikającą z tego łatwość manipulowania ekspresją genów. W szczególności elektroporacja plazmidu in ovo generuje warunki eksperymentalne i kontrolne w każdym rdzeniu kręgowym pisklęcia. Elektroporacja powoduje przenikanie błony komórkowej i kieruje ujemnie naładowane DNA z (ujemnej) katody w kierunku (dodatniej) anody poprzez przyłożenie impulsu elektrycznego za pośrednictwem dwóch elektrod do zarodka. U myszy elektroporacja in utero była na ogół ograniczona do etapów embrionalnych, w których zakończyła się neurulacja, a mózg lub rdzeń kręgowy składa się już z kilku warstw komórek, co skutkuje niską wydajnością elektroporacji10. Elektroporacja plazmidu powoduje przejściową ekspresję genów i zazwyczaj celuje w kilka komórek.
Mikroiniekcja in utero pod kontrolą ultradźwięków została wykorzystana do manipulowania różnymi strukturami embrionalnymi, takimi jak skóra i mózg11,12,13,14. Jednak wstrzyknięcia ukierunkowane na rozwijający się mysi OUN wykazały niską skuteczność lub negatywnie wpłynęły na przeżycie zarodka12,13,14. W związku z tym opracowano ulepszony protokół dostarczania lentiwirusa o wysokim mianie do jamy owodniowej (AC) w E7.5, który został nazwany NEPTUNE dla neural plate targeting z in utero nano-injection15. Zastrzyki skutkowały długotrwałą skutecznością celowania wynoszącą >95% całego mózgu przy E13,5. Ponadto podczas ultradźwiękowej weryfikacji ciąży wprowadzono etap oceny stopnia zaawansowania, aby posortować samice i ciąże według etapu rozwoju, aby zminimalizować niepotrzebne procedury na zwierzętach badawczych i zmaksymalizować sukces wstrzyknięcia. Wydajność wtrysku i przeżywalność są ściśle związane ze wzrostem wielkości AC. Dlatego w tym artykule opisano, jak zmierzyć wielkość AC przed wstrzyknięciem, aby dostarczyć odpowiednią objętość AC, która nie spowoduje resorpcji zarodka. NEPTUNE jest solidną alternatywą dla obecnych podejść in utero i może być zaadaptowany do kilku zastosowań, w tym między innymi do badań nad zyskiem i utratą funkcji, śledzenia linii lub badań przesiewowych15,16.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 G Igła</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cala kapilary</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>Były używane do wyciągania igieł domowych</td></tr><tr><td>Przetwornik serii MS 70 MHz</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic przezroczysty żel ultradźwiękowy</td><td>Parker Laboratories</td><td>Mar-50</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Applier 9 mm</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>CD1 myszy</td><td>Charles River, Niemcy</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>Kobiety: od 8 tygodnia życia Samce: od 12 tygodnia życia</td></tr><tr><td>Wacik bawełniany</td><td>OneMed Sverige AB</td><td>120788</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki opatrunkowe delikatne proste 13 cm</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige Młynek do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ klipsy 9 mm</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td>klipsy</td></tr><tr><td>Nożyczki do irysa, Super Cut, proste, 9 cm</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Medical AB</td><td>EAN: 50085412586613</td><td>Zakupione w szwedzkiej aptece</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clarke</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Taśma membranowa</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Sense AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>Stół do obsługi myszy</td><td>Visual Sonics</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw automatycznego wtryskiwacza Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego z centralnym otworem (niska ścianka)</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, (&Oslash; xH): 92 x 16 mm</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Rely+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td><td>środek dezynfekujący</td></tr><tr><td>Membrana silikonowa</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250, sterylizator gorących kulek</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna (1,25 cm x 9,14 m)</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) System anestezjologiczny</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station 2</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0; Igła C-3, 45 cm fioletowy filament</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (neptune) w 7. dniu embrionalnym

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulowanie ekspresją genów w rozwijającym się mózgu myszy w macicy ma ogromny potencjał do badań genetyki funkcjonalnej. Jednak wcześniej było to w dużej mierze ograniczone do manipulacji etapami embrionalnymi po neurulacji. Opracowano protokół wstrzykiwania do jamy owodniowej w dniu embrionalnym (E)7.5 i dostarczania lentiwirusa, kodującego cDNA lub shRNA, celującego w >95% płytki nerwowej i komórek grzebienia nerwowego, przyczyniając się do przyszłego mózgu, rdzenia kręgowego i obwodowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje kroki niezbędne do osiągnięcia udanej transdukcji, w tym mielenie szklanych igieł kapilarnych, weryfikację ciąży, ocenę stopnia zaawansowania za pomocą obrazowania ultradźwiękowego oraz optymalne objętości wstrzyknięć dopasowane do stadiów embrionalnych. 
