Name: Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj technikę perfuzji wątroby przez żyłę wrotną u myszy do badań metabolicznych w czasie rzeczywistym. Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę składników odżywczych i hormonów w modelach chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze z National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Część tych prac została wykonana w McKnight Brain Institute w Narodowym Laboratorium Wysokiego Pola Magnetycznego (AMRIS) Laboratory, który jest wspierany przez Narodową Fundację Nauki (National Science Foundation Cooperative Agreement No). DMR-1644779 i stan Floryda.

Eksperymenty z udziałem myszy były prowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy (numer protokołu #201909320). Użyty szczep myszy to C57BL/6J; Wszystkie myszy były samcami. Metoda ta ma ogólne zastosowanie również w badaniach z wykorzystaniem innych standardowych szczepów myszy. Ta operacja jest optymalnie wykonywana przez dwie osoby współpracujące ze sobą.
1. Wstępna konfiguracja
<ol>
	<li>Perfuzja wątroby z perfuzatem zawierającym elektrolity Krebsa-Henseleita6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, KH2PO4 i 0,5 mM sodu-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM mleczan sodu, 0,6 mM pirogronian sodu, 0,2 mM [U-13C] propionian sodu, 10% (v/v) D2O i 0,63 mM mieszaniny kwasów tłuszczowych (zawierających kwas palmitynowy (22,1% całości), kwas oleinowy (5,2%), kwas stearynowy (2,7%), kwas oleinowy (27%), kwas linolowy (37,7%), kwas γ-linolenowy (2,4%) i kwas dekozaheksanowy (2,8%)) wraz z 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej. Ustawić końcowe pH perfuzatu na 7,3 za pomocą HCl (i NaOH, jeśli to konieczne).</li>
</ol>
2. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Zmontować dwie strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 23G o długości 19,05 mm. Napełnij jedną strzykawkę 0,01 ml 1000 jednostek/ml heparyny i 0,19 ml soli fizjologicznej (0,9% (w/v) NaCl w wodzie; Tabela 1).</li>
	<li>Napełnij drugą strzykawkę 0,2 ml 2% lidokainy i 0,6 ml 0,9% soli fizjologicznej (Tabela 1). W kolejnej strzykawce o pojemności 1 ml z igłą o masie 27 g 38,1 mm napełnić perfuzatem i utrzymywać w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Ustawienie kolumny perfuzacji
<ol>
	<li>Umieść szklaną butelkę zawierającą 500 ml perfuzatu w łaźni wodnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na ~42 °C. Wyższa temperatura w łaźni wodnej umożliwia utrzymanie 37 °C w kolumnie perfuzyjnej.</li>
	<li>Gdy woda nagrzeje się do 42 °C, włącz dwie pompy, aby perfuzat z butelki krążył po natleniaczu cienkowarstwowym i szklanej kolumnie z płaszczem wodnym o średnicy 100 cm (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1A-E).</li>
	<li>Włącz gaz natleniający (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla), aby zwiększyć ciśnienie w oksygenatorze7 (Rysunek 1C). Dostosuj wysokość kolumny perfuzyjnej, aby osiągnąć natężenie przepływu 8 ml/min z założonym cewnikiem (patrz krok 9, aby uzyskać pomiar natężenia przepływu)5,8,9. 
	UWAGA: Natężenie przepływu odnosi się do szybkości, z jaką perfuzat jest wydalany przez wątrobę.</li>
</ol>
4. Znieczulenie myszy
<ol>
	<li>Załóż środki ochrony osobistej zgodnie z protokołem IACUC i innymi odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. 
	UWAGA: Poniższe kroki zostały zoptymalizowane dla myszy w wieku od 9 do 13 tygodni.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze izofluranu. Ustaw gaz dostarczający na 100% tlenu, natężenie przepływu 1 l/min, a izofluran na 2%10. Poczekaj, aż oddech zwolni i stanie się stabilny. 
