Name: Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę hodowli aksonowych chrząszczy liściowych z jaj poddanych sterylizacji powierzchniowej przy użyciu liści z hodowli tkankowej topoli. Ta technika umożliwia badanie interakcji mikrobioty jelitowej bez sztucznych diet.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31971663) oraz Program Sponsorski Młodych Elitarnych Naukowców przez CAST (2020QNRC001).

1. Hodowla owadów
<ol>
	<li>Utrzymać populację P. versicolora w komorze wzrostowej w temperaturze 27 °C i wilgotności względnej 70 ± 5% przy fotoperiodzie 16 h światła/8 h ciemności. Umieść je w perforowanych plastikowych pudełkach z kafelkowym mokrym papierem pochłaniającym wilgoć i nakarm je świeżymi gałązkami topoli. Spryskaj czystą wodą papier absorpcyjny, aby utrzymać wilgoć i zmieniaj gałęzie co dwa dni.</li>
	<li>Odizolować dorosłe osobniki do składania jaj po przepoczwarzeniu. Nakarm je delikatnymi liśćmi, aby uzyskać więcej jaj.</li>
	<li>Zbierz nowo złożone jaja (w ciągu 24 godzin). Umieść jaja na wilgotnym bibułie chłonnym na 60 godzin, aby przygotować larwy akseniczne. 
	UWAGA: Nowo złożone jaja wykluwają się po ~72 godzinach. Najlepszą porą na sterylizację powierzchni jaj jest dzień przed wykluciem; W przeciwnym razie liczba pomyślnie wyklutych jaj zmniejszy się.</li>
</ol>
2. Hodowla topoli wolnej od zarazków
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę Murashige i Skoog (MS) oraz roztwory podstawowe o stężeniu 1 mg/ml kwasu α-naftalenooctowego (NAA) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego dodać 50 μl 1 mg/ml roztworu podstawowego NAA do 500 ml pożywki MS, wstrząsnąć do dobrego wymieszania i wlać ~50 ml na pojemnik do hodowli tkankowej i poczekać na zestalenie.</li>
	<li>Przygotuj skalpele, lampę nasączoną alkoholem i kleszcze; wysterylizuj skalpele i kleszcze w płomieniu lampy alkoholowej w okapie bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Wytnij 3-4 cm segmenty łodygi z pąkami wierzchołkowymi lub pąkami bocznymi z siewek topoli po ~1 miesiącu wzrostu (siewki z hodowlą tkankową wolne od zarazków) i włóż je do pożywki hodowlanej, jeden lub dwa segmenty łodygi na pojemnik.</li>
	<li>Inkubować te segmenty łodygi w komorze wzrostowej w temperaturze 25 °C i natężeniu światła 50 ± 10 cd z fotoperiodem 16 godzin światła/8 godzin ciemności przez około 30 dni. Użyj liści wolnych od zarazków, aby nakarmić larwy akseniczne.</li>
</ol>
3. Sterylizacja powierzchni jaj i hodowla larw aksenicznych
<ol>
	<li>Szalki Petriego w autoklawie, pędzle, bibuła filtracyjna, woda destylowana i szalka Petriego zawierająca podłoże agarowe LB (Luria-Bertani).</li>
	<li>Umieść liście z przylegającymi jajami na szalce Petriego, ostrożnie usuń jaja z liści za pomocą kleszczy i przenieś je na inną szalkę Petriego. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo ostrożnie, ponieważ jaja przylegają do liści.</li>
	<li>Myj te jajka 75% etanolem przez 8 minut i powtórz mycie cztery razy sterylną wodą.</li>
	<li>Przenieś jaja na podłoże agarowe LB, aby zachować wilgoć do wylęgu. 
	UWAGA: Użycie podłoża agarowego LB może pomóc w sprawdzeniu, czy zdezynfekowane jajo jest wolne od zarazków.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego w komorze wzrostowej i poczekaj, aż jaja wyklują się w ciągu 24 godzin.</li>
	<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego ułóż trzy kawałki mokrej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego, umieść na bilecie liście topoli wolne od zarazków, zbierz larwy i umieść je na liściach, uszczelnij szalkę Petriego parafilmem i inkubuj je w komorze wzrostu w temperaturze 27 °C i wilgotności względnej 70 ± 5% przy fotoperiodzie 16 godzin światła/8 godzin ciemności. 
	UWAGA: Liście z kulturą tkankową są delikatne i mogą szybko tracić wodę. Dlatego przy przenoszeniu liści na szalkę Petriego konieczne jest użycie wilgotnej bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Zmieniaj liście co dwa dni.</li>
	<li>W przypadku grup hodowanych konwencjonalnie należy przenieść jaja z liści na szalkę Petriego zawierającą wilgotną bibułę filtracyjną i nakarmić te larwy liśćmi topoli wolnymi od zarazków.</li>
</ol>
4. Weryfikacja larw aksenu za pomocą testów zależnych od hodowli
<ol>
	<li>Losowo wybierz trzy larwy 1., 2. i 3. stadium rozwojowego z grup wolnych od zarazków i hodowanych konwencjonalnie.</li>
	<li>Wypreparuj larwy 3. stadium za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i zbierz ich wnętrzności w probówkach do mikrowirówek. Zbierz nienaruszone larwy1 i 2 instar w probówkach. 
	UWAGA: Zbierz całe larwy 1. i 2. stadium rozwojowe, ponieważ są zbyt małe, aby je wyciąć, i zachowaj ich wnętrzności w stanie nienaruszonym.</li>
	<li>Do probówek o pojemności 1,5 ml dodać 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i trzy stalowe kulki i zmielić tkanki na homogenaty za pomocą homogenizatora do ubijania kulek.</li>
	<li>Dodać 100 μl homogenatu do podłoża agarowego LB i płytki za pomocą sterylnego szklanego pręta do rozprowadzania.</li>
	<li>Umieścić płytki w temperaturze 37 °C na 24 godziny i obserwować kolonie bakteryjne.</li>
</ol>
5. Weryfikacja osobników aksenicznych za pomocą testów niezależnych od kultury
<ol>
	<li>Ekstrahować całkowite DNA tkanek (uzyskane w sekcji 4) za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm.</li>
	<li>Amplifikuj bakteryjny gen 16S rRNA za pomocą uniwersalnych starterów 16S rRNA z PCR. Skonfiguruj system reakcyjny z 18 μl 1,1x PCR master mix (patrz tabela materiałów), 0,5 μl startera 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μl startera 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') i 100 ng matrycy DNA. Ustawić warunki PCR na 95 °C na 3 min; 28 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę; następnie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszej analizy.</li>
	<li>Wymieszaj produkty PCR z barwnikiem kwasu nukleinowego i przeanalizuj je za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym w buforze 1x TAE. Użyj 10 μl markera DNA jako odniesienia.</li>
	<li>Obserwuj żel za pomocą transiluminatora UV i szukaj docelowego fragmentu około 1,500 pz.</li>
</ol>

<ol><li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li>
<li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li>
<li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).</li>
<li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li>
<li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li>
<li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li>
<li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851(2000).</li>
<li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98(2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li>
<li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li>
<li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+%27Trojan+Horse%27+for+paratransgenesis+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li>
<li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li>
<li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).</li>
<li>Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+rearing+the+Colorado+potato+beetle%2C+Leptinotarsa+decemlineata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Science. 1, 7(2001).</li>
<li>Bengtson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+program+for+the+evaluation+of+artificial+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Aquaculture+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive program for the evaluation of artificial diets.</a> Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle%3A+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li>
<li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li>
<li>Bright, M., Bulgheresi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+journey%3A+transmission+of+microbial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A complex journey: transmission of microbial symbionts.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).</li>
<li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+bacterial+mutualists+evolving+from+environmental+bacteria+in+natural+insect+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations.</a> Nature Microbiology. 1, 15011(2016).</li>
<li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil%2C+Rhynchophorus+ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+by+modulating+its+nutritional+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).</li>
<li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poplar+%28Populus+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).</li>
<li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-endophyte+symbiosis%2C+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li>
<li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristem-tip+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przygotowanie larw wolnych od zarazków i uzyskanie larw gnotobiotycznych poprzez ponowne wprowadzenie określonych szczepów bakteryjnych to potężne metody wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw interakcji gospodarz-mikroorganizm. Nowo wyklute larwy uzyskują mikrobiotę jelitową na dwa główne sposoby: pionową transmisję z matki na potomstwo lub poziome nabycie od rodzeństwa i środowiska34. Pierwsza z tych cech może być spełniona przez przeniesienie rodzicielskie na potomstwo poprzez zanieczyszcze...

Podobnie jak u ssaków, przewód pokarmowy owadów jest jamą do trawienia i wchłaniania pokarmu. Większość owadów jest siedliskiem różnych bakterii komensalnych, które rozwijają się w ich jelitach i żyją dzięki pożywieniu dostarczanemu przez hosts1. Społeczność komensalna jelit ma głęboki wpływ na wiele procesów fizjologicznych u owadów, w tym trawienie pokarmu i detoksykację2,3,4, odżywianie i rozwój5,6,7, ochrona przed patogenami i pasożytami8,9, 10,11, komunikacja chemiczna12,13 and behaviors14,15. Co ciekawe, niektóre mikrobioty jelitowe mogą być fakultatywnie patogenne lub być manipulowane przez atakujące patogeny w celu zaostrzenia infekcji, co wskazuje, że bakterie jelitowe mogą być szkodliwe w niektórych przypadkach16,17,18. Bakterie jelitowe mogą również służyć jako zasób mikrobiologiczny do zastosowań biotechnicznych i zwalczania szkodników. Na przykład, bakterie trawiące lignocelulozę z owadów fitofagowych i ksylofagowych zostały wykorzystane do trawienia komórek roślinnych w celu opracowania biopaliw19. Dyspersja zmodyfikowanych symbiontów jelitowych wykazujących ekspresję bioaktywnych cząsteczek jest nowatorską i obiecującą taktyką zwalczania szkodników i komarów przenoszących choroby zakaźne w rolnictwie i leśnictwie 19,20,21, który może być również wykorzystany do poprawy sprawności pożytecznych owadów22. Zilustrowanie, jak bakteria jelitowa zachowuje się in vivo, jest zatem uważane za priorytet, aby w pełni wykorzystać jej funkcję i dalej wykorzystywać ją do różnych zastosowań.
Zwierzęta mogą być siedliskiem od 1 do >1000 symbiotycznych gatunków mikroorganizmów w klasie gut<sup="xref">1. W związku z tym trudno jest dokładnie zweryfikować, jak poszczególne taksony bakteryjne lub ich składanie zachowują się wewnątrz zwierzęcia oraz czy gospodarz lub jego partnerzy mikrobiologiczni kierują określoną funkcją. Dlatego przygotowanie larw aksenu do uzyskania owadów gnotobiotycznych poprzez kolonizację jedno- lub wielogatunkową jest konieczne do zbadania funkcji bakterii i interakcji z owadami23. Obecnie podawanie koktajli antybiotykowych i sterylizacja powierzchni jaj owadów są powszechnymi metodami usuwania bakterii jelitowych14,24,25,26. Jednak diety antybiotykowe nie mogą całkowicie wyeliminować bakterii jelitowych i mają negatywny wpływ na fizjologię owadów gospodarza27,28. W związku z tym stosowanie owadów leczonych antybiotykami może przesłonić prawdziwe zdolności niektórych bakterii jelitowych. Na szczęście powierzchniowa sterylizacja jaj może zniwelować ten problem23,29, który nie ma żadnego lub znikomy wpływ na eksperymentalne owady. Co więcej, sztuczne diety nie mogą w pełni przypominać naturalnego pokarmu dla owadów, a opracowanie sztucznej diety jest kosztownym i pracochłonnym procesem30,31.
Chrząszcz wierzbowy, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), jest szeroko rozpowszechnionym szkodnikiem zjadającym liście, który żywi się głównie drzewami salikatowymi, takimi jak wierzby (Salix) i topola (Populus L.)32,33. Tutaj chrząszcz wierzbowolistny został wykorzystany jako reprezentatywny owad zjadający liście w celu opracowania protokołu przygotowania i hodowli owada wolnego od zarazków. Wykorzystaliśmy kulturę tkankową roślin, aby uzyskać wolne od zarazków liście topoli do hodowli larw aksenu P. versicolora ze sterylizowanych jaj. Status aksoniczny larw P. versicolora zweryfikowano za pomocą testów zależnych od kultury i niezależnych od hodowli. Protokół ten może utrzymać owady akseniczne, które lepiej naśladują dzikie warunki niż hodowla owadów za pomocą sztucznej diety. Co ważniejsze, metoda ta jest wygodna przy bardzo niskich kosztach, co zwiększa możliwość uzyskania owadów aksenicznych do przyszłych badań interakcji mikrobioty owado-jelitowej, zwłaszcza w przypadku owadów niemodelowych bez dobrze opracowanych sztucznych diet.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtry strzykawkowe</td><td>Milipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mg/ml roztworu</td><td></td><td></td> podstawowego NAA <td>a. Przygotować 0,1 M roztwór NaOH (rozpuścić 0,8 g NaOH w 200 ml wody destylowanej). b. Dodać 0,2 g NAA do zlewki o pojemności 250 ml, dodać trochę 0,1 M roztworu NaOH do momentu rozpuszczenia NAA i dostosować końcową objętość do 200 ml wodą destylowaną. c. Przefiltruj roztwór, aby usunąć bakterie za pomocą 0,22 &mikro; m filtra strzykawkowego i sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml, zapakować roztwór do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