Podążając za tym protokołem, możliwe jest osiągnięcie transdukcji >95% rozwijającego się mózgu za pomocą lentiwirusa o wysokim mianie, a tym samym przeprowadzenie manipulacji genetycznej całego mózgu. W przeciwieństwie do tego, możliwe jest osiągnięcie transdukcji mozaikowej przy użyciu niższych mian wirusa, co pozwala na genetyczne badania przesiewowe lub śledzenie linii. Wstrzyknięcie E7,5 jest również ukierunkowane na ektodermę i grzebień nerwowy, przyczyniając się do powstania odrębnych przedziałów oka, języka i obwodowego układu nerwowego. Technika ta daje zatem możliwość manipulowania ekspresją genów w tkankach pochodzących z płytek nerwowych i ektodermy myszy od etapów preneurulacji, z korzyścią dla zmniejszenia liczby myszy wykorzystywanych w eksperymentach.

Zarodki wstrzyknięte w E7.5 lentiwirusem hPGK-H2B-GFP11,12 zebrano w E13.5 i zbadano pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym (Rysunek 5A). Pomyślna transdukcja płytki neuralnej skutkuje powstaniem zarodków z silną ekspresją reportera fluorescencyjnego głównie w mózgu oraz w innych tkankach pochodzenia ektodermalnego, np. skórze (Rysunek 5A,B). Wstrzyknięcie nadmiernie dużej objętości (większej niż zalecane tutaj objętości, np. ≥500 nL) zwiększa ciśnienie w AC i może prowadzić do całkowitej resorpcji (dane niepokazane) lub wad cewy nerwowej, takich jak exencephalia (Rysunek 5A). Pomyślne wstrzyknięcia w E7.5 skutkują jednorodną transdukcją od przedmózgu do rombencephalonu (Rysunek 5C-J).
Miana lentiwirusa na poziomie około 2 × 1010 jednostek zakaźnych (IFU) osiągają ponad 95% celowania, podczas gdy miana rzędu ~1 × 109 IFU osiągają 15% wydajności targetowania15Dodatkowo, struktury, które wcześniej były trudne do ukierunkowania przy użyciu elektroporacji, takie jak splot naczyniowy17,18, są również celem (Rycina 5 E,F). Skuteczność transdukcji można modyfikować poprzez dostosowanie miana wirusa podawanego do komory przedniej (AC). Wstrzyknięcie niskiego miana prowadzi do transdukcji pojedynczych klonów komórkowych (Rysunek 5C, Rysunek 5Ei Rysunek 5G,H) podczas gdy zastosowanie wirusa o wysokim mianie transdukuje niemal 100% całego mózgu (Rysunek 5D, Rycina 5F, Rycina 5Hi Rycina 5J). W związku z tym system NEPTUNE może być wykorzystywany zarówno w podejściach opartych na transdukcji klonalnej, śledzeniu linii komórkowych oraz screeningu genetycznym, jak i do badania ogólnego wpływu nadekspresji lub wyciszania genów w całym mózgu.