	UWAGA: Aby mysz osiągnęła stabilną płaszczyznę operacyjną, o czym świadczy powolna i stała częstość oddechów oraz brak odruchu szczypania palców u stóp, szybkość przepływu tlenu można regulować w zakresie od ~1,5 l/min do ~3 l/min, a stężenie izofluranu od 1 - 3%. Szybkość dostarczania gazu nośnego i stężenie izofluranu zależy od wieku i wagi zwierzęcia oraz czynników takich jak hałas i światło.</li>
	<li>Zdezynfekuj brzuch 70% alkoholem. Podawać heparynę przez głębokie wstrzyknięcie podskórne w warstwę tłuszczu w jamie brzusznej (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). Umieść mysz z powrotem w komorze anestezjologicznej na 10 minut 
	UWAGA: Golenie nie jest wymagane, ponieważ ta procedura jest nieuleczalna.</li>
</ol>
5. Celiotomia
<ol>
	<li>Przenieś mysz z komory anestezjologicznej na platformę chirurgiczną i umieść ją w pozycji leżącej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Umieść nos myszy w stożku nosowym i przyklej łapy taśmą. Uważaj, aby nie obciążać szyi, co może prowadzić do uduszenia.</li>
	<li>Podawać lidokainę przez wstrzyknięcie podskórne obustronnie w przednią część grzebienia biodrowego11 (<silna klasa="xfig">Ryc. 3). Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby potwierdzić brak wszystkich odruchów bólowych.</li>
	<li>Wykonaj celiotomię, aby odsłonić narządy wewnętrzne (<silna klasa="xfig">Ryc. 4). Wykonaj nacięcie o szerokości 3 cm (szerokość całego brzucha myszy). 
	UWAGA: Szerokość będzie się zmieniać wraz z wiekiem i dietą myszy.</li>
	<li>Rozszerz nacięcie za pomocą hemostatu, który ciągnie przyczepność, zaciskając wyrostek mieczykowaty (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4).</li>
</ol>
6. Kaniulacja żyły wrotnej
<ol>
	<li>Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby oczyścić jelito cienkie i grube pokrywające żyłę wrotną. Umieść jedwabny szew pod łukiem żyły wrotnej proksymalnie do wątroby (<silna klasa="xfig">Ryc. 4A).</li>
	<li>W zależności od budowy anatomicznej umieść drugi szew jedwabny proksymalnie lub dystalnie żyły krezkowej dolnej dystalnie od wątroby (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A) 12,13. Użyj szwu 2-0 dla obu szwów.</li>
	<li>Po założeniu szwów należy kancelować żyłę wrotną za pomocą cewnika 22G14 (Figura 4B). Podczas zakładania cewnika należy trzymać skos skierowany do góry. Wejdź do żyły wrotnej pod kątem nie większym niż 15°.</li>
	<li>Zawiąż pierwszy szew za stożkiem cewnika. Po kaniulacji żyły wrotnej zakotwiczyć cewnik w odległości 2-3 mm dystalnie od odgałęzienia żyły wrotnej za pomocą szwu jedwabnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B). 
	UWAGA: Asystent powinien przetaczać ramiona i nadgarstki, aby zapobiec przemieszczeniu cewnika lub rozerwaniu żyły wrotnej. Każdy szew wymaga dwóch węzłów.</li>
	<li>Następnie zabezpiecz dolną część cewnika drugim szwem. Z pomocą asystenta chirurgicznego zawiąż węzeł ze szwem, aby przymocować cewnik do dystalnej części żyły wrotnej i otaczającej tkanki.</li>
</ol>
7. Resekcja wątroby po kaniulacji żyły wrotnej
<ol>
	<li>Po zabezpieczeniu cewnika włóż do cewnika strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 27G o długości 38,1 mm w celu wypłukania pęcherzyków krwi i powietrza. 
