Name: Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę ELISA do wykrywania sporozoitów Plasmodium w gruczołach ślinowych komarów Anopheles. Technika ta umożliwia badaczom przeprowadzanie dużych badań przesiewowych nad transmisją malarii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu Kirakorn Kiatibutr, MVRU, za szkolenie i wskazówki. Dziękujemy również Pani Pinyapat Kongngen, MVRU, za pomoc techniczną w przygotowaniu Rysunek 2. Prace te zostały wsparte grantem z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych oraz Narodowego Instytutu Zdrowia (U19 AI089672).

1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać listę sprzętu, odczynników i innych materiałów eksploatacyjnych używanych w tym protokole oraz do Tabeli 1, aby zapoznać się z listą roztworów i ich składem.
<ol>
	<li>Wychwytywanie i sprzężone z peroksydazą przeciwciała monoklonalne
	<ol>
		<li>Aby rozpuść mAb, ponownie wywieść liofilizowany mAb w mieszaninie 1:1 wody destylowanej: glicerol w stężeniu 0,5 mg/ml. Przygotować porcje w razie potrzeby, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor blokujący (BB)
	<ol>
		<li>Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 5 g kazeiny klasy ELISA w 100 ml 0,1 N NaOH. Dodać 900 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz tabela 1), aby uzyskać ostateczną objętość do 1,0 l.</li>
		<li>Dodać 0,02 g czerwieni fenolowej jako wskaźnik i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Przechowywać BB w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia lub podwielokrotność w 50 ml do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrole dodatnie
	<ol>
		<li>Aby odtworzyć kontrole pozytywne, należy ponownie uwodnić liofilizowane białka, dodając 1,000 μl BB. W razie potrzeby należy przygotować podwielokrotności podstawowych roztworów kontroli dodatniej i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>W przypadku rozcieńczania seryjnego, dodatkowo rozcieńczyć każdą kontrolę dodatnią do końcowego stężenia roboczego w BB w następujący sposób: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL. 
		UWAGA: Dokładne stężenia kontroli dodatnich mogą się różnić w zależności od partii. Zapoznaj się z kartą informacyjną produktu, aby uzyskać dokładne wymagane stężenie. Stężenia kontroli dodatniej, począwszy od powyższego stężenia roboczego, wynoszą 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL dla Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL dla PV210; oraz 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrole negatywne 
	UWAGA: Idealną kontrolą ujemną jest homogenat głowa-tułów samic komarów Anopheles przygotowany identycznie jak próbki do badań. Jednak BB może być również stosowany jako kontrola negatywna.
	<ol>
		<li>W przypadku BB jako kontroli ujemnej należy użyć 2-krotnego progu absorbancji, aby uzyskać wiarygodne odczyty dodatnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki komara
<ol>
	<li>Oddziel głowę i klatkę piersiową każdego zebranego dorosłego komara od brzucha za pomocą sterylnej żyletki. Umieść głowę i klatkę piersiową w wstępnie oznaczonej probówce do mielenia wirówki o pojemności 1.5 ml. W razie potrzeby główki basenu i tułowia do 10 komarów. 
	UWAGA: W celu przygotowania próbki, zazwyczaj gruczoł ślinowy zakażonego komara jest preparowany i poddawany CS-ELISA. Jednak głowa i klatka piersiowa pobranych komarów mogą być również wykorzystane do bezpośredniego wykonania testu CS-ELISA (bez preparowania gruczołów ślinowych)12,13,19.</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu do mielenia (GB) do każdej probówki i homogenizować próbkę za pomocą czystego tłuczka (umytego mydłem). Wypłucz zużyty tłuczek z 250 μl GB do probówki zawierającej homogenizowane komary do końcowej objętości ~300 μl.</li>
	<li>Próbkę należy przechowywać w zamrażarce (-20 °C) do czasu użycia lub natychmiast przystąpić do testu ELISA.</li>
</ol>
3. ELISA sporozoitu
<ol>
	<li>Wypełnij arkusz sporozoitowy ELISA (patrz Materiał uzupełniający 1). Przygotuj jedną płytkę ELISA dla każdego CSP (Pf, Pv-210 lub Pv-247).</li>
	<li>Przygotować wychwytywalny roztwór roboczy mAb, rozpuszczając przeciwciało w PBS: 4 μg/ml Pf; 2 μg/ml Pv-210; 2 μg/ml Pv-247. Obliczyć wymagane objętości na podstawie dodania 5 ml na płytkę. Delikatnie rozprowadź roztwór.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl każdego roboczego roztworu mAb z kroku 3.2 do każdego dołka płytki ELISA. Przykryj płytkę plastikową pokrywką i inkubuj przez 30 minut lub przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zassać zawartość studzienki i postukać talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe co najmniej 5 razy, aby usunąć cały płyn. 