Rozwój oka ssaków jest wynikiem ściśle zorganizowanej komunikacji między trzema pochodnymi embrionalnej ektodermy: siatkówka neuronowa (NR) i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wywodzą się z neuroepithelium brzusznej części przedmózgowia, natomiast ektoderma powierzchniowa daje początek przyszłej soczewce i nabłonkowi rogówki. Jednakże centralna tkankazrębowa oraz tylny śródbłonek, dwie pozostałe warstwy rogówki, pochodzą z komórek grzebienia neuronalnego mezenchymy okołogałębnej19,20. Przekroje wieńcowe embrionów w stadium E13.5, którym w stadium E7.5 wstrzyknięto lentiwirus o wysokim mianie, wykazały – podobnie jak w przypadku mózgu – wysoką i jednorodną transdukcję tkanki neuronalnej oka, a także soczewki, rogówki i mezenchymy (Rycina 5K). W miarę postępu neurulacji iniekcje w stadiach E8.5 i E9.5 skutkują dalszym celowaniem w soczewkę i nabłonek rogówki (Rycina 5L i Rycina 5N), podczas gdy transdukcja tkanek oka pochodzenia neuroektodermalnego jest mniej wydajna w stadium E8.5 (Rycina 5L,M) lub nie zachodzi w stadium E9.5 (Rycina 5N).
Podczas gdy większość cząsteczek wirusowych infekuje tkanki odsłonięte w momencie wstrzyknięcia, niektóre cząsteczki transdukują tkanki niepochodzące z ektodermy, które rozwijają się później (Rysunek 6A). Ślinianki i przewody ślinowe rozwijają się około E11.5 z nabłonka jamy ustnej21 i są celem NEPTUNE (Rysunek 6B). Po wstrzyknięciach w E9.5 nabłonek językowy języka jest dobrze transdukowany; jednakże leżąca pod nim mezenchyma jest negatywna (Rysunek 6C; nawiasy oznaczają komórki transdukowane; gwiazdki oznaczają sygnał autofluorescencji, a nie komórki transdukowane). Dodatkowo w obrębie nabłonka językowego występują klastry dodatnie, oddzielone sekcjami negatywnymi (Rysunek 6C, białe groty strzałek), co sugeruje transdukcję powierzchni brodawek. Komórki grzebienia neuronalnego opisano w leżącej pod spodem mezenchymie języka oraz w obrębie nabłonka językowego, gdzie uczestniczą one w rozwoju brodawek smakowych i pączków smakowych22. Rzeczywiście, wstrzyknięcia w E7.5 skutkują rozległą transdukcją mezenchymy języka w E13.5 (Rysunek 6D), co sugeruje, że wczesne wstrzyknięcia celują w komórki grzebienia neuronalnego, przyczyniając się do tworzenia mezenchymy w języku.
U kręgowców zwoje rdzeni grzbietowych (DRG) stanowią kluczowy element obwodowego układu nerwowego (OUN), ponieważ wszystkie sygnały somatosensoryczne z obwodu ciała (temperatura, ból, nacisk) są przekazywane do mózgu poprzez aktywację neuronów DRG23. Zarówno neurony, jak i komórki glejowe DRG pochodzą z komórek grzbietu neuronalnego tułowia24. Iniekcja lentiwirusowa, w której uniwersalny promotor hPGK kontroluje ekspresję fluorescencyjnego reportera, prowadzi do rozległego celowania w ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy (Rysunek 7A), transdukując zarówno neurony, jak i progenitorów w rdzeniu kręgowym (Rysunek 7B), jak również w DRG (Rysunek 7C). Zastosowanie MiniPromotora dla doublecortin25 pozwala ograniczyć ekspresję GFP wyłącznie do neuronów (15 oraz Rysunek 7D,E).