	UWAGA: Zwykle następuje cofanie się krwi z cewnika z powodu ciśnienia.</li>
	<li>Użyj silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 1 mm x 5 mm ze stałym kurkiem, aby połączyć kolumnę perfuzyjną (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) z cewnikiem, umożliwiając przepływ buforu do wątroby, wyznaczając początek perfuzji. W tym momencie uruchom minutnik, aby zaznaczyć początek perfuzji.</li>
	<li>Złagodzić zwiększone ciśnienie naczyniowe, wykonując nacięcie nożyczkami w żyle głównej dolnej.</li>
	<li>Potwierdzić przepływ perfuzatu przez wątrobę, obserwując jednorodną zmianę koloru wątroby z różowego/czerwonego na bladożółty. Po potwierdzeniu przepływu wytnij żołądek, jelito cienkie, jelito grube i prawą nerkę z otaczających tkanek.</li>
	<li>Z pomocą asystenta chirurgicznego manewruj wątrobą wokół jamy brzusznej i klatki piersiowej, podczas gdy chirurg przecina otrzewną ciemieniową i tkankę piersiową, aby wyciąć wątrobę</li>
	<li>Na koniec podnieś wątrobę do góry i przetnij pozostałą tkankę łączną, przytrzymując wątrobę na miejscu nożyczkami. Powoli manipuluj wątrobą, aby ułatwić widoczność. Usuń wszelkie sierść, która przykleja się do wątroby, spłukując ją perfuzatem przed zamknięciem jej w probówce NMR. 
	UWAGA: W tej procedurze usuwana jest tylko wątroba. Wszystkie inne narządy pozostają w ciele zwierzęcia. Przewód żółciowy można usunąć na podstawie protokołu eksperymentu. Chociaż na potrzeby tego eksperymentu pozostawiono go na miejscu.</li>
</ol>
8. Zwisanie wątroby z kolumny
<ol>
	<li>Gdy chirurg przekaże wątrobę i rurkę asystentowi, asystent odłącza rurkę od cewnika i kolumny.</li>
	<li>Napełnij cewnik perfuzatem, aż na górze cewnika utworzy się łąkotka. Przymocuj cewnik do kolumny, aby wątroba mogła zawiesić się i wykonać perfuzję. 
	UWAGA: Kulka perfuzatu na cewniku zapewnia wystarczającą objętość, aby wątroba mogła funkcjonować do momentu połączenia. Cewnik przymocowany do wątroby jest wciskany w dolną część kolumny.</li>
	<li>Przykręć rurkę NMR o średnicy 20 mm do szklanej kolumny o średnicy 100 cm, aby otoczyć wątrobę (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Aby uniknąć skrętu wątroby i żyły wrotnej, powoli przykręć rurkę NMR. Jeśli dojdzie do skręcania i przepływ zostanie zatrzymany, odkręć i ponownie załóż rurkę NMR. To naprawi niedrożność i powróci przepływ.</li>
	<li>Perfekować wątrobę przez 30-60 minut w oparciu o szczegóły badania. 
	UWAGA: Czas jest oparty na eksperymencie perfuzji. W tym eksperymencie obrót metaboliczny mierzono w ciągu 30 minut. Perfuzja wątroby może trwać do 10 minut, aby osiągnąć stan stacjonarny. Czas do stanu ustalonego rozpoczyna się po przecięciu żyły głównej dolnej i ustaleniu przepływu w wątrobie.</li>
</ol>
9. Pomiar przepływu
<ol>
	<li>Umieść łódkę wagową na górnej wadze ładowanej i wyzeruj wagę. Umieść rurkę z pompy rolkowej ciągnącej perfuzat odprowadzający z NMR do łodzi wagowej i uruchom stoper.</li>
	<li>Zważyć masę płynu nagromadzonego w ciągu 1 minuty, co daje natężenie przepływu w wątrobie. Umieść probówkę z powrotem w pojemniku na odpady/zbiórkę.</li>
</ol>
10. Pomiar tlenu
UWAGA: Pomiary miernika tlenu zostały skonfigurowane zgodnie z instrukcjami producenta15.
