Identyfikacja źródła wydzielanych białek w nerkach za pomocą wstrzyknięcia Brefeldin A

Nasza technika pozwala nam zidentyfikować źródło i względny udział komórek produkujących cytokiny w uszkodzonych nerkach. Stosowanie Brefeldiny A w celu zapobiegania wydzielaniu białek pozwala nam zebrać więcej informacji o komórkach produkujących cytokiny w narządach stałych, takich jak typ komórki i stan tych komórek.

Nasz protokół powinien być łatwy do dostosowania do wielu układów narządów. Ponieważ Brefeldyna A jest małą cząsteczką przepuszczalną dla komórek, powinna hamować wydzielanie w większości typów komórek, umożliwiając wykrywanie cytokin i innych wydzielanych białek.

Wstrzyknięcie kości ogonowej jest najtrudniejszym technicznie krokiem, ponieważ kość ogonowa myszy jest dość mała. Zalecamy przećwiczenie tego kroku przed wykonaniem naszego protokołu na zwierzętach doświadczalnych.

[Instruktor] Zacznij od umieszczenia klatki do połowy, a połowy z poduszki grzewczej na 10 minut, aby upewnić się, że myszy są ciepłe. Po umieszczeniu myszy w urządzeniu przytrzymującym należy trzykrotnie zdezynfekować ogon za pomocą wacika z jodonem i alkoholem. Trzymaj ogon poziomo i wizualizuj boczne żyły ogonowe. Następnie włóż igłę o rozmiarze 28, trzymając igłę i strzykawkę równolegle do żyły w kierunku głowy. Wstrzyknąć 200 mikrolitrów 1,25 miligrama na mililitr roztworu BFA. Żyła powinna stać się czysta, gdy krew zostanie zastąpiona roztworem do wstrzykiwań. Następnie wyjmij igłę i delikatnie dociśnij ogon, aż krwawienie ustanie. Umieść myszy z powrotem w klatce i monitoruj je pod kątem dodatkowego krwawienia lub oznak niepokoju. Użyj strzykawki o pojemności 20 mililitrów i przeprowadź mysz z 10 do 20 mililitrami PBS przez lewą komorę z szybkością przepływu od dwóch do czterech mililitrów na minutę, aż perfuzat stanie się przezroczysty. Usuń nerki, przytrzymując tętnicę nerkową i żyłę blisko brodawki i przecinając naczynie z boku od nerki. Następnie delikatnie wyjmij torebkę nerkową, odklejając ją ręcznie lub za pomocą cienkich sterylnych kleszczyków. Użyj markera do bariery hydrofobowej i obrysuj odcinki tkanki, zachowując co najmniej pięć milimetrów odległości od tkanki do konturu bariery hydrofobowej. Następnie dodać 50 mikrolitrów buforu blokującego zawierającego 3% surowicy osła i 0,1% trytonu w 1% albuminy surowicy bydlęcej TBS na wierzchu sekcji. Inkubuj temperaturę pokojową przez godzinę w wilgotnej komorze. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe PBS w odpowiednim stężeniu. Aby wykryć cytokiny, rozcieńczyć przeciwciała skierowane przeciwko TGF beta one, PDGF-D lub CTGF w 50 mikrolitrach PBS. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciało anty-alfa SMA sprzężone z Cy3 do roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczeniach 1:200 w celu znakowania miofibroblastów. Usuń bufor blokujący i dodaj pierwszorzędowe przeciwciała do sekcji, upewniając się, że nie wycieka ona z okrągłego hydrofobowego konturu. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Wyjmij wilgotną komorę z inkubatora i umyj szkiełka PBS trzy razy przez pięć minut. Następnie rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku jeden do 200 za pomocą PBS. Inkubować próbki z 50 mikrolitrami roztworów przeciwciał wtórnych przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i myj PBS przez pięć minut. Rozcieńczyć lektynę tetragonolobusu lotosu sprzężoną z fluoresceiną w PBS z wapniem i magnezem w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Następnie inkubować tkanki z 50 mikrolitrami roztworu LTL przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i myj je PBS z wapniem i magnezem przez pięć minut. Inkubować tkanki z 50 mikrolitrami DAPI, aby barwić jądra DNA przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj jeden raz za pomocą PBS. Dodaj 20 mikrolitrów odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu do tkanki, aby zamontować szkiełka nakrywkowe, a następnie powoli umieść szkiełko nakrywkowe. Odczekaj 24 godziny, aż odczynnik zapobiegający blaknięciu stwardnieje przed obrazowaniem. Włącz mikroskop odwrócony z automatycznym stolikiem XY i wybierz obiektyw 20x. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i zlokalizuj wycinek tkanki. Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij na żywo, aby otworzyć okno podglądu na żywo. Znajdź sekcję tkanki, upewniając się, że jest ostra. Kliknij menu pobierania i wybierz opcję skanowania dużego obrazu. Ustaw obszar do skanowania, przesuwając stolik za pomocą joysticka do skrajnej lewej części sekcji tkanki, a następnie kliknij strzałkę w lewo. Powtórz to dla górnego, prawego i dolnego segmentu tkanki. Kliknij menu pobierania i upewnij się, że pole wyboru przechwytywania wielokanałowego jest zaznaczone. Aby uchwycić obrazy wielokanałowe, kliknij zakładkę lambda, kliknij każdy kanał i ustaw czas ekspozycji na poziom, w którym barwienie jest widoczne bez nasycania jakiejkolwiek części obrazu. Powtórz tę czynność dla każdego kanału, który ma zostać zebrany. Następnie kliknij Skanuj. Otwórz oprogramowanie do pobierania obrazów i kliknij Plik. Następnie kliknij Otwórz i wybierz obraz. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno obrazu i wybierz Wielokątny zwrot z inwestycji. Obrysuj zwrot z inwestycji za pomocą narzędzia odręcznego. Następnie nakreśl komórki kanalików LTL dodatnich lub komórki śródmiąższowe alfa SMA. Kliknij zakładkę pomiaru, a następnie próg. Ustaw górny i dolny próg graniczny, dostosowując suwaki po obu stronach obszaru sygnału dodatniego. Następnie kliknij zakładkę ROI. Na koniec kliknij ikonę eksportu, aby zapisać wartości. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć procentowy udział obszaru sygnału dodatniego według obszaru ROI.