<img alt="Obrazowanie mózgu GFP-DAPI w stadium E13.5, przedmózgowie, klonalna transdukcja rombencefalonu, manipulacja całym mózgiem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wysoka wydajność lub transdukcja klonalna za pomocą metody NEPTUNE. (A) Zarodki w stadium E13.5 pod mikroskopem sekcyjnym oświetlone standardowym oświetleniem (panel lewy) oraz te same zarodki oświetlone pod kątem GFP (panel prawy). Zarodek nieiniekcyjny po skrajnej lewej stronie, pomyślnie zainiekcyjny zarodek po skrajnej prawej stronie, wykazujący sygnał pozytywny w mózgu (zarodek najdalej po prawej). Zarodek z ekscencefalią z powodu wstrzyknięcia zbyt dużej objętości (zarodek środkowy). (B) Celowanie w skórę i mózg po iniekcji w stadium E7.5. Pasek skali = 50 µm. (C, D) Konfokalne obrazy przedmózgowia w stadium E13.5 z niską transdukcją klonalną (C) lub wysoką wydajnością transdukcji (D). (C, E, G, I) Transdukcja klonalna różnych regionów mózgu. (D, F, H, J) Wysokowydajna transdukcja różnych regionów mózgu. Paski skali = 200 µm. Różne wydajności transdukcji są reprezentatywne dla innych obszarów OUN. (E, F) Celowanie w splot naczyniowy, klonalnie (E) lub z wysoką wydajnością (F). Paski skali = 200 µm. (G, H) Celowanie klonalne (G) i wysokowydajne (H) w obrębie rombencefalonu, powiększone na (I, J). Paski skali = 200 µm. (K) Ekspresja reportera GFP w oku w stadium E13.5 po iniekcji in utero w stadium E7.5 (L, M) ekspresja reportera GFP w oku w stadium E15.5 po iniekcji in utero w stadium E8.5 (L), obszar w ramce powiększony na (M), lub w stadium E9.5 (N). Autofluorescencyjne naczynia krwionośne oznaczone są białymi gwiazdkami. Paski skali = 100 µm. Skróty: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; C = rogówka; LE = nabłonek soczewki; LF = włókna soczewki; M = mezenchyma; NR = siatkówka nerwowa; ON = nerw wzrokowy; RPE = nabłonek pigmentowy siatkówki; GFP = zielone białko fluorescencyjne; CNS = ośrodkowy układ nerwowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zarodkowy język myszy, barwienie DAPI/RFP, przewody ślinowe, analiza nabłonka, mikroskopia fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Transdukcja tkanek poznerwowych in utero. (A) Obraz konfokalny jamy ustnej w stadium E15.5. Zarodek został wstrzyknięty z lentiwirusowym reporterem fluorescencyjnym w stadium E9.5. Pasek skali = 200 µm. (B, C) (B) Powiększenie panelu wstawkowego; nabłonek przewodu ślinowego transdukowany wirusem. (C) Powiększenie panelu wstawkowego; grzbietowy nabłonek języka transdukowany wirusem z reporterem GFP (biały nawias). Podlegający mu mezenchym pochodzący z komórek grzebienia neuronalnego jest negatywny. Białe groty strzałek wskazują brodawki z negatywnymi komórkami grzebienia neuronalnego otoczonymi przez transdukowane wirusem komórki nabłonkowe (autofluorescencyjne komórki krwi/naczynia są oznaczone białymi gwiazdkami). Paski skali = 50 µm. (D) Schemat i obraz konfokalny mezenchymu języka w stadium E13.5 po wstrzyknięciu fluorescencyjnego wirusa reporterowego w stadium E7.5. Pasek skali = 50 µm. Skróty: D = grzbietowy (Dorsal); M = mezenchym (Mesenchyme); N = nosogardziel (Nasopharynx); SLD = przewód podjęzykowy (Sublingual Duct); SMD = przewód podżuchwowy (Submandibular Duct); T = język (Tongue); V = brzuszny (Ventral); GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wstrzykiwania do zarodka myszy; różnicowanie neuronalne, rdzeń kręgowy E13.5, markery GFP, SOX2, NeuN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Transdukcja komórek zwojów korzeni grzbietowych pochodzących z grzebienia neuronalnego. (A) Celowanie metodą NEPTUNE w stadium E7.5 pozwala na