<ol>
	<li>Umieść elektrodę zawierającą 20 μl 50% nasyconego KCl roztworu na platynowej kopule i umieść pięć kropli 10 μl wokół dolnego platynowego pierścienia elektrody.</li>
	<li>Usuń klej z bibułki papierosowej. Połóż kawałek membrany politetrafluoroetylenowej na bibułce papierosowej.</li>
	<li>Umieść dwa elementy na górze elektrody. Zamontuj mały O-ring wokół górnej części elektrody. Przytnij papier tak, aby leżał płasko na dolnym platynowym pierścieniu na elektrodzie. 
	UWAGA: Dopuszczalne są pewne zwisy. Konieczne jest pokrycie srebra elektrody.</li>
	<li>Umieść większy O-ring na elektrodzie. Podłącz elektrodę do komory wodnej i dokręć podstawę, aby utrzymać elektrodę na miejscu. Włączyć łaźnię wodną i pozostawić do ogrzania do 37 °C.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie miernika tlenu. Kliknij Kalibruj > wodę nasyconą powietrzem. Ustaw prędkość mieszadła na 75, a temperaturę na 37 °C.</li>
	<li>Napełnij fiolkę o pojemności 50 ml do połowy wodą i energicznie wstrząsaj przez 2 minuty. Jest to woda nasycona powietrzem, używaj jej w 100% standardowo. Napełnij komorę miernika tlenu ~ 2 ml wody i umieść dwuczęściowy korek.</li>
	<li>Kliknij W porządku na ekranie i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje. Gdy sygnał osiągnie plateau, kliknij przycisk OK. Wylej płyn do komory i osusz bibułą.</li>
	<li>Powtórz kroki 10,6-10,7, ale z 200 mM siarczynu sodu (0% wzorca). Kliknij Zapisz kalibrację. 
	UWAGA: W przypadku standardu 0% nie jest wymagane energiczne potrząsanie.</li>
	<li>Podczas perfuzji należy użyć dwóch strzykawek o pojemności 5 ml. Jedna strzykawka do cyrkulacyjnego perfuzatu (wlot tlenu), a druga do perfuzatu odprowadzającego z probówki NMR (tlen na zewnątrz).</li>
	<li>Podczas sporządzania perfuzatu zarówno do pomiarów wlotowych, jak i zewnętrznych, należy za każdym razem pobrać 3-4 ml. 
	UWAGA: Ta kolumna ma szklane rurki umożliwiające dostęp do rurki NMR w celu usunięcia perfuzatu, który przepłynął przez wątrobę.</li>
	<li>Zmierz krążący perfuzat, najpierw tak jak wodę w kroku 10.6 i wyrzuć w kroku 10.7. Powtórzyć te same kroki dla perfuzatu odprowadzającego.</li>
	<li>Pomiary tlenu należy wykonywać co 10 minut.</li>
</ol>

<ol><li>Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Dihydroxyacetone+Is+a+Sensitive+Probe+of+Hepatic+Gluconeogenic+State%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State.</a> Metabolites. 11 (7), 441(2021).</li>
<li>Lumata, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%2813%29C+Magnetic+Resonance+and+Its+Use+in+Metabolic+Assessment+of+Cultured+Cells+and+Perfused+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs.</a> Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+detection+of+hepatic+gluconeogenic+and+glycogenolytic+states+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5D+dihydroxyacetone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%CE%B4-%5B1-13C%5D+gluconolactone+as+a+probe+of+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway.</a> NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).</li>
<li>Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+through+hepatic+pyruvate+carboxylase+and+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+detected+by+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).</li>
<li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li>
<li>Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Cardiac+Function+and+Energetics+in+Isolated+Mouse+Hearts+Using+31P+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069(2010).</li>
<li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+butylated+hydroxylanisole+against+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+primary+cultured+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).</li>
<li>Bessems, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+liver%3A+standardization+of+a+time-honoured+model%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).</li>
<li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Small+Animal+Model+of+Ex+Vivo+Normothermic+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).</li>
<li>Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+duration+of+intradermal+mixtures+of+bupivacaine+and+lidocaine+with+epinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine.</a> The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).</li>
<li>Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merriam-webster.com/medical">https://www.merriam-webster.com/medical</a> (2022).</li>
<li>Thorpe, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorpe%2C+DR+%22A+Dissection+in+Color%3A+The+Rat+%28and+the+Sheep%27s+Brain%29%22">A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain)</a>. , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf">https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf</a> (2006).</li>
<li>Heparin. , DrugBank Online. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://go.drugbank.com/drugs/DB01109">https://go.drugbank.com/drugs/DB01109</a> (2022).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PloS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o publikacji wyników.

