Name: Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj trzy metody inokulacji do określania ras Fusarium oxysporum f. sp. niveum u arbuza. Techniki te umożliwiają diagnostykę nasilenia zakażenia i skuteczne zarządzanie chorobą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Ali i Laboratorium Diagnostyki Molekularnej Roślin, a także Dr. Pingsheng Ji z University of Georgia, których przywództwo i wsparcie pomogły w ustanowieniu naszego programu Fon.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiono trzy metody typowania ras. Każda z tych metod jest najlepiej dopasowana do konkretnych pytań i warunków eksperymentalnych. Metoda inokulacji poinfestowanych ziaren (porażenie gleby) jest być może prostsza i bardziej nieskomplikowana, co czyni ją szczególnie przydatną do oceny chorobotwórczości30. Używanie tej metody do prostego typowania rasy jest bardzo skuteczne. Jednak zastosowanie tej metody do określenia odporności konkretnej odmiany może być trudne, biorąc pod uwagę, że każda r...

Grzyby glebowe, które tworzą kompleks gatunkowy Fusarium oxysporum (FOSC), są wpływowymi hemibiotroficznymi patogenami roślin, które mogą powodować poważne choroby i straty plonów w różnych uprawach1. Więdnięcie arbuza Fusarium, wywoływane przez F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), w ciągu ostatnich kilku dekad rosło pod względem zasięgu, częstości występowania i nasilenia na całym świecie2,3. U sadzonek objawy więdnięcia Fusarium często przypominają zwilżenie. U starszych roślin liście stają się szare, chlorotyczne i nekrotyczne. W końcu więdnięcie roślin postępuje do całkowitego załamania się rośliny i śmierci4. Bezpośrednia utrata plonów występuje z powodu objawów i śmierci rośliny, podczas gdy pośrednia utrata plonów może wystąpić z powodu uszkodzeń słonecznych spowodowanych eliminacją baldachimu dolistnego5. Rozmnażanie płciowe i związane z nim struktury rozrodcze nigdy nie zostały zaobserwowane u F. oxysporum. Jednak patogen wytwarza dwa rodzaje bezpłciowych zarodników, mikro- i makrokonidia, a także większe, długoterminowe struktury przetrwania zwane chlamydosporami, które mogą przetrwać w glebie przez wiele lat6.
FOSC jest klasyfikowany do form specjalnych na podstawie obserwowanych zakresów gospodarzy, zwykle ograniczonych do jednego lub kilku gatunków gospodarzy1. Chociaż ostatnie badania wykazały, że ten kompleks gatunkowy może być złożeniem 15 różnych gatunków, konkretne gatunki, które infekują arbuzy, są obecnie nieznane7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) to nazwa grup szczepów, które infekują wyłącznie Citrullus lanatus lub udomowionego arbuza8,9. Szczepy F. oxysporum w obrębie większości patogennych formae speciale wykazują pewien poziom różnorodności w odniesieniu do ich składników genetycznych i zjadliwości w stosunku do gatunku żywiciela. Na przykład jeden szczep może zainfekować wszystkie odmiany żywiciela, podczas gdy inny może zainfekować tylko bardziej podatne odmiany. Aby wyjaśnić taką zmienność, grupy te są nieformalnie klasyfikowane do ras na podstawie powiązań ewolucyjnych lub wspólnych cech fenotypowych. W obrębie Fon scharakteryzowano cztery rasy (0, 1, 2 i 3) na podstawie ich patogenności w stosunku do zestawu wybranych odmian arbuza, przy czym odkrycie rasy 3 miało miejsce niedawno10.
Pomimo tej pozornej różnorodności, morfologie zarodników lub strzępek nie są rozróżnialne między rasami ras Fon, co oznacza, że testy molekularne lub fenotypowe są potrzebne do zidentyfikowania unikalnej rasy izolatu11. Badania molekularne zidentyfikowały pewne różnice genetyczne. Na przykład rola efektorów wydzielanych w ksylemie (SIX) jest badana od lat w F. oxysporum, a niektóre z tych efektorów zostały zlokalizowane na chromosomach wymienianych podczas poziomego transferu genów12. Na przykład SIX6 znajduje się w wyścigach Fon 0 i 1, ale nie w wyścigu 213. SZEŚĆ efektorów zostało zaangażowanych w patogeniczność F. oxysporum f. sp. lycopersici i F. oxysporum f. sp. cubense, które powodują więdnięcie Fusarium odpowiednio na pomidorach i bananach14,15,16,17. Analiza SZEŚCIU profili efektorowych wśród szczepów F. oxysporum f. sp. spiniciae, patogenu więdnącego Fusarium na szpinaku, umożliwiła klasyfikację, która dokładnie odzwierciedla różnorodność genetyczną i fenotypową18. Jednak różnice między mechanizmami wirulencji ras Fon nie są obecnie w pełni zrozumiałe, a testy molekularne opracowane po ich użyciu wykazały niespójne i niedokładne wyniki19. Dlatego wyniki fenotypowe z testów infekcji są obecnie najlepszym sposobem klasyfikacji izolatów.
F. oxysporum początkowo infekuje gospodarzy przez korzenie, zanim przedostanie się do xylem20. To sprawia, że bezpośrednia inokulacja korzeni danej odmiany gospodarza jest skutecznym sposobem na przeprowadzenie typowania rasowego i jest podstawą metod inokulacji root-dip i tray-dip21. Gdy nie zaraża żywiciela, F. oxysporum przebywa w glebie i może pozostawać w stanie uśpienia przez lata. Uprawa podatnych odmian arbuza w glebie z pola zainteresowania jest jednym ze sposobów sprawdzenia obecności Fon. Rozszerzenie tej metody na odmiany o różnych znanych poziomach odporności w glebie, która jest celowo porażona przez Fon, jest również dobrym sposobem na przeprowadzenie typowania rasowego (Tabela 1) i stanowi podstawę metody wysiewu porażonych ziaren. Zmodyfikowana metoda zanurzania tacek jest odmianą oryginalnej metody zanurzania tacy, która pozwala na wysokoprzepustowe typowanie rasowe, w którym można szybko zbadać wiele roślin i izolatów polowych22. Ważnymi czynnikami szybkiego i skutecznego testu biologicznego typowania rasowego są użycie odmian, które mają udokumentowane różnice w odporności na różne rasy patogenów, zapewnienie, że inokulum jest zarówno biologicznie aktywne, jak i obfite podczas infekcji, utrzymanie środowiska, które sprzyja zarówno patogenowi, jak i gospodarzowi, oraz stosowanie spójnego systemu oceny ciężkości lub częstości występowania choroby. Ten artykuł opisuje metody root-dip23,24, zainfekowane metody wysiewu ziaren25,26 oraz zmodyfikowane metody tray-dip22 do fenotypowego typowania rasy oparte na zasadach opisanych powyżej.

<table><tbody><tr><td>100% pełniejszy" s Earth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F200-5KG</td><td></td></tr><tr><td>1 L szklana kolba Erlenmeyer</td><td>PYREX</td><td>4980-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki sokoła</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>Butla z podziałką 50 ml</td><td>Lab Safety Supply</td><td>41121805</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Eppendorf Rurki stożkowe Fisher</td><td>Scientific</td><td>05-413-921</td><td></td></tr><tr><td>Folia</td> <td>aluminiowaReynolds Wrap</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Walmart</td><td>587192290</td><td></td></tr><tr><td>palnik Bunsena</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-301</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>sigma-Aldrich</td><td>239216</td><td></td></tr><tr><td>rozsiewacze komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td></td></tr><tr><td>Serowica</td><td>Lions Services, Inc</td><td>8305-01-125-0725</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste plastikowe naczynia</td><td>Visions Wave</td><td>999RP6CLSS</td> <td>o średnicy ~ 15 cm</td></tr><tr><td>Przezroczyste rurki winylowe do zacisków do worków na grzyby</td><td>Dostawa grzybów 6</td><td></td><td>"do małej torby, 8" do średniej torby, 10 " do dużej torby</td></tr><tr><td>Bawełniane kulki</td><td>Fisherbrand</td><td>22-456-885</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A4094</td><td>100%, a następnie połącz z wodą, aby uzyskać 70% do użycia</td></tr><tr><td>Lampy fluorescencyjne</td><td>MaxLume</td><td>Model T5</td><td>2800 K Temperatura barwowa, agar granulowany o długości 24 '' lub 48 ''</td></tr><tr><td></td><td>VWR International</td><td>90000-786</td><td></td></tr><tr><td>Ręczna butelka z rozpylaczem</td><td>Możliwość jednego</td> hemacytometru <td>24122002</td> <td>~ 0,95 l</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-55A</td><td>Hemacytometr dwukomorowy</td></tr><tr><td>Tace laboratoryjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-236-2A</td><td></td></tr><tr><td>Duże, zamykane torby plastikowe</td><td>Ziploc</td><td>430805</td><td>38 cm x 38 cm</td></tr><tr><td>Zamgłaszczarka / konewka</td><td>Bar5F</td><td>B10H22</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk do worków na grzyby</td><td>Dostawa</td><td></td> grzybów <td>6" do małej torby, 8" do średniej torby, 10" do dużej torby</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td></td></tr><tr><td>Organiczne Jagody żyta</td><td>Zapas grzybów Worki</td><td></td><td>0,5 galona lub 25 funtów</td></tr><tr><td>Pipeta i końcówki P1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713</td><td>Okrągły, średnica 100 mm, wysokość 15 mm</td></tr><tr><td>Podłoża do sadzenia</td><td>Jolly Gardener</td><td>Pro-Line C/B</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy dzbanek</td><td>BrandTech</td><td>UX0600850</td><td>1 l lub większy</td></tr><tr><td>Doniczki plastikowe</td><td>Neo/SCI</td><td>01-1177~</td><td>15 cm średnicy i ~10 cm wysokości</td></tr><tr><td>Plastikowy, bezpieczny w autoklawie kosz</td><td>Thermo Scientific</td><td>UX0601022</td><td>3 L</td></tr><tr><td>Pożywka agarowa z dekstrozą ziemniaczaną o mocy ćwiartki</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX1420028</td><td>Użyj proszku w połączeniu z przepisem na naukową wagę QPDA</td></tr><tr><td>, mierząc w g</td><td>Ohaus</td><td>30208458</td><td>Sprawdzi się każda precyzyjna waga, która może pomieścić i zmierzyć 200 g</td></tr><tr><td>Rozmiar #4 otwór korkowy</td><td>Cole-Parmer</td><td>NC9585352</td><td></td></tr><tr><td>Mała torba do uprawy grzybów</td><td>Filtr Shroom Supply</td><td></td><td>0,5 mikrona, występuje również w średnich i dużych rozmiarach</td></tr><tr><td>Kielnia do gleby</td><td>Walmart</td><td>563876946</td><td></td></tr><tr><td>Styropianowe mieszkania (6 x 12 komórek)</td><td>Speedling</td><td>Model TR72A</td><td></td></tr><tr><td>Styropianowe mieszkania (8 x 16 komórki)</td><td>Speedling</td><td>Model TR128A</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (5 lub 10 ml)</td><td>fisher Scientific</td><td>14-829-19C</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Walmart</td><td>TM-01</td><td></td></tr><tr><td>V8 Oryginalny 100% sok warzywny</td><td>Walmart</td><td>564638212</td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-418</td><td></td></tr><tr><td>Pestki arbuza - Black Diamond</td><td>Willhite Seed Inc</td><td>17</td><td></td></tr><tr><td>Pestki arbuza - Calhoun Gray</td><td>Holmes Seed Company</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>Nasiona arbuza - Charleston Grey</td><td>Bonnie Plants</td><td>7.15339E+11</td><td></td></tr><tr><td>Nasiona arbuza - PI 296341-FR</td><td>Autorzy kontaktowi</td><td>Autorzy Skontaktuj się z autorami</td><td></td></tr><tr><td>Ziarna pszenicy (Maxie var.) (opcjonalnie)</td><td>Alachua County Feed & Nasienie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: izolatów

A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates

Więdnące mięso arbuza (Citrullus lanatus), spowodowane przez Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ponownie stało się głównym ograniczeniem produkcji w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych, zwłaszcza na Florydzie. Stosowanie strategii integrowanej ochrony przed szkodnikami, takich jak odmiany odporne specyficzne dla danej rasy, wymaga informacji na temat różnorodności i gęstości populacji patogenu na polach hodowców. Pomimo pewnego postępu w opracowywaniu molekularnych narzędzi diagnostycznych do identyfikacji izolatów patogenów, określenie rasy często wymaga podejść opartych na testach biologicznych.
Typowanie rasy zostało przeprowadzone przez inokulację zanurzeniową w korzeniach, metodę wysiewu zainfekowanych ziaren oraz zmodyfikowaną metodę zanurzania tacek z każdym z czterech różnic arbuza (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Izolatom przypisuje się oznaczenie rasy poprzez obliczenie częstości występowania choroby pięć tygodni po zaszczepieniu. Jeśli mniej niż 33% roślin dla danej odmiany było objawowych, były one klasyfikowane jako odporne. Odmiany, których częstość występowania przekraczała 33%, uznano za podatne. W artykule opisano trzy różne metody inokulacji w celu ustalenia rasy, zanurzenia w korzeniach, zainfekowanego ziarna i zmodyfikowanego szczepienia tacowego, których zastosowania różnią się w zależności od projektu eksperymentalnego.

Eksperymenty te pomagają określić względną odporność powszechnie uprawianych odmian (Tabela 1). Informacje te mogą następnie służyć do formułowania zaleceń dotyczących zarządzania w zależności od lokalnych populacji Fon. Innymi słowy, jeśli wiadomo, że na polu komercyjnym występuje rasa 0 lub 1, rolnik może zdecydować się na uprawę odmiany „odpornej”, takiej jak Calhoun Gray, Sunsugar lub odpowiedniej alternatywy. Wyniki bioassay z wykorzystaniem wszystkich metod wykazały, że po zainfekowaniu siewek izol...

Opanowanie więdnięcia arbuza przez Fusarium wymaga wiedzy na temat obecnych ras patogenów. Tutaj opisujemy metody zanurzania korzeni, poinfestowanego wysiewu ziaren i zmodyfikowanego zaszczepiania tacowego, aby wykazać ich skuteczność w typowaniu rasowym chorobotwórczego grzyba Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów

Fusarium wilt of watermelon (Citrullus lanatus), caused by Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), has reemerged as a major production constraint in the ...

Protokół ten może pomóc osobom zaangażowanym w społeczność arbuzów w ocenie patogenu więdnięcia fusarium, a to pomoże określić obecne populacje patogenów i pomóc w skutecznym zarządzaniu nimi. Więdnięcie fusarium typu rasowego jest skomplikowane i czasochłonne, a posiadanie trzech realnych opcji testów biologicznych typu rasowego pozwoli użytkownikom wybrać metodę najlepiej dopasowaną do ich warunków eksperymentalnych. Wszystkie trzy metody pomagają lekarzom zajmującym się zdrowiem roślin zdiagnozować potencjalną nasilenie infekcji więdnięciem fusarium związanych z określonym izolatem.Informacje te umożliwiają podejmowanie świadomych i skutecznych decyzji dotyczących zintegrowanego zarządzania chorobą. Aby rozpocząć przygotowania do sadzenia, wypełnij mieszkania startowe 8x16 komórek podłożem do sadzenia, jednocześnie stukając w dół, aby zagęścić glebę. Następnie wysiewaj nasiona wierzchołkiem skierowanym do góry na głębokość równą ich długości.Po wysianiu nasion przykryj podłoże zawierające zakopane nasiona ziemią Fullera na głębokość od 0,3175 do 0,635 centymetra, a następnie spryskaj mieszkania, aby zwilżyć podłoże bez tworzenia stojącej lub gromadzącej się wody. Następnie utrzymuj podłoże wilgotne, spryskując je przez 20 sekund co 180 minut przez pięć dni, aż do wykiełkowania nasion. Po wykiełkowaniu podlewaj mieszkania raz dziennie.Pięć dni po posadzeniu umieść infiltrowane krążki papierowe o średnicy od 1 do 1,25 centymetra zawierające preferowany izolat Fusarium oxysporum na jednym sklarowanym podłożu sokowym V8 i agarze z dekstrozą ziemniaczaną o mocy 1/4 lub pożywce QPDA, aby przechowywać je w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez osiem dni. Ósmego dnia przenieś płytki V8 i QPDA do komory bezpieczeństwa biologicznego przed usunięciem konidiów poprzez zeskrobanie sterylnego rozsiewacza komórek po powierzchni pożywki i zbierz płynną zawiesinę konidiów do sterylnej 50-mililitrowej probówki hodowlanej. Następnie określ ilościowo liczbę zarodników i przygotuj końcowy roztwór inokulum, przenosząc obliczoną objętość około 1 miliona zarodników do świeżej sterylnej probówki hodowlanej i zwiększając całkowitą objętość do 30 mililitrów sterylną wodą dejonizowaną.Aby przygotować się do inokulacji, umieść 6x12-komórkowe styropianowe mieszkania uprzednio zdezynfekowane 10% wybielaczem i dobrze wypłukane, aby przyjąć zaszczepione rośliny. Na kilka godzin przed inokulacją dokładnie podlej rośliny. Dwie godziny po podlaniu usuń sadzonki z 8x16-komórkowych styropianowych płaskich wnętrz i opłucz ich korzenie.Następnie tymczasowo przechowuj wypłukane rośliny w czystych pojemnikach z wodą z kranu do czasu użycia, trzymając odmiany oddzielnie od siebie. Później podziel sadzonki na grupy po sześć osobników i trzymaj grupy sadzonek zawinięte w mokre ręczniki papierowe na tacy laboratoryjnej. Umieść od 25 do 30 centymetrów sześciennych gleby na dnie każdej komórki styropianowej tacki 6x12 i użyj butelki ze spryskiwaczem, aby zwilżyć glebę, aż będzie widocznie wilgotna.Zaczynając od zdrowej kontroli, umieść grupę nieuszkodzonych sześciu sadzonek tej samej odmiany w 50-mililitrowych probówkach zawierających inokulum. Aby zaszczepić, należy wirować rurki sadzonek z korzeniami zanurzonymi na 30 sekund. Następnie umieść pojedynczą sadzonkę na komórkę w styropianowych płaskownikach 6x12 z roślinami tej samej odmiany w jednej kolumnie tacy.Przykryj sadzonki podłożem do sadzenia i delikatnie zamocuj. Użyj strzykawki, aby zwilżyć sadzonkę 20 mililitrami wody, unikając rozpryskiwania. Po przesadzeniu wszystkich sadzonek umieść je na noc w zamkniętym, ciemnym środowisku o średniej temperaturze 27 stopni Celsjusza.Aby zainfekować ziarna, należy przygotować inokulum, izolując i hodując szczep fusarium oxysporum niveum na płytce QPDA do punktu, w którym jego wzrost pokrywa połowę płytki. Przygotuj jądra, dodając sterylną wodę z kranu do litrowych szklanych kolb Erlenmeyera zawierających 200 gramów ziaren, aby całkowicie pokryć ziarna do co najmniej pięciu centymetrów. Po namoczeniu ziaren w kolbach w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez dwie godziny, spuść wodę z kolby i zatkaj otwór kolby kawałkiem bawełnianej rolki owiniętej w gazę serową, a następnie przykryj otwór folią aluminiową.Wysterylizować kolby w autoklawie w cyklu grawitacyjnym przez jedną godzinę z pięciominutowym czasem suszenia, a następnie pozostawić kolby do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Przenieś ziarna do worka do uprawy pieczarek z filtrem. Usuń powietrze z torby, a następnie złóż nadmiar plastiku wokół niej.Umieść worek w plastikowym pojemniku bezpiecznym w autoklawie i przykryj pojemnik folią aluminiową, a następnie ponownie autoklaw przy tych samych ustawieniach, co poprzednio. Po autoklawowaniu pozwól grzybowi inkubować na ziarnach w torbie przez trzy tygodnie. Użyj sterylnego otworu korkowego o rozmiarze numer cztery, aby wyciąć krążki agarowe o średnicy sześciu milimetrów ze strefy aktywnego wzrostu na płytce hodowlanej.Rozłóż torbę, aby umieścić w niej pięć krążków agarowych przy ścisłej sterylnej technice. Użyj sterylnego 50-mililitrowego cylindra z podziałką do odmierzenia i dodaj 35 mililitrów sterylnej wody z kranu do torby. Napełnij plastikową doniczkę mieszanką doniczkową, a następnie dodaj odmierzoną ilość mieszanki doniczkowej do dużej plastikowej torby zawierającej 14 ziaren porażonych ziaren.Stwórz poduszkę powietrzną w torbie i zamknij ją przed zmieszaniem ziaren i gleby, kilkakrotnie odwracając worek. Po zakończeniu napełnij wysterylizowaną powierzchniowo doniczkę porażoną mieszanką gleby. Powtórz ten proces dla każdej pozostałej odmiany arbuza, aby uzyskać w sumie cztery pełne doniczki z porażoną glebą na badany izolat.Następnie zasiej sześć nasion arbuza w doniczce wierzchołkowym końcem nasion skierowanym do góry. Za pomocą butelki z rozpylaczem zwilż górne 0,3 do 0,6 centymetra gleby wodą, a następnie umieść przezroczyste plastikowe naczynie pod i nad każdą doniczką. Wypełnij 48 wkładów komórkowych pasteryzowanym parą wodną, torfem, wermikulitem w stosunku 4:1:1 i stukaj w wkłady, aby ścisnąć glebę.Następnie umieść wkładki w plastikowych tacach i zasiej nasiona, jak wyjaśniono wcześniej. Siedem dni przed sadzeniem zaszczep pięć płytek QPDA infiltrowanym papierem, aby przechowywać je w inkubowanym obszarze przez osiem dni w cyklu ciemnym 14 godzin/10 godzin. Siódmego dnia przenieść dwie jednocentymetrowe zatyczki agarowe do każdej 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 100 mililitrów dekstrozy ziemniaczanej i umieścić kolby Erlenmeyera na wytrząsarce stołowej.W dniu inokulacji zbierz zarodniki, filtrując inokulum przez cztery warstwy sterylnej gazy serowej, aby określić stężenie mikrokonidiów w kolbie. 14 dni po wysianiu przenieś wkładki komórkowe z sadzonkami do tacy, a następnie umieść parcianą tacę z sadzonkami w plastikowej pojemniku zawierającej siedem litrów zawiesiny inokulum. Po 15 minutach utrzymywania inokulum w stanie nienaruszonym, przenieś wkładki komórkowe zawierające zaszczepione sadzonki do tacek bez otworów i umieść tace bez otworów na ławce szklarniowej, a następnie podlej w razie potrzeby.Utrzymuj warunki oświetleniowe i środowiskowe zgodnie z wcześniejszym opisem dla testu biologicznego zanurzania korzeni. W zależności od zastosowanej metody, rozpocznij ocenę od obserwacji i obliczenia częstości więdnięcia i obumierania roślin, a następnie wykonaj zdjęcia cyfrowe, aby udokumentować postęp choroby. W zmodyfikowanej metodzie zanurzania w tacce odmiany Black Diamond i Charleston Grey zakażone izolatem rasy 2 wykazywały poważne objawy i zmarły.Natomiast odmiana Citrullus amarus PI wykazała odporność. W metodzie zanurzania korzeni siewki zakażone izolatem rasy 0 w większości przeżyły, podczas gdy prawie wszystkie siewki zakażone izolatem rasy 3 zmarły. W metodzie zainfekowanych ziaren odmiany Sugar Baby i Charleston Gray uprawiane na glebie porażonej przez rasę 2 zaczęły więdnąć i obumierać, podczas gdy rośliny Citrullus amarus PI nadal wydają się zdrowe.Pamiętaj, aby odpowiednio wysiewać i pielęgnować rośliny, sprawdzać izolat patogenu pod kątem żywotności, rozumieć unikalne techniki każdej metody inokulacji i być konsekwentnym w ocenie objawów choroby. Dzięki wynikom tych metod naukowcy mogą zbadać podstawowe determinanty genetyczne rządzące ekspresją wariancji różnicowej między izolatami poprzez sekwencjonowanie i porównawczą analizę genomiczną. Korzystając z tych metod, naukowcy byli w stanie ocenić występowanie różnych fenotypów wirulencji w różnych lokalizacjach i porównać te fenotypy z obserwowalnymi elementami genetycznymi.

a-contrast-three-inoculation-techniques-used-to-determine-race

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis.  Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Przedstawiamy protokół budowy prostego systemu dystrybucji zarodników, składającego się z pudełka do zaszczepiania z siatką ~50 μm i przezroczystej komory z tworzywa sztucznego. Można to wykorzystać do równomiernego zaszczepienia roślin zarodnikami mączniaka prawdziwego, umożliwiając w ten sposób dokładną i odtwarzalną ocenę fenotypów chorobowych badanych roślin.

Łatwa i elastyczna metoda inokulacji do dokładnej oceny fenotypów infekcji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis i innych roślin

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

W tym protokole ilustrowano test amplifikacji polimerazy rekombinazowej CRISPR/Cas12a do wykrywania inwazyjnego patogenu roślinnego, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Poznaj trzy metody inokulacji do określania ras Fusarium oxysporum f. sp. niveum u arbuza. Techniki te umożliwiają diagnostykę nasilenia zakażenia i skuteczne zarządzanie chorobą.

Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów (Wideo) | JoVE Journal

Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów

Przeglądaj więcej filmów