celowanie zarówno w OUN, jak i OUNW. (B) Obraz konfokalny rdzenia kręgowego i zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w stadium E13.5, do których w stadium E7.5 wstrzyknięto lentiwirusowy reporter hPGK-H2B-GFP, wykazuje transdukcję zarówno progenitorów neuronalnych SOX2+, jak i neuronów NeuN+. Pasek skali = 100 µm. (C) Powiększenie zaznaczonego obszaru z rysunku B, pokazujące DRG z ekspresją GFP w populacjach komórek SOX2+ (białe strzałki) i NeuN+ (białe groty strzałek). Pasek skali = 20 µm. (D) Obraz konfokalny rdzenia kręgowego i DRG w stadium E13.5, do których w stadium E7.5 wstrzyknięto lentiwirus DCX-H2B-GFP, celujący wyłącznie w komórki DCX+. Pasek skali = 100 µm. (E) Powiększenie zaznaczonego obszaru z rysunku D, pokazujące DRG z ekspresją GFP ograniczoną do neuronów DCX+ (białe groty strzałek). Komórki DCX- są negatywne pod kątem GFP (białe strzałki). Pasek skali = 20 µm. Skróty: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; OUN = ośrodkowy układ nerwowy; OUNW = obwodowy układ nerwowy; DRGs = zwoje korzeni grzbietowych; GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE umożliwia celowanie i manipulację genetyczną embrionalnego układu nerwowego myszy od 7,5 dnia embrionalnego i umożliwia generowanie modeli knockdown lub śledzenia linii w ciągu kilku dni. Ten protokół jest elastyczny, elastyczny i szybki. Możemy dostarczyć shRNA, cdRNA lub biblioteki wirusowe z kodami kreskowymi, aby odpowiedzieć na różne pytania w ciągu kilku dni, a nie miesięcy lub lat.Oczekujemy, że NEPTUNE dostarczy informacji w dziedzinie neurobiologii, ale może być również zaadaptowany do innych układów narządów. Identyfikacja jamy owodniowej może być dość trudna, więc nie spiesz się, aby spojrzeć na obraz ultrasonograficzny i być może miej pod ręką podręcznik lub inny zasób anatomiczny. Aby rozpocząć ładowanie igły, wsuń szklaną igłę na metalowy tłok, trzymając tuleję zaciskową przymocowaną, ale lekko poluzowaną.Następnie przepchnij igłę kapilarną wraz z metalowym tłokiem przez przednią uszczelkę, aż dotrze do przekładki. Nacisnąć przycisk Puste, aby wepchnąć tłok do igły i usunąć olej z końcówki igły. Następnie naciśnij Napełnij, aby utworzyć pęcherzyk powietrza, dzieląc olej i roztwór.Na koniec opuść igłę, zanurz końcówkę w roztworze i ponownie naciśnij przycisk Napełnij, aby załadować igłę. Po unieruchomieniu znieczulonej samicy myszy z jamami owodniowymi o idealnej wielkości na stole grzewczym, nałóż żel do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i wstrzyknij podskórnie środek przeciwbólowy. Następnie wysterylizuj dolną część brzucha, wycierając szmatką nasączoną 0,5 miligrama na mililitr roztworu chlorheksydyny i osusz skórę.Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj pionowe nacięcie skóry w dolnej części brzucha o długości od 1,5 do 2 centymetrów. Następnie delikatnie unieś skórę i uwolnij ją z leżącej pod spodem warstwy mięśniowej około jednego centymetra wokół miejsca nacięcia, aby ułatwić szycie po zabiegu. Następnie wykonaj jednocentymetrowe pionowe nacięcie linii środkowej w warstwie mięśni.Za pomocą jednej pary kleszczy podnieś jedną stronę skóry i warstwy mięśni, a drugą parą poszukaj rogów macicy. Następnie za pomocą kleszczy przytrzymaj tkankę między zarodkami i ostrożnie wyciągnij oba rogi macicy z brzucha. Policz i ponumeruj zarodki, od jajnika do szyjki macicy lub od szyjki macicy do jajnika, po obu stronach.Następnie wilgotnym wacikiem delikatnie wepchnij wszystkie zarodki z powrotem do jamy brzusznej, z wyjątkiem pierwszych trzech do wstrzyknięcia. Następnie umieść kroplę PBS na elastycznej membranie przyklejonej do