Ta procedura chirurgiczna jest trudna i wymaga rozległej praktyki, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Izofluran i gaz nośny należy dostosować w razie potrzeby, aby utrzymać zwierzę przy życiu przez jak największą część zabiegu chirurgicznego. Środowisko, pora dnia, wiek, waga i kilka innych czynników będą miały wpływ na znieczulenie. Waga, dieta, szczep myszy i wiek mogą wpływać na operację, ponieważ nagromadzenie tłuszczu może zakłócać wizualizację żyły wrotnej. Podczas przyklejania łap taśmą należy uważać, aby nie obciąż...

Perfuzje ex vivo są kluczowe w badaniu metabolizmu wątrobowego, a perfuzja przez żyłę wrotną jest standardem w tych badaniach. W celu zbadania metabolizmu wątrobowego w izolacji, wątroba musi zostać wycięta z organizmu, aby uniknąć powikłań wynikających z metabolizmu w innych narządach (tj. metabolizmu całego ciała) i aby kontrolować dostępność hormonów (insuliny, glukagonu itp.). Takie podejście może być niezbędne do zrozumienia wpływu chorób takich jak cukrzyca, NAFLD i NASH na metabolizm wątrobowy, a także mechanizmy działania leków. Ten artykuł służy jako przewodnik po resekcji i perfuzji wątroby. Opracowaliśmy uproszczoną procedurę przeprowadzania tych metabolicznych badań wątroby z wystarczającym rygorem i odtwarzalnością. Jeśli operacja nie zostanie wykonana prawidłowo, występuje wyraźna zmienność uzyskanych danych metabolicznych. Opisujemy zorganizowaną metodę wykonywania cewnikowania żyły wrotnej i resekcji wątroby w kontekście badań metabolicznych in situ w spektrometrze magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), zgodnie z opisem w literaturze1,2,3,4,5.
Obecnie nie ma literatury opisującej perfuzję wątrobową ex vivo przy użyciu szklanej kolumny w NMR. Nie ma też publikacji wideo lub tekstowej dającej wyraźny przykład, jak przeprowadzić zabieg na wątrobie myszy, w szczególności pokazując, jak cewnikować żyłę wrotną, wyciąć wątrobę, przenieść i zawiesić wątrobę na szklanej kolumnie. Ponieważ genetycznie zmodyfikowana mysz jest powszechnie wykorzystywana do badania metabolizmu wątroby, jest to niezbędna procedura, która zasługuje na pełny opis. Operacje perfuzji wątroby nie są niczym nowym, ale ten artykuł jest metodą złotego standardu, której towarzyszy film demonstrujący doskonałość techniczną opisaną w tym artykule, aby pomóc wszystkim zainteresowanym tą procedurą. Przedstawiona tutaj metoda najlepiej sprawdzi się w metabolizmie w czasie rzeczywistym w celu wykrycia funkcji i obrotu metabolitów w modelach chorób.
