Drosophila Pasywne zachowanie unikające jako nowy paradygmat badania awersyjnego uczenia się awersyjnego

Protokół ten opisuje prosty test behawioralny, który pozwala na badanie niekorzystnego uczenia się asocjacyjnego i konsolidacji pamięci u muszek, w tym wpływu interakcji genów ze środowiskiem. Przedstawiony tutaj test jest prostą, powtarzalną i opłacalną procedurą badania mechanizmów pamięci, którą można łatwo zmontować za pomocą kilku dostępnych materiałów. Test ten może dostarczyć informacji na temat podstawowych mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń uczenia się i pamięci wynikających z różnych manipulacji genetycznych, farmakologicznych i dietetycznych.

Tę procedurę zademonstrują Morgan Tedder i Steven Bradley, studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, wywierć czteromilimetrowy otwór prostopadle około czterech milimetrów od dna w 14-mililitrowej probówce do hodowli polipropylenu. Usuń górną część probówki hodowlanej, aby uzyskać 45-milimetrowy dolny fragment używany jako dolna komora.

Odetnij górną część końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby utworzyć fragment o średnicy 12 milimetrów. Włóż fragment do czteromilimetrowego otworu w probówce hodowlanej jako dok załadowczy do przenoszenia much. Wytnij 15-milimetrowy kawałek przezroczystej rurki winylowej i włóż dolną i górną komorę z przeciwległych końców do rurki.

Przymocuj zespół pionowo za pomocą dwubolcowego regulowanego zacisku. Umieść górną komorę pionowo przymocowaną rurkami amortyzującymi. Połącz rurki uderzeniowe ze stymulatorem elektrycznym, aby wytworzyć wstrząsy elektryczne.

Za pomocą lodowatego bloku unieruchom trzy- lub czterodniowe muchy i przenieś je do oddzielnych fiolek z jedzeniem na 24 godziny przed eksperymentem. Przypisać kod do wszystkich fiolek zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Delikatnie zassaj jedną muchę do aspiratora do ust, zaciągając powietrze.

Umieść muchę, lekko w dok załadunkowy i natychmiast uruchom jednominutowy minutnik i stoper. Włącz stymulator i dostarcz porażenie prądem, gdy mucha dostanie się do rurki szokowej. Naciśnij stoper, aby zarejestrować pierwsze opóźnienie.

Jeśli mucha ponownie dostanie się do rurki amortyzującej, dostarcz dodatkowe wstrząsy. Korzystając z licznika lub licznika opartego na Arduino, zapisz liczbę wstrząsów podczas jednominutowej próby. Delikatnie przenieść muchę z powrotem do fiolki pod koniec jednominutowej próby.

Rejestruj opóźnienia, liczbę otrzymanych wstrząsów i wszelkie zauważalne zmiany w zachowaniu. Używając 70% etanolu, wyczyść dolną i amortyzatorową komorę. Wytrzyj niestrzępiącą się chusteczką czyszczącą i wysusz za pomocą suszarki do włosów.

Powtórz próbę z następną muchą. Po zakończeniu eksperymentu wyczyść dolną komorę wodą i bezwonnym detergentem. Używając 70% etanolu, wytrzyj dolną komorę i komorę amortyzatora i wysusz na powietrzu przez noc.

Powtarzając powyższy proces po 24 godzinach, wykonaj drugą próbę. W podobnej kolejności przetestuj muchy. Po przeprowadzeniu testu pasywnego unikania u samców muszek Drosophila melanogaster, wyniki wykazały, że opóźnienie wzrasta, liczba wstrząsów maleje, co pokazuje, że muchy nauczyły się związku między górnym przedziałem a porażeniem prądem.

Rozkład częstotliwości ujawnił, że większość much dostaje się do górnego przedziału i otrzymuje od jednego do trzech wstrząsów w pierwszej próbie. W czwartej próbie większość much nie wchodzi do górnego przedziału i nie otrzymuje żadnych wstrząsów. W kolejnych eksperymentach czas trwania próby został skrócony do jednej minuty, ponieważ rozkład częstotliwości dla opóźnień wyraźnie pokazał, że jeśli mucha nie wejdzie do górnego przedziału w ciągu 60 sekund w pierwszej próbie, zwykle nie wchodzi wcale.

Eksperymenty z pasywnym unikaniem powtórzono na samcach i samicach much Drosophila simulans. Wyniki wykazały, że muchy były skuteczne w uczeniu się pasywnego unikania, co widać po zmianach w rozkładach częstotliwości opóźnień i wstrząsów u samców i samic much. Porównanie opóźnień i liczby wstrząsów między mężczyznami i kobietami nie wykazało istotnych statystycznie różnic.

Jednak samice much otrzymywały nieco więcej wstrząsów w każdej próbie. Analiza napadów pielęgnacji w badaniach drugim i trzecim wykazała, że całkowity czas trwania pielęgnacji znacznie się skraca u samic much od próby pierwszej do trzeciej. Sugeruje to, że muchy doświadczają stresu behawioralnego, który jest równoległy do zachowań podobnych do lęku gryzoni.

Porównanie wpływu zachodniej diety i ćwiczeń w locie na pasywne zachowania unikające pokazuje, że zachodnia dieta zmniejsza opóźnienie i zwiększa liczbę wstrząsów, co wskazuje, że zachodnia dieta upośledza awersyjne uczenie się asocjacyjne u much. I odwrotnie, ćwiczenia w locie złagodziły negatywny wpływ zachodniej diety. Próbując wykonać tę procedurę, pamiętaj, aby nie stresować much.

Zestresowane muchy albo zbyt szybko wejdą do górnego komory, albo w ogóle nie wejdą. Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane w tych samych warunkach środowiskowych i o tej samej porze dnia. Technika ta daje naukowcom nowy, prosty test, który można wykorzystać do analizy wewnętrznych mechanizmów uczenia się i konsolidacji pamięci u much.