	UWAGA: Jeśli system aspiracji (wielokanałowe ssanie próżniowe podłączone do czystych końcówek) nie jest dostępny, wylej przeciwciała do zlewu, a następnie postukaj talerzem o ręczniki papierowe.</li>
	<li>Dodaj 200 μl BB, aby wypełnić wszystkie dołki w talerzu. Przykryj talerz plastikową pokrywką. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać lub wylać zawartość studzienki. Postukaj talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe 5 razy, aby usunąć cały płyn.</li>
	<li>Załadować homogenat komara i kontrolę na płytkę w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl kontroli dodatniej do studzienek H1 i H2.</li>
		<li>Dodać 50 μl BB do studzienek w kolumnach 1 i 2 od rzędu C do G. Następnie dodać 50 μl kontroli pozytywnej do studzienek G1 i G2. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenie kontroli dodatniej, zaczynając od G1 i G2, a następnie F1 i F2 aż do C1 i C2. 
		UWAGA: Wszystkie studzienki kontroli dodatniej powinny zawierać 50 μl.</li>
		<li>Dodać 50 μl BB (kontrola ujemna) do studzienek A1, A2, B1 i B2.</li>
		<li>Dodać 50 μl każdej próbki homogenatu do dołka Unknown (Unk).</li>
		<li>Przykryć płytkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po około 2 godzinach przystępujemy do przygotowania podłoży. W przypadku zestawu 2-składnikowego do podłoża ABTS należy wymieszać podłoże A i podłoże B w stosunku 1:1. 
	UWAGA: Pełna 96-dołkowa płytka wymaga 5 ml substratu A i 5 ml substratu B.</li>
	<li>Przygotować roztwory robocze mAb znakowanych peroksydazą dla Pf, Pv-210 i Pv-247, dodając BB do odtworzonego sprzężonego mAb w celu uzyskania stężenia roboczego 1 μg/ml.
	<ol>
		<li>Obliczyć wymagane objętości na podstawie dodania 5 ml roboczego sprzężonego roztworu mAb na płytkę.</li>
		<li>Zbadać aktywność peroksydazy, mieszając 5 μl znakowanego peroksydazą mAb wykonanego w kroku 3.8 ze 100 μl substratu wykonanego w kroku 3.7 w oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml. Wiruj delikatnie. 
		UWAGA: Powinna nastąpić szybka zmiana koloru z przezroczystego na zielony, co wskazuje, że enzym peroksydazy i substraty działają.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zassaj lub wylej zawartość studzienki i postukaj talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe 5 razy, aby usunąć cały płyn.</li>
	<li>Umyj studzienki dwukrotnie 200 μl PBS-Tween, odessać zawartość studzienki i postukać w płytkę po 5 razy.</li>
	<li>Dodać 50 μl znakowanego peroksydazą mAb wykonanego w kroku 3.8 do każdego dołka. Przykryj płytkę i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Zassaj lub wylej zawartość studzienki i postukaj talerzem do góry nogami o ręcznik papierowy 5 razy.</li>
	<li>Umyj studzienki 3 razy 200 μl PBS-Tween, odessać zawartość studzienki i postukać w płytkę 5 razy każdy.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu substratu przygotowanego w kroku 3.7. Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Po 30 minutach odczytać absorbancję przy 405-414 nm za pomocą czytnika płytek ELISA. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi używanego czytnika płytek ELISA. Szczegółowe informacje na temat instrukcji dotyczących oprogramowania używanego w tym protokole można znaleźć w materiałach uzupełniających S2. W studzienkach kontroli pozytywnej powinna być zauważalna zmiana koloru z przezroczystego na zielony.</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Wykrywanie próbek dodatnich.