Ta metoda wykorzystuje szklaną kolumnę z płaszczem wodnym o długości 100 cm, która pozwala wątrobie zawiesić się na dnie kaniuli zamkniętej przez perfuzat wewnątrz rurki NMR. Podgrzana woda w szklanym płaszczu służy do kontrolowania temperatury perfuzatu. Natleniacz cienkowarstwowy jest pod ciśnieniem 95%/5%O2/CO2 w celu kontroli pH. Dzięki zastosowaniu trzech oddzielnych pomp ustawiana jest wysokość kolumny perfuzacyjnej, która zapewnia stałe ciśnienie w wątrobie. Natężenia przepływu nie są kontrolowane poza zastosowaniem stałego ciśnienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Aby potwierdzić, że wątroba funkcjonuje prawidłowo, wykonuje się pomiary tlenu wraz z natężeniem przepływu. W naszych rękach ten zestaw warunków wstępnych prowadzi do wysoce powtarzalnych eksperymentów NMR w celu oceny funkcji metabolicznej wątroby.

<table><tbody><tr><td>1 ml Luer-Lock Jednorazowa sterylna jednorazowa strzykawka</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Niespecyficzna marka</td></tr><tr><td>100 cm Szklana kolumna z płaszczem wodnym</td><td>NIE DOTYCZY</td> NIE <td>DOTYCZY</td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>szew jedwabny 2-0</td><td>Braintree Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Catherter 1 w. Bez zabezpieczenia</td><td>Terumo</td><td>SRFF2225</td><td></td></tr><tr><td>23 G 0,75 cala Igły hipodemiczne</td><td>Exel International</td><td>26407</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1,5 cala Igły hipodemiczne</td><td>Exel International</td><td>26426</td><td></td></tr><tr><td>4x4 cale. Platforma chirurgiczna</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>chusteczka nasączona 70% nasączoną alkoholem</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY</td><td>Niespecyficzna marka</td></tr><tr><td>Kąpiel w wodzie cyrkulacyjnej</td><td>MS Lauda</td><td>Nie dotyczy</td><td>Model nie jest już produkowany</td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki operacyjne marki niespecyficznej; Prosty; ostry-ostry; 30mm Długość ostrza; 4 3/4 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Kleszcze</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Cienkie kleszcze</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13015-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa do wstrzykiwań 1000 jednostek/ml</td><td>RX Generics</td><td>71288-0402-02</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Patterson Weterynaryjny</td><td>14043-0704-06</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina HCl 2%</td><td>VEDCO Inc.</td><td>50989-0417-12</td><td></td></tr><tr><td>Natleniacz cienkowarstwowy</td><td>membranowy Radnoti</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum; Zakrzywiony; ; 27 mm Długość ostrza; 5 "</td>System miernika tlenu <td>Roboz</td><td>RS-6013</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hanstech Instruments Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,9% roztwór</td><td>Nie</td> dotyczy Nie <td>dotyczy</td><td>Sól fizjologiczna jest wytwarzana w skali laboratoryjnej</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Marka niespecyficzna</td></tr><tr><td>&nbsp; Analogowe systemy pomp konsolowych o zmiennej prędkości Cole</td><td>Palmer</td><td>N/A</td><td>Modele są niestandardowe dla poszczególnych zastosowań</td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Nie dotyczy Marka nieokreślona</td></tr></tbody></table>

ex vivo perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Choroby metaboliczne, takie jak cukrzyca, stan przedcukrzycowy, niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) i niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) stają się coraz bardziej powszechne. Perfuzje wątroby ex vivo pozwalają na kompleksową analizę metabolizmu wątroby za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), w warunkach żywieniowych, które można rygorystycznie kontrolować. Ponieważ symulacje in silico pozostają przede wszystkim teoretycznym sposobem oceny działania hormonów i skutków interwencji farmaceutycznej, perfundowana wątroba pozostaje jednym z najcenniejszych stanowisk badawczych dla zrozumienia metabolizmu wątrobowego. Ponieważ badania te prowadzą do uzyskania podstawowych informacji na temat fizjologii wątroby, wyniki muszą być dokładne i powtarzalne. Najważniejszym czynnikiem wpływającym na odtwarzalność perfuzji wątroby ex vivo jest jakość operacji. Dlatego wprowadziliśmy zorganizowaną i usprawnioną metodę wykonywania perfuzji wątroby myszy ex vivo w kontekście eksperymentów NMR in situ. Opisujemy również unikalną aplikację i omawiamy typowe problemy napotykane w tych badaniach. Ogólnym celem jest dostarczenie nieskomplikowanego przewodnika po technice, którą doskonaliliśmy przez kilka lat, a którą uważamy za złoty standard w uzyskiwaniu powtarzalnych wyników w resekcjach wątroby i perfuzjach w kontekście eksperymentów NMR in situ. Odległość magnesu od środka pola, a także niedostępność tkanki do interwencji podczas eksperymentu NMR sprawiają, że nasze metody są nowatorskie.

