Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów

Protokół ten może pomóc osobom zaangażowanym w społeczność arbuzów w ocenie patogenu więdnięcia fusarium, a to pomoże określić obecne populacje patogenów i pomóc w skutecznym zarządzaniu nimi. Więdnięcie fusarium typu rasowego jest skomplikowane i czasochłonne, a posiadanie trzech realnych opcji testów biologicznych typu rasowego pozwoli użytkownikom wybrać metodę najlepiej dopasowaną do ich warunków eksperymentalnych. Wszystkie trzy metody pomagają lekarzom zajmującym się zdrowiem roślin zdiagnozować potencjalną nasilenie infekcji więdnięciem fusarium związanych z określonym izolatem.

Informacje te umożliwiają podejmowanie świadomych i skutecznych decyzji dotyczących zintegrowanego zarządzania chorobą. Aby rozpocząć przygotowania do sadzenia, wypełnij mieszkania startowe 8x16 komórek podłożem do sadzenia, jednocześnie stukając w dół, aby zagęścić glebę. Następnie wysiewaj nasiona wierzchołkiem skierowanym do góry na głębokość równą ich długości.

Po wysianiu nasion przykryj podłoże zawierające zakopane nasiona ziemią Fullera na głębokość od 0,3175 do 0,635 centymetra, a następnie spryskaj mieszkania, aby zwilżyć podłoże bez tworzenia stojącej lub gromadzącej się wody. Następnie utrzymuj podłoże wilgotne, spryskując je przez 20 sekund co 180 minut przez pięć dni, aż do wykiełkowania nasion. Po wykiełkowaniu podlewaj mieszkania raz dziennie.

Pięć dni po posadzeniu umieść infiltrowane krążki papierowe o średnicy od 1 do 1,25 centymetra zawierające preferowany izolat Fusarium oxysporum na jednym sklarowanym podłożu sokowym V8 i agarze z dekstrozą ziemniaczaną o mocy 1/4 lub pożywce QPDA, aby przechowywać je w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez osiem dni. Ósmego dnia przenieś płytki V8 i QPDA do komory bezpieczeństwa biologicznego przed usunięciem konidiów poprzez zeskrobanie sterylnego rozsiewacza komórek po powierzchni pożywki i zbierz płynną zawiesinę konidiów do sterylnej 50-mililitrowej probówki hodowlanej. Następnie określ ilościowo liczbę zarodników i przygotuj końcowy roztwór inokulum, przenosząc obliczoną objętość około 1 miliona zarodników do świeżej sterylnej probówki hodowlanej i zwiększając całkowitą objętość do 30 mililitrów sterylną wodą dejonizowaną.

Aby przygotować się do inokulacji, umieść 6x12-komórkowe styropianowe mieszkania uprzednio zdezynfekowane 10% wybielaczem i dobrze wypłukane, aby przyjąć zaszczepione rośliny. Na kilka godzin przed inokulacją dokładnie podlej rośliny. Dwie godziny po podlaniu usuń sadzonki z 8x16-komórkowych styropianowych płaskich wnętrz i opłucz ich korzenie.

Następnie tymczasowo przechowuj wypłukane rośliny w czystych pojemnikach z wodą z kranu do czasu użycia, trzymając odmiany oddzielnie od siebie. Później podziel sadzonki na grupy po sześć osobników i trzymaj grupy sadzonek zawinięte w mokre ręczniki papierowe na tacy laboratoryjnej. Umieść od 25 do 30 centymetrów sześciennych gleby na dnie każdej komórki styropianowej tacki 6x12 i użyj butelki ze spryskiwaczem, aby zwilżyć glebę, aż będzie widocznie wilgotna.

Zaczynając od zdrowej kontroli, umieść grupę nieuszkodzonych sześciu sadzonek tej samej odmiany w 50-mililitrowych probówkach zawierających inokulum. Aby zaszczepić, należy wirować rurki sadzonek z korzeniami zanurzonymi na 30 sekund. Następnie umieść pojedynczą sadzonkę na komórkę w styropianowych płaskownikach 6x12 z roślinami tej samej odmiany w jednej kolumnie tacy.

Przykryj sadzonki podłożem do sadzenia i delikatnie zamocuj. Użyj strzykawki, aby zwilżyć sadzonkę 20 mililitrami wody, unikając rozpryskiwania. Po przesadzeniu wszystkich sadzonek umieść je na noc w zamkniętym, ciemnym środowisku o średniej temperaturze 27 stopni Celsjusza.

Aby zainfekować ziarna, należy przygotować inokulum, izolując i hodując szczep fusarium oxysporum niveum na płytce QPDA do punktu, w którym jego wzrost pokrywa połowę płytki. Przygotuj jądra, dodając sterylną wodę z kranu do litrowych szklanych kolb Erlenmeyera zawierających 200 gramów ziaren, aby całkowicie pokryć ziarna do co najmniej pięciu centymetrów. Po namoczeniu ziaren w kolbach w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez dwie godziny, spuść wodę z kolby i zatkaj otwór kolby kawałkiem bawełnianej rolki owiniętej w gazę serową, a następnie przykryj otwór folią aluminiową.

Wysterylizować kolby w autoklawie w cyklu grawitacyjnym przez jedną godzinę z pięciominutowym czasem suszenia, a następnie pozostawić kolby do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Przenieś ziarna do worka do uprawy pieczarek z filtrem. Usuń powietrze z torby, a następnie złóż nadmiar plastiku wokół niej.

Umieść worek w plastikowym pojemniku bezpiecznym w autoklawie i przykryj pojemnik folią aluminiową, a następnie ponownie autoklaw przy tych samych ustawieniach, co poprzednio. Po autoklawowaniu pozwól grzybowi inkubować na ziarnach w torbie przez trzy tygodnie. Użyj sterylnego otworu korkowego o rozmiarze numer cztery, aby wyciąć krążki agarowe o średnicy sześciu milimetrów ze strefy aktywnego wzrostu na płytce hodowlanej.

Rozłóż torbę, aby umieścić w niej pięć krążków agarowych przy ścisłej sterylnej technice. Użyj sterylnego 50-mililitrowego cylindra z podziałką do odmierzenia i dodaj 35 mililitrów sterylnej wody z kranu do torby. Napełnij plastikową doniczkę mieszanką doniczkową, a następnie dodaj odmierzoną ilość mieszanki doniczkowej do dużej plastikowej torby zawierającej 14 ziaren porażonych ziaren.

Stwórz poduszkę powietrzną w torbie i zamknij ją przed zmieszaniem ziaren i gleby, kilkakrotnie odwracając worek. Po zakończeniu napełnij wysterylizowaną powierzchniowo doniczkę porażoną mieszanką gleby. Powtórz ten proces dla każdej pozostałej odmiany arbuza, aby uzyskać w sumie cztery pełne doniczki z porażoną glebą na badany izolat.

Następnie zasiej sześć nasion arbuza w doniczce wierzchołkowym końcem nasion skierowanym do góry. Za pomocą butelki z rozpylaczem zwilż górne 0,3 do 0,6 centymetra gleby wodą, a następnie umieść przezroczyste plastikowe naczynie pod i nad każdą doniczką. Wypełnij 48 wkładów komórkowych pasteryzowanym parą wodną, torfem, wermikulitem w stosunku 4:1:1 i stukaj w wkłady, aby ścisnąć glebę.

Następnie umieść wkładki w plastikowych tacach i zasiej nasiona, jak wyjaśniono wcześniej. Siedem dni przed sadzeniem zaszczep pięć płytek QPDA infiltrowanym papierem, aby przechowywać je w inkubowanym obszarze przez osiem dni w cyklu ciemnym 14 godzin/10 godzin. Siódmego dnia przenieść dwie jednocentymetrowe zatyczki agarowe do każdej 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 100 mililitrów dekstrozy ziemniaczanej i umieścić kolby Erlenmeyera na wytrząsarce stołowej.

W dniu inokulacji zbierz zarodniki, filtrując inokulum przez cztery warstwy sterylnej gazy serowej, aby określić stężenie mikrokonidiów w kolbie. 14 dni po wysianiu przenieś wkładki komórkowe z sadzonkami do tacy, a następnie umieść parcianą tacę z sadzonkami w plastikowej pojemniku zawierającej siedem litrów zawiesiny inokulum. Po 15 minutach utrzymywania inokulum w stanie nienaruszonym, przenieś wkładki komórkowe zawierające zaszczepione sadzonki do tacek bez otworów i umieść tace bez otworów na ławce szklarniowej, a następnie podlej w razie potrzeby.

Utrzymuj warunki oświetleniowe i środowiskowe zgodnie z wcześniejszym opisem dla testu biologicznego zanurzania korzeni. W zależności od zastosowanej metody, rozpocznij ocenę od obserwacji i obliczenia częstości więdnięcia i obumierania roślin, a następnie wykonaj zdjęcia cyfrowe, aby udokumentować postęp choroby. W zmodyfikowanej metodzie zanurzania w tacce odmiany Black Diamond i Charleston Grey zakażone izolatem rasy 2 wykazywały poważne objawy i zmarły.

Natomiast odmiana Citrullus amarus PI wykazała odporność. W metodzie zanurzania korzeni siewki zakażone izolatem rasy 0 w większości przeżyły, podczas gdy prawie wszystkie siewki zakażone izolatem rasy 3 zmarły. W metodzie zainfekowanych ziaren odmiany Sugar Baby i Charleston Gray uprawiane na glebie porażonej przez rasę 2 zaczęły więdnąć i obumierać, podczas gdy rośliny Citrullus amarus PI nadal wydają się zdrowe.

Pamiętaj, aby odpowiednio wysiewać i pielęgnować rośliny, sprawdzać izolat patogenu pod kątem żywotności, rozumieć unikalne techniki każdej metody inokulacji i być konsekwentnym w ocenie objawów choroby. Dzięki wynikom tych metod naukowcy mogą zbadać podstawowe determinanty genetyczne rządzące ekspresją wariancji różnicowej między izolatami poprzez sekwencjonowanie i porównawczą analizę genomiczną. Korzystając z tych metod, naukowcy byli w stanie ocenić występowanie różnych fenotypów wirulencji w różnych lokalizacjach i porównać te fenotypy z obserwowalnymi elementami genetycznymi.