okrągłego środkowego otworu dostępnej w handlu zmodyfikowanej szalki Petriego i trzymaj ją bezpośrednio nad zarodkami. Włóż zamknięte kleszcze do nacięcia gumki, a następnie zwolnij kleszcze, aby otworzyć elastyczne nacięcie, upuszczając płyn na zarodki.Za pomocą kleszczy przeciągnij przez gumkę odcinek macicy odpowiadający trzem zarodkom i delikatnie przyłóż szalkę Petriego na brzuchu myszy. Za pomocą czterech glinianych nóżek zabezpiecz i przymocuj szalkę Petriego nad brzuchem, aby zmniejszyć nacisk na mysz, a także zmniejszyć wrażliwość obrazowania na oddech i bicie serca myszy. Następnie, za pomocą kleszczy i wilgotnego wacika, wyreguluj macicę i gumkę, aby upewnić się, że gumka jest uszczelniona wokół skóry myszy, zapobiegając wyciekowi PBS.Następnie, aby unieruchomić macicę, dociśnij cylinder z gliny modelarskiej po prawej stronie zarodków lub macicy i dodaj PBS do szalki Petriego, aż zarodki i macica zostaną całkowicie pokryte PBS. Aby ułatwić rejestrację wstrzyknięć, zanurz sondę ultradźwiękową w PBS i wyreguluj mysz lub stół chirurgiczny tak, aby pierwszy zarodek był wyrównany z sondą ultrasonograficzną. Przeskanuj wszystkie trzy zarodki i sprawdź jamy owodniowe.Następnie za pomocą aparatu USG należy zmierzyć średnicę jamy owodniowej w celu określenia odpowiedniej objętości iniekcji. Za pomocą sterownika wtrysku ustaw określone objętości wtrysku i prędkość wtrysku na wolną, z szybkością wtrysku 23 nanolitrów na sekundę. Po opuszczeniu igły do PBS, za pomocą głównych kół w systemie szynowym, naciśnij przycisk Empty na sterowniku nanowtryskiwacza, aż płyn dotrze do końcówki igły.Następnie wyjąć igłę z PBS i nacisnąć przycisk Inject, aby sprawdzić, czy wypłynęła kropla o przybliżonej pożądanej objętości. Ponownie opuść igłę do PBS i przesuń nanowstrzykiwacz za pomocą koła płaskiego Y na mikromanipulatorze, aby wyrównać igłę z sondą ultradźwiękową i zarodkiem. Wyreguluj kąt igły za pomocą pokrętła kąta wstrzyknięcia, aby zapewnić prawie prostopadły kąt wstrzyknięcia w stosunku do ściany macicy.Następnie, za pomocą koła iniekcyjnego na mikromanipulatorze, jednym ruchem wprowadzić igłę do jamy owodniowej. Jeśli końcówka igły zniknie z obrazu ultrasonograficznego, przesuń sondę do przodu lub do tyłu, aby przywrócić ostrość igły. Następnie wstrzyknij żądaną objętość, naciskając przycisk Inject odpowiednią liczbę razy.Po wstrzyknięciu wymaganej objętości należy odczekać od 5 do 10 sekund przed wycofaniem igły jednym delikatnym ruchem. Przenieść etap do następnego zarodka i powtórzyć wstrzyknięcie dla pozostałych dwóch zarodków, jak pokazano. Następnie wyjmij sondę ultradźwiękową i igłę z PBS za pomocą mikromanipulatora, obracając igłę od operatora, aby uniknąć uszkodzeń i obrażeń.Za pomocą kleszczy umieść pierwszy i drugi zarodek z powrotem w jamie brzusznej, delikatnie przepychając je przez gumkę. Następnie delikatnie chwyć tkankę przylegającą do trzeciego zarodka i pociągnij macicę w kierunku górnego końca elastycznego nacięcia. Delikatnie podciągnij od czwartego do szóstego zarodka za pomocą kleszczy i pozwól trzeciemu zarodkowi ponownie wejść do jamy brzusznej.Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków z optymalnymi jamami owodniowymi, delikatnie wepchnij zarodki i macicę z powrotem do brzucha myszy. Udana transdukcja płytki nerwowej skutkuje powstawaniem zarodków z silną ekspresją fluorescencyjnego reportera w mózgu i innych tkankach pochodzących z ektodermy, takich jak skóra. Wstrzykiwanie zbyt dużych objętości może powodować wady cewy nerwowej, takie jak egzencefalia.Udane wstrzyknięcia w 7,5 dniu embrionalnym powodują równomierną transdukcję od przodomózgowia do tyłomózgowia, w tym do splotu naczyniówkowego. Wstrzyknięcia o niskim mianie powodują transdukcję klonów jednokomórkowych, podczas gdy wirus o wysokim mianie transdukuje prawie 100% całego mózgu. Wycinki koronalne do zarodków w 13,5 dniu embrionalnym wykazały wysoką i równomierną transdukcję tkanki nerwowej oka, soczewki, rogówki i mezenchymy.Po wstrzyknięciu w 9,5 dniu embrionalnym, gruczoły ślinowe i przewody rozwijają się około 11,5 dnia embrionalnego z nabłonka jamy ustnej. Nabłonek językowy języka jest dobrze przetransdukowany, podczas gdy leżąca pod nim mezenchyma jest ujemna. Ponadto dodatnie skupiska w nabłonku językowym są oddzielone odcinkami ujemnymi, co sugeruje transdukcję powierzchni brodawkowatej.Wstrzyknięcia w 7,5 dniu embrionalnym powodują rozległą transdukcję mezenchymimy języka w 13,5 dniu embrionalnym, co sugeruje, że wczesne wstrzyknięcia są ukierunkowane na komórki grzebienia nerwowego, przyczyniając się do powstania mezenchymy w języku. Iniekcje lentiwirusowe prowadzą również do powszechnego ukierunkowania na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, transdukując zarówno neurony, jak i komórki progenitorowe w rdzeniu kręgowym, a także w zwojach korzenia grzbietowego. Dobre przygotowanie to podstawa.Upewnij się, że nie ma wycieku i że zarodki są dobrze zamocowane, abyś mógł całkowicie skupić się na wstrzyknięciach do jamy szczura. Po NEPTUNIE analizę można przeprowadzić różnymi metodami, takimi jak analiza immunofluorescencyjna mózgu, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki lub umożliwienie narodzin wstrzykniętych zarodków w celu analizy behawioralnej.

murine-neural-plate-targeting-utero-nano-injection-neptune-at

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

In utero operacje przeżycia u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości do prowadzenia iniekcji wektorów retrowirusowych do mózgu myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E).

Mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu E9.5 pod kontrolą ultradźwięków

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Opisano metodę umożliwiającą bezpośrednią manipulację farmakologiczną embrionów myszy podczas neurulacji z pominięciem metabolizmu matczynego. Technikę tę można dostosować do badania różnych aspektów neurulacji poprzez zmianę punktu czasowego oraz zastosowanego czynnika farmakologicznego.

Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Źródło: Mangold, K., H el. al., Mysia płytka nerwowa celowana przez nanoiniekcję in utero (NEPTUNE) w 7.5. dniu embrionalnym. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje metodę nanoiniekcji in utero do celowania w płytkę nerwową w embrionalnym modelu myszy. Roztwór lentiwirusowy o wysokim mianie jest wstrzykiwany do jamy owodniowej, gdzie integruje się z komórkami płytki nerwowej, umożliwiając stabilną manipulację genami na potrzeby badań neurorozwojowych i zastosowań terapeutycznych.

Manipulacja komórkami płytki nerwowej poprzez nanoiniekcję in utero w embrionalnym modelu myszy

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia manipulacji genetycznej w mózgu fretki embrionalnej za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta pozwala na celowanie w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej in vivo.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Poznaj metodę NEPTUNE do nanoiniekcji lentiwirusa w jamę owodniową myszy w dniu embrionalnym 7.5, umożliwiającą jednorodną transdukcję płytki nerwowej z minimalnym wpływem na rozwój zarodka.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Przeglądaj więcej filmów