Funkcję wątroby ocenia się przede wszystkim na podstawie zużycia tlenu i szybkości przepływu. Typowa szybkość przepływu wynosi 4-8 mL/min, a zużycie tlenu 1 µmol/min.g. Wartości te będą się różnić w zależności od konkretnych warunków eksperymentalnych i różnic biologicznych.
Dokładna ilość użytego izofluranu będzie zależeć od rodzaju stosowanego systemu anestezjologicznego, a także od otoczenia oraz wieku i masy ciała myszy. W trakcie operacji stężenie izofluranu i gazu nośnego pozostaje bez z...

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Ten film przedstawia uproszczoną procedurę opracowaną w celu wykonywania badań metabolicznych wątroby z wystarczającym rygorem i odtwarzalnością, która może służyć jako przewodnik do wykonywania resekcji wątroby w badaniach perfuzji vivo. Technika ta najlepiej nadaje się do metabolizmu w czasie rzeczywistym w celu wykrycia funkcji metabolitów przemianowych w modelach chorób. Perfuzja umożliwia precyzyjną kontrolę składników odżywczych i hormonów dostępnych dla wątroby.Chociaż technika ta nie jest ukierunkowana na terapię, perfuzje wątroby mogą być pomocne w zrozumieniu etiologii i wpływu chorób, takich jak cukrzyca, NAFLD i NASH na metabolizm wątrobowy. Wraz z opracowywaniem nowych leków niezbędne stają się metody oceny metabolizmu ośrodkowego metabolizmu energetycznego wątroby. Metoda ta może być stosowana z modelami kilku chorób, w tym nowotworów i na kilku różnych etapach progresji choroby.Na początek umieść nos myszy w stożku nosowym po indukcji znieczulenia i przyklej jej łapy taśmą. Lidokainę należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym obustronnie w przednią część grzebienia biodrowego. Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby potwierdzić brak wszystkich odruchów bólowych.Wy

ex-vivo-hepatic-perfusion-through-the-portal-vein-in-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje procedurę perfuzji wątroby myszy przez żyłę wrotną za pomocą roztworu kolagenazy przed izolacją komórek wątroby.

Perfuzja wątroby myszy in vivo: metoda podawania roztworu do wątroby gryzoni przez żyłę wrotną

Makrofagi wątrobowe, zwane komórkami Kupffera, są odpowiedzialne za wychwytywanie krążących nanocząstek. Opisujemy tutaj metodę izolacji komórek Kupffera o wysokiej czystości i wydajności. Zmodyfikowany test LDH jest tutaj stosowany do pomiaru toksyczności indukowanej przez nanorurki węglowe w komórkach Kupffera.

Izolacja komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Protokół jest opisany dla perfuzji in situ dolnej części ciała myszy, w tym pęcherza, prostaty, narządów płciowych, kości, mięśni i skóry stóp.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Poznaj technikę perfuzji wątroby przez żyłę wrotną u myszy do badań metabolicznych w czasie rzeczywistym. Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę składników odżywczych i hormonów w modelach chorób.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Przeglądaj więcej filmów