	<ol>
		<li>Próbki o wartościach absorbancji powyżej wartości odcięcia (dwukrotność średniej wartości absorbancji próbek ujemnych) należy oznaczyć jako dodatnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja CSP
	<ol>
		<li>Oszacować stężenie CSP w próbce, stosując krzywą wzorcową skonstruowaną z serii rozcieńczeń kontrolnych w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Utwórz krzywą wzorcową, wykreślając wartości absorbancji (oś y) seryjnie rozcieńczonych kontrolek w stosunku do ich stężeń (oś x).</li>
			<li>Wykonaj regresję liniową, aby określić najlepsze dopasowanie przy użyciu y = A + Bx, gdzie A i B są parametrami dowolnymi.</li>
			<li>Określić stężenie CSP dla każdej próbki dodatniej, rozwiązując równanie dla danej wartości absorbancji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bray, R. S., Garnham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life-cycle+of+primate+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The life-cycle of primate malaria parasites.</a> British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).</li>
<li>Held, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primate malaria.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+Malaria+and+Other+Parasitic+Diseases.+Manual+on+practical+entomology+in+Malaria%2C+Part+I+and+Part+II%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II.</a> World Health Organization. , Geneva. (1975).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+distribution+of+circumsporozoite+antigen+in+Anopheles+gambiae+infected+with+Plasmodium+falciparum%2C+using+the+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).</li>
<li>Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+circumsporozoite+protein+enzyme-linked+immunosorbent+assay+compared+with+microscopic+examination+of+salivary+glands+for+calculation+of+malaria+infectivity+rates+in+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Cameroon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon.</a> Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).</li>
<li>Echeverry, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+robust+single+PCR+for+Plasmodium+sporozoite+detection+in+mosquitoes+using+the+cytochrome+oxidase+I+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene.</a> Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).</li>
<li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+Plasmodium+spp.+Nested+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR.</a> Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).</li>
<li>Snounou, G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested+PCR+analysis+of+Plasmodium+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nested PCR analysis of Plasmodium parasites.</a> Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).</li>
<li>Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+four+human+malaria+parasite+species+in+field+samples+by+the+polymerase+chain+reaction+and+detection+of+a+high+prevalence+of+mixed+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).</li>
<li>Wirtz, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Plasmodium+vivax+sporozoites+in+mosquitoes+using+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).</li>
<li>Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+vivax+sporozoites+in+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea.</a> Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).</li>
<li>Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+Plasmodium+vivax-VK247+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites.</a> Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).</li>
<li>Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Plasmodium+falciparum-infected+mosquitoes+by+a+double+antibody+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).</li>
<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumsporozoite+protein+heterogeneity+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax.</a> Science. 245 (4921), 973-976 (1989).</li>
<li>Marie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+real-time+quantitative+PCR+to+measure+the+wild+Plasmodium+falciparum+infectivity+rate+in+salivary+glands+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae.</a> Malaria Journal. 12, 224(2013).</li>
<li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+of+sera+from+low+to+moderate+malaria-eEndemic+areas+against+Plasmodium+vivax+rPvs48%2F45+proteins+produced+in+Escherichia+coli+and+chinese+hamster+ovary+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems.</a> Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).</li>
<li>Balkew, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+distribution%2C+bionomics%2C+and+insecticide+susceptibility+of+Anopheles+stephensi+in+Ethiopia%2C+2018-2020%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020.</a> Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).</li>
<li>Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoite+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Anopheles+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoite ELISA.</a> Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).</li>
<li>Durnez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positive+circumsporozoite+protein+ELISA%3A+a+challenge+for+the+estimation+of+the+entomological+inoculation+rate+of+malaria+and+for+vector+incrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination.</a> Malaria Journal. 10, 195(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

CSP-ELISA zapewnia wysoce specyficzną i opłacalną metodę wykrywania Plasmodium CSP. Pozwala to na rozróżnienie sporozoitów P. falciparum i P. vivax, a także między dwoma podtypami, VK210 i VK247, P vivax 11,13,14,15. W celu uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników należy wziąć pod uwagę pewne punkty krytyczne. Wszystkie roztwory należy przechowywać w lo...

Sporozoity Plasmodium są zakaźnym stadium pasożytów malarii u komarów. Sporozoity są dostarczane ludziom poprzez ukąszenia komarów. U komara sporozoity najpierw tworzą się wewnątrz oocyst na ścianie jelita środkowego. Gdy są gotowe, są uwalniane do hemofelu i wędrują do gruczołów ślinowych komarów. Tam dojrzewają i stają się gotowe do przeniesienia na ludzi podczas karmienia krwią. U ludzi sporozoity odkładają się w skórze właściwej. Następnie dostają się do naczynia krwionośnego i przemieszczają się wzdłuż krążenia krwi, aby dotrzeć do wątroby w celu wywołania infekcji w hepatocytach1,2.
Trzy różne metody zostały użyte do określenia infekcji gruczołów ślinowych komarów. Pierwszą metodą jest wypreparowanie gruczołów ślinowych, a następnie bezpośrednie badanie sporozoitów pod mikroskopem świetlnym. Metoda ta jest złotym standardem w wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu sporozoitów w gruczołach ślinowych komarów Anopheles3. Wymaga to jednak technika dobrze wyszkolonego zarówno w sekcji, jak i badaniu mikroskopowym. Co więcej, nie można go użyć do określenia gatunku Plasmodium i podtypu CSP (dla P. vivax)4,5. Druga metoda wykorzystuje reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do wykrywania DNA Plasmodium w górnej części ciała komara6. Biorąc pod uwagę specyfikę PCR, możliwe są zarówno gatunki, jak i podtypy pasożyta7,8,9,10. Chociaż PCR jest coraz częściej stosowany, wymaga stosunkowo drogiego sprzętu i dobrze wyszkolonego personelu. Ostatnia metoda, ELISA do wykrywania białka okołosporozoitowego specyficznego dla Plasmodium (CSP), jest podstawą od trzech dekad11,12,13. CSP jest obecny zarówno w sporozoitach oocyst, jak i w sporozoitach gruczołów ślinowych12,14. Wykorzystując specyficzne przeciwciała, metoda ta umożliwia identyfikację gatunków Plasmodium i podtypowanie CSP sporozoitów P. vivax. Uzasadnieniem dla tego testu jest wymóg prostego, wysokoprzepustowego testu do zbadania dużej liczby dzikich komarów w celu zrozumienia przenoszenia malarii (tj. określenia wskaźnika infekcji sporozoitem).
Metoda ELISA ma dwie kluczowe zalety w porównaniu z badaniem mikroskopowym. Po pierwsze, pozwala naukowcom przechowywać próbki komarów do czasu, gdy będą gotowe do przetworzenia próbki. Po drugie, metoda ELISA może być stosowana do różnicowania gatunków Plasmodium za pomocą specyficznych dla gatunku przeciwciał monoklonalnych. Ponadto test ELISA może pomieścić większą liczbę próbek komarów, co pozwala na znacznie większą przepustowość15. W porównaniu do PCR, który wykrywa DNA sporozoitu, procedura ELISA zajmuje więcej czasu, ale kosztuje mniej16. Opisany tutaj test ELISA został opracowany w celu określenia zakaźności komarów i oddzielnego wykrywania CSP P. falciparum i każdego z dwóch wariantów CSP P. vivax, VK210 i VK247. Ta metoda ELISA została wykorzystana w wielu badaniach w celu określenia sezonowej dynamiki infekcji komarami i identyfikacji gatunków głównych wektorów malarii w terenie12,13,17,18. Do wykonania tego testu wystarczy standardowe laboratorium wyposażone w czytnik płytek ELISA.
Ogólne podejście jest podsumowane w Rysunek 1. W tym teście ELISA typu sandwich pierwszorzędowe (wychwytujące) przeciwciało monoklonalne (mAb) specyficzne dla każdego gatunku/podtypu Plasmodium jest najpierw używane do pokrycia płytki ELISA. Każda płytka jest pokryta pojedynczym mAb do wychwytywania. Funkcją mAb jest wychwytywanie odpowiedniego antygenu CSP w homogenatach komarów. Po wychwyceniu antygenu i umyciu płytki, drugie przeciwciało specyficzne dla CSP znakowane peroksydazą jest używane do wykrycia obecności CSP związanego z wychwytywanym mAb. Reakcja chemiczna katalizowana przez peroksydazę powoduje rozwój koloru w studzienkach dodatni dla CSP.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISA czytnik płytek</td><td>BioTek Instrument, Inc.</td><td>Synergy H1</td><td>Absorbancja jest mierzona w trybie detekcji absorbancji UV-VIS</td></tr><tr><td>Tłuczek do młynka</td><td>Axygen</td><td>PES-15-B-SI</td><td>Do homogenizacji głowy/klatki piersiowej komara</td></tr><tr><td>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABTS substrat 2-składnikowy</td><td>KPL</td><td>50-62-00</td><td>Do detekcji sterowanej peroksydazą</td></tr><tr><td>Bufor blokujący (BB)</td><td></td><td></td><td>Uwaga: roztwór</td></tr><tr><td>Wychwytywanie i sprzężone z peroksydazą przeciwciała monoklonalne (mAb)</td><td></td><td></td><td>Uwaga: mAb można uzyskać w postaci liofilizowanej jako część zestawów odczynników Sporozoite ELISA (MRA-890 dla P. falciparum i MRA-1028K dla P. vivax) z BEI Resources (https://www.beiresources.org.)</td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma aldrich</td><td>9000-71-9</td><td>Do blokowania przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Bufor mielący (GB)</td><td></td><td></td><td>Uwaga: roztwór</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Do przygotowania buforu mielącego</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Do przygotowania buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Do przygotowania soli fizjologicznej buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Na2HPO4Sigma</td> <td>aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Do przygotowania soli buforowej fosforanowej</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Do przygotowania soli w buforze fosforanowym</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Do blokowania przygotowania buforu</td></tr><tr><td>PBS-Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pf wychwyt mAb</td><td>CDC</td><td>Pf-CAP</td><td>Do wychwytywania białka okołosporozoitowego</td></tr><tr><td>Pf Peroksydaza Pf mAb</td><td>CDC</td><td>Pf-HRP</td><td>Do wykrywania białka okołosporozoitowego</td></tr><tr><td>Pf Kontrola pozytywna</td><td>Pf CDC</td><td>Pf-PC</td><td>Pf kontrola pozytywna Czerwień</td></tr><tr><td>fenolowa</td><td>Sigma aldrich</td><td>143-74-8</td><td>Do blokowania przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td>Uwaga: roztwór</td></tr><tr><td>Kontrole</td><td></td><td></td> dodatnie <td>Uwaga: roztwór</td></tr><tr><td>Wychwytywanie Pv210 mAb</td><td>CDC</td><td>Pv210-CAP</td><td>Do wychwytywania białka okołosporozoitowego Pv210</td></tr><tr><td>Peroksydaza Pv210 mAb</td><td>CDC</td><td>Pv210-HRP</td><td>Do wykrywania białka okołosporozoitowego Pv210</td></tr><tr><td>Kontrola pozytywna Pv210</td><td>CDC</td><td>Pv210-PC</td><td>Kontrola pozytywna Pv210</td></tr><tr><td>Wychwyt mAb Pv247</td><td>CDC</td><td>Pv247-CAP</td><td>Do wychwytywania białka okołosporozoitowego Pv247</td></tr><tr><td>Peroksydaza Pv247 mAb</td><td>CDC</td><td>Pv247-HRP</td><td>Do wykrywania białka okołosporozoitowego Pv247</td></tr><tr><td>Kontrola pozytywna Pv247</td><td>CDC</td><td>Pv247-PC</td><td>Kontrola pozytywna Pv247</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Do przygotowania PBS-Tween</td></tr><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe zbiorniki do pipetowania</td><td>Ogólny</td><td></td><td>Do pracy z odczynnikami</td></tr><tr><td>Płytki ELISA: 96-dołkowe przezroczyste okrągłe dno PVS</td><td>Corning Life Science</td><td>2797</td><td>Do rękawic ELISA</td></tr><tr><td>: rękawiczki jednorazowe i rękawice do zamrażania</td><td>Ogólne</td><td></td><td>Do ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Fartuch laboratoryjny</td><td>Ogólny</td><td></td><td>do ochrony indywidualnej</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa P30-300</td><td>Ogólna</td><td></td><td>Do przenoszenia roztworu</td></tr><tr><td>Zestaw pipet P2, P20, P200 i P1000</td><td>Ogólna Do</td><td></td><td>przenoszenia roztworu</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 10 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 i mikro; L</td><td>Ogólny</td><td></td><td>Do przenoszenia roztworu</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 mL, 10 ml</td><td>Ogólny</td><td></td><td>Do przenoszenia roztworu</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Ogólny Do</td><td></td><td>przenoszenia roztworu</td></tr></tbody></table>

wykrywanie sporozoitów plasmodium u komarów anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Sporozoity Plasmodium to zakaźne stadium pasożytów malarii, które infekują ludzi. Sporozoity znajdujące się w gruczołach ślinowych samic komarów Anopheles są przenoszone na ludzi poprzez ukąszenia komarów podczas karmienia krwią. Obecność sporozoitów w gruczołach ślinowych komarów określa zatem zakaźność komarów. Aby ustalić, czy komar Anopheles jest nosicielem sporozoitów Plasmodium, metoda testu immunoenzymatycznego (ELISA) jest standardowym narzędziem do wykrywania białka okołosporozoitowego Plasmodium (CSP), głównego białka powierzchniowego sporozoitów. W tej metodzie głowa wraz z klatką piersiową każdego komara jest oddzielana od brzucha, homogenizowana i poddawana kanapkowemu testowi ELISA w celu wykrycia obecności CSP specyficznego dla Plasmodium falciparum i każdego z dwóch podtypów, VK210 i VK247, Plasmodium vivax. Metoda ta została wykorzystana do zbadania przenoszenia malarii, w tym sezonowej dynamiki zakażeń komarami i gatunków głównych wektorów malarii w badanych miejscach.

Reprezentatywne wyniki testu ELISA przedstawiono na Rysunku 2. W tym doświadczeniu test ELISA na P. falciparum wykazał zakażenie sporozoitami w studzience A7. Dodatnia studzienka była możliwa do wizualnego zidentyfikowania po słabej zielonej barwie (Rysunek 2A). Wartość absorbancji tej studzienki przekraczała próg odcięcia (dwukrotność średniej wartości z czterech studzienek kontroli ujemnej) (Rysunek 2B). Rozkład wartości ...

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

Technika ELISA jest bardzo przydatna do wykrywania pasożyta malarii w wektorze komara z wysoką czułością i swoistością, a także jest w stanie przetwarzać wiele próbek w tym samym czasie. Technika ta pozwala naukowcom zachować próbki komarów do czasu, gdy będą gotowe do przetworzenia próbki, i może być wykonywana w celu różnicowania gatunków Plasmodium przy użyciu specyficznych dla gatunku przeciwciał monoklonalnych. Przygotuj próbkę, oddzielając głowę i klatkę piersiową komarów od brzucha i umieść je we wstępnie oznakowanej 1,5-mililitrowej probówce do mielenia wirówki.Dodać 50 mikrolitrów buforu do mielenia do każdej probówki i homogenizować próbkę za pomocą tłuczka. Opłucz tłuczek 250 mikrolitrami buforu do mielenia i dodaj roztwór do probówki, aby uzyskać ostateczną objętość do 300 mikrolitrów. Przygotuj płytkę ELISA dla białka okołosporozoitowego i wypełnij arkusz ELISA sporozoitu.Przygotuj roztwór przeciwciała w PBS i dodaj pięć mililitrów roztworu na płytkę. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdego dołka płytki ELISA. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez 30 minut lub przez noc w temperaturze pokojowej.Zassaj roztwór do studzienki i postukaj talerzem o ręcznik papierowy pięć razy, aby usunąć płyn. Dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do płytek dołka i przykryj pokrywką. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej i odessać zawartość studzienki.Ponownie postukaj talerzem o ręcznik papierowy, aby usunąć płyn. Dodać 50 mikrolitrów kontroli pozytywnej do studzienki H i H dwóch. Następnie dodać 50 mikrolitrów buforu blokującego do studzienek w kolumnach pierwszej i drugiej rzędów C do G. Dodać 50 mikrolitrów kontroli dodatniej do studzienek G jeden i G dwóch.Kontrolę dodatnią należy rozcieńczyć szeregowo, zaczynając od G jeden i G dwa, a następnie F jeden i F dwa aż do C jeden i C dwa. Dodać 50 mikrolitrów kontroli ujemnej do studzienek A jeden, A dwa, B jeden i B dwa. Wyekstrahuj 50 mikrolitrów roztworu homogenatu i dodaj go do nieznanego dołka.Przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Przygotować roztwór substratu, mieszając substrat A i B w stosunku jeden do jednego. Określ wymaganą objętość na podstawie dodania pięciu mililitrów działającego roztworu przeciwciała sprzężonego do każdej płytki.Oceń aktywność peroksydazy, dodając pięć mikrolitrów roztworu przeciwciała znakowanego peroksydazą do 100 mikrolitrów roztworu substratu w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Zassać zawartość studzienki i usunąć płyn, kładąc talerz do góry nogami na ręczniku papierowym. Umyj studzienki dwa razy 200 mikrolitrami PBS Tween.Zassać zawartość studzienki i postukać w płytkę pięć razy. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu przeciwciał znakowanego peroksydazą do każdej studzienki. Następnie inkubować w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej.Zassać zawartość studzienki i pięciokrotnie postukać talerzem o ręcznik papierowy. Umyj studzienki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS Tween, odessać zawartość i pięciokrotnie postukać w płytkę. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu do każdej studzienki.Przykryj płytkę i inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odczytać absorbancję przy 405 do 414 nanometrach za pomocą czytnika płytek ELISA. Próbki o absorbancji o wartości powyżej wartości odcięcia należy oznaczyć jako dodatnie i określić stężenie CSP w próbce przy użyciu wzorca.Wykreślić wartości absorbancji w funkcji stężenia roztworu, aby wygenerować krzywą wzorcową. Określ najlepsze dopasowanie za pomocą metody regresji liniowej. Rozwiąż równanie każdej wartości absorbancji dla próbki dodatniej, aby określić stężenie CSP.Po 30 minutach od wykonania testu ELISA z ABTS zakażenie sporozoitem można było wykryć po pojawieniu się słabego zielonego koloru w studni. Kontrola pozytywna nie wykazała żadnej zmiany koloru w studni. Określono wartości absorbancji dla studzienek ujemnych i dodatnich.Studzienka dodatnia wykazywała wartość absorbancji przekraczającą próg odcięcia, podczas gdy kontrole ujemne wykazywały znacznie niższe wartości. Ponadto uzyskano również wartości absorbancji pozostałych 80 nieznanych studzienek. Linia ciągła reprezentuje średnią absorbancję studzienek kontroli ujemnej, a linia przerywana reprezentuje próg dodatniości.Korzystając z krzywej standardowej, stężenie CSP w studzience A siedem określono na 0,35 pikograma na mikrolitr Ten etap przetwarzania testu ELISA należy wykonać szybko, aby zapobiec wektorowi niespecyficznemu. Ponadto wszystkie próbki i roztwór należy przechowywać w lodówce, aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów. Zaleca się, aby badacze potwierdzili pozytywne wykrycia innymi metodami, takimi jak PCR.To znacznie poprawi zaufanie, zwłaszcza gdy jedyny odczyt jest wyceniany powyżej progu. Technika ta pozwoliła naukowcom na przeprowadzenie badań na większą skalę pod kątem możliwej infekcji u komarów, co jest ważne dla identyfikacji głównego wektora.

detection-plasmodium-sporozoites-anopheles-mosquitoes-using-an-enzyme

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Opisano szybką i niedrogą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA pasożytów malarii oraz wektorów z okazów komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelex, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazach jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów, a także identyfikację molekularną gatunków bliźniaczych Anopheles za pomocą PCR.

Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

W zakażeniu Mycoplasma pneumoniae, testy serologiczne mogą dać dobre wyniki, ale z niską swoistością ze względu na immunologiczną reakcję krzyżową. Opisany w tym artykule wewnętrzny test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość gatunkową i okazał się wiarygodnym testem przesiewowym do dokładnej diagnozy M. pneumoniae.

Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Poznaj metodę ELISA do wykrywania sporozoitów Plasmodium w gruczołach ślinowych komarów Anopheles. Technika ta umożliwia badaczom przeprowadzanie dużych badań przesiewowych nad transmisją malarii.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Przeglądaj więcej filmów