Name: Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej 1-13C pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Naucz się oceny metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR. Ta metoda umożliwia badanie aktywności metabolicznej i energetyki serca w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Izraelskiej Fundacji Naukowej na podstawie umowy o grant nr 1379/18; stypendium im. Jabotyńskiego izraelskiego Ministerstwa Nauki i Technologii w zakresie nauk stosowanych i inżynieryjnych dla doktorantów bezpośrednich nr 3-15892 dla doktorantów D.S.; oraz program Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 858149 (AlternativesToGd).

Nie ma żadnych ujawnień.

Prezentujemy układ eksperymentalny zaprojektowany do badania metabolizmu hiperpolaryzowanego [1-13C]pirogronianu, energetyki tkanek oraz pH w modelu izolowanego serca myszy.
Kluczowe etapy protokołu są następujące: 1) zapewnienie, aby pH buforu wynosiło 7,4; 2) upewnienie się, że wszystkie składniki buforu zostały dodane; 3) zapobieganie krzepnięciu krwi w naczyniach serca poprzez iniekcje heparyny; 4) zapobieganie uszkodzeniom niedokrwiennym serca poprzez ograniczenie aktywności me...

Zmiany w metabolizmie serca są związane z różnymi kardiomiopatiami i często stanowią podstawę leżących u ich podstaw mechanizmów patofizjologicznych1. Istnieje jednak wiele przeszkód w badaniu metabolizmu w żywych tkankach, ponieważ większość testów biochemicznych wymaga homogenizacji tkanki i lizy komórek i/lub śledzenia radioaktywnego. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe narzędzia do badania metabolizmu mięśnia sercowego w żywych tkankach. Rezonans magnetyczny (MR) hiperspolaryzowanych substratów znakowanych 13C pozwala na pomiary metabolizmu w żywych tkankach w czasie rzeczywistym2, bez użycia promieniowania jonizującego, poprzez zwiększenie stosunku sygnału do szumu MR (SNR) znakowanego miejsca (miejsc) o kilka rzędów wielkości3. W tym miejscu opisujemy konfigurację eksperymentalną, podejście akwizycyjne i analityczne podejście do badania szybkiego metabolizmu w izolowanym sercu myszy i równolegle przedstawiamy wskaźniki ogólnej energetyki i kwasowości tkanek. pH serca jest cennym wskaźnikiem, ponieważ równowaga kwasowo-zasadowa jest zaburzona we wczesnych stadiach chorób serca i stanów, takich jak niedokrwienie mięśnia sercowego, nieadaptacyjny przerost i niewydolność serca6.
Hiperspolaryzowana produkcja [1-13C]mleczanu i [13C]wodorowęglanów z hiperspolaryzowanego [1-13 C]pirogronianu pomaga w określeniu szybkości produkcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i dehydrogenazy pirogronianowej (PDH). Większość wcześniejszych badań przeprowadzonych przy użyciu hiperspolaryzowanych substratów w izolowanym sercu gryzoni albo wykorzystywała złożone modele kinetyczne do wyprowadzenia aktywności enzymatycznej LDH i PDH, albo podawała stosunki intensywności sygnału produktu hiperspolaryzowanego do substratu bez obliczania rzeczywistych wskaźników aktywności enzymu2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. W tym przypadku zastosowaliśmy podejście selektywnego wzbudzenia nasycającego produkt15, które pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w sposób niewymagający modelu15,16. W ten sposób określono bezwzględne wskaźniki enzymatyczne (tj. liczbę moli produktu wytworzonego w jednostce czasu). Rozdział 31Spektroskopia P została wykorzystana do obserwacji sygnałów nieorganicznego fosforanu (Pi), fosfokreatyny (PCr) i trifosforanu adenozyny (ATP). Zastosowano analizę wieloparametryczną w celu scharakteryzowania rozkładu pH serca, czego dowodem jest niejednorodne przesunięcie chemiczne w sygnale Pi tkanki.
Wstecznie perfundowane serce myszy (serce Langendorffa)17,18,19 to model ex vivo dla nienaruszonego bijącego serca. W tym modelu żywotność serca i pH są zachowane przez co najmniej 80 min20 i wykazano potencjał do regeneracji po długotrwałym urazie niedokrwiennym21,22. Niemniej jednak niezamierzona zmienność podczas mikrochirurgii może prowadzić do zmienności żywotności tkanek w sercach. Wcześniejsze badania donosiły o pogarszaniu się stanu tego serca w miarę upływu czasu19; Na przykład zaobserwowano zmniejszenie funkcji skurczu o 5%-10% na godzinę18. Wcześniej wykazano, że sygnał trifosforanu adenozyny (ATP) informuje o stanie energetycznym i żywotności mięśnia sercowego23. Tutaj zauważyliśmy, że perfuzja serca może czasami wykazywać niezamierzoną zmienność poziomów żywotności, o czym świadczy zawartość ATP, pomimo faktu, że mieliśmy nieprzerwaną perfuzję i dopływ tlenu. Wykazujemy tutaj, że normalizacja wskaźników LDH i PDH do zawartości ATP w sercu zmniejsza zmienność między sercami w tych wskaźnikach.
W poniższym protokole opisujemy procedurę chirurgiczną stosowaną do kanneulacji serca, izolacji i następującej po niej perfuzji w spektrometrze NMR. Warto zauważyć, że inne podejścia chirurgiczne mające na celu izolację i perfuzję serca myszy zostały opisane wcześniej24,25.
Metodologie używane do pozyskiwania danych związanych z szybkością enzymatyki w bijącym sercu (przy użyciu spektroskopii 13C i hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu) oraz żywotności i kwasowości serca (przy użyciu spektroskopii 31P NMR) są również opisane. Na koniec wyjaśniono metodologie analityczne służące do określania aktywności enzymów metabolicznych oraz żywotności i kwasowości tkanek.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP Polariser</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3,35 T, spektrometr NMR z hiperpolaryzatorem DNP do rozpuszczania przedklinicznego</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Kostka <td>RS2D</td><td></td><td>NMR, 5,8 T, wyposażona w sondę szerokopasmową 10 mm</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Sonda temperatury</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+NMR</td> <td>kompatybilna z NMR</td></tr><tr><td>System znieczulenia o niskim przepływie Somnosuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lines, rurki, szwy</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>platynowe rurki silikonowe utwardzane platyną</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 ID 3,1 mm& nbsp;</td></tr><tr><td>Cienkie linie polieteroeteroketonowe (PEEK)</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0,040 "</td></tr><tr><td>Cewnik dożylny&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Szew jedwabny</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Średnica drutu 3-0</td></tr><tr><td>Chemikalia i farmaceutyki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]kwas pirogronowy</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insulina aspart (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Grupa</td><td></td> Gadot <td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>Sód wodorotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (klasa biotechnologiczna)</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Rodnik trytylowy OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>NMR standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C</td> próbka standardowa <td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40% p-dioksan w standardowej próbce benzenu-D6</td></tr><tr><td>31P</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td></td><td>105 mM ATP i 120 mM kwasu fenylofosfonowego w D2O</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Badania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13c] pirogronianu i spektroskopii 13c/31p nmr

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Metabolizm jest podstawą ważnych procesów w życiu komórkowym. Scharakteryzowanie funkcjonowania sieci metabolicznych w żywych tkankach dostarcza kluczowych informacji dla zrozumienia mechanizmu chorób i projektowania metod leczenia. W tej pracy opisujemy procedury i metodologie badania aktywności metabolicznej w komórkach w wstecznie perfundowanym sercu myszy w czasie rzeczywistym. Serce izolowano in situ, w połączeniu z zatrzymaniem akcji serca w celu zminimalizowania niedokrwienia mięśnia sercowego i perfuzjono je w spektrometrze magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Podczas gdy w spektrometrze i pod ciągłą perfuzją, hiperspolaryzowany [1-13C] pirogronian był podawany do serca, a późniejsze tempo produkcji hiperspolaryzowanego [1-13C] mleczanu i [13C] wodorowęglanu służyło do określenia, w czasie rzeczywistym, szybkości produkcji dehydrogenazy mleczanowej i pirogronianu. Tę aktywność metaboliczną hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu określono ilościowo za pomocą spektroskopii NMR w modelu swobodnym przy użyciu podejścia do selektywnego pozyskiwania wzbudzeń nasyconych produktem. Rozdział 31Spektroskopię P zastosowano pomiędzy hiperpolaryzowanymi akwizycjami w celu monitorowania energetyki serca i pH. System ten jest wyjątkowo przydatny do badania aktywności metabolicznej w zdrowym i chorym sercu myszy.

Widma 31P zarejestrowane z serca myszy perfundowanego KHB oraz z samego buforu przedstawiono na Rysunku 1A. W sercu zaobserwowano sygnały α-, β- i γ-ATP, PCr oraz Pi. Sygnał Pi składał się z dwóch głównych komponentów: w wyższym polu (lewa strona sygnału) sygnał Pi wynikał głównie z obecności KHB o pH 7,4; w niższym polu (prawa strona sygnału) sygnał Pi był szerszy i mniej jednorodny ze względu na bardziej kwasowe środowisko. Ten drugi wzorzec pochodzi z tkanki serca. Sygnał Pi tk...

Opisujemy eksperymentalny układ do podawania hiperspolaryzowanych metabolitów znakowanych 13znakowanymi C w trybie ciągłej perfuzji do izolowanego perfundowanego serca myszy. Dedykowane podejście do akwizycji 13C-NMR umożliwiło ilościowe określenie aktywności enzymów metabolicznych w czasie rzeczywistym, a wieloparametryczna analiza 31P-NMR umożliwiła określenie zawartości ATP i pH w tkankach.

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In tym filmie dowiesz się, jak przeprowadzić hiperpolaryzowane badania MR perfundowanego serca myszy. David Shaul, doktorant medycyny / doktorant w laboratorium, poprowadzi Cię przez różne techniki i procedury. Dzisiaj poznajemy protokół badania hiperspolaryzowanego metabolizmu pirogronianu węgla-13 w połączeniu ze spektroskopią 31P NMR.Metabolizm pirogronianu znajduje się na skrzyżowaniu metabolizmu tlenowego i beztlenowego. I jako taki ma wielką wartość w badaniu różnych schorzeń serca. Więc zacznijmy.Serce myszy jest izolowane i perfundowane buforem Krebsa-Hensleita, wewnątrz 10-milimetrowej rurki NMR. Serce jest następnie wprowadzane do spektrometru NMR. Tam rejestrowane jest widmo 31P w celu obserwacji energetyki serca i pH, obserwując rezonanse adenozynotrifosforanu, fosfokreatyny i fosforanu nieorganicznego.Tymczasem próbka pirogronianu, która jest oznaczona węglem-13 na pierwszej pozycji, jest hiperspolaryzowana. A po rozpuszczeniu jest wstrzykiwany do serca, aby umożliwić pomiar mleczanu, substancji nieorganicznych i pirogronianu zorganizowanych działań w czasie rzeczywistym. Dzień przed eksperymentem przygotuj 400 mililitrów zmodyfikowanego buforu Krebsa-Henseleita.W p

investigating-cardiac-metabolism-isolated-perfused-mouse-heart-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Perfuzja izolowanego serca w trybie Langendorffa, w połączeniu ze spektroskopią NMR 31P, łączy dziedziny biochemii i fizjologii w jednym eksperymencie. Protokół ten umożliwia dynamiczny pomiar zawartości i obrotu fosforanów wysokoenergetycznych w sercu przy jednoczesnym monitorowaniu funkcji fizjologicznych. Prawidłowo wykonana, technika ta stanowi cenne narzędzie w ocenie energetyki serca.

Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy z wykorzystaniem spektroskopii 31P NMR

Wielokompartmentowy dynamiczny fantom jest używany do symulacji niektórych interesujących biologicznych badań metabolicznych przy użyciu hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego.

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Prezentujemy protokół do pomiaru zależności pola magnetycznego od czasu relaksacji spinowo-sieciowej 13związków wzbogaconych w C, hiperpolaryzowanych za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej, przy użyciu szybkiej relaksometrii z cyklem pola. W szczególności wykazaliśmy to za pomocą pirogronianu [1-13C], ale protokół można rozszerzyć na inne hiperspolaryzowane substraty.

Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Poniższy protokół opisuje proces izolacji, wentylacji i instrumentacji płuc myszy w celu pomiaru stacjonarnych lub pulsacyjnych zależności między ciśnieniem a przepływem w naczyniach płucnych, aby określić wpływ przepływu krwi, przepływu powietrza, zmian w drogach oddechowych i zmian naczyniowych na obciążenie następcze prawej komory.

Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i opomiarowanego płuca mysiego poddanego perfuzji przepływem pulsacyjnym

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Naucz się oceny metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR. Ta metoda umożliwia badanie aktywności metabolicznej i energetyki serca w czasie rzeczywistym.

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej 1-13C pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR (Wideo) | JoVE Journal

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [^1-13C] pirogronianu i spektroskopii ¹³C/³¹P NMR

Przeglądaj więcej filmów