[Prezenter] Pęcherzyki TGF beta dodatnie w trzecim dniu po podaniu cisplatyny lub soli fizjologicznej są pokazane na reprezentatywnych obrazach. Pęcherzyki TGF beta dodatnie obserwuje się w PTC znakowanych LTL w nerkach leczonych cisplatyną w obecności BFA. Jednak pęcherzyków tych nie zaobserwowano w nerkach nieuszkodzonych lub nieleczonych BFA.

Modyfikacja wykazała wzrost obszaru TGF beta dodatniego po leczeniu BFA w ostrym uszkodzeniu nerek wywołanym cisplatyną. Podobnie jak TGF beta, pęcherzyki PTGF-D dodatnie lub CTGF również gromadziły się podczas leczenia BFA w AKI indukowanym cisplatyną. Kwantyfikacja wykazała, że obszary PDGF-D dodatnie i CTGF były również znacznie zwiększone w przypadku BFA: W LTL dodatnich komórkach kanalików proksymalnych wstrzyknięcie BFA nie zwiększyło znacząco poziomu BUN w osoczu w trzecim dniu po wstrzyknięciu cisplatyny. Pęcherzyki TGF beta dodatnie obserwowano w komórkach śródmiąższowych znakowanych alfa SMA w cisplatynie AKI z leczeniem BFA. Modyfikacja wykazała, że obszary TGF beta dodatnie w obszarze alfa SMA dodatnim były znacznie zwiększone po leczeniu BFA cisplatyną AKI. Podobnie jak pęcherzyki TGF beta dodatnie, pęcherzyki dodatnie CTGF również zwiększyły się po leczeniu BFA. Ocena ilościowa wykazała, że leczenie BFA zwiększyło stosunek obszaru dodatniego CTGF do obszaru dodatniego alfa SMA w AKI indukowanym cisplatyną. W porównaniu z uszkodzeniem wywołanym cisplatyną, pęcherzyki TGF-beta dodatnie w PTC były znacznie mniejsze w przewlekłej fazie AA. Stwierdzono minimalne dodatnie barwienie w LTL dodatnich PTC. Jednak intensywność sygnału TGF beta w cząsteczce uszkodzenia nerki z dodatnim PTC została zwiększona podczas leczenia BFA. Średni poziom intensywności TGF beta był trzykrotnie wyższy po wstrzyknięciu BFA niż bez BFA.

Najważniejszym krokiem jest upewnienie się, że wstrzyknięcie żyły ogonowej zakończyło się sukcesem. Nieudany zastrzyk mógłby zniweczyć wyniki. Więc proszę szukać oznak sukcesu, takich jak żyła, która staje się czysta po wstrzyknięciu, i proszę szukać oznak porażki, takich jak obrzęk nad ogonami.

Wstrzyknięcie Brefeldiny A można połączyć z wieloma testami, w tym western blot lub cytometrią przepływową, w celu oceny produkcji cytokin w skali narządu lub pojedynczej komórki.

Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie zidentyfikować nowe cytokiny wydzielane przez komórki nabłonka nerek, które wcześniej uważano za pochodzące z innych typów komórek. Może być wykorzystany do rozstrzygnięcia długotrwałych debat na temat udziału określonych typów komórek w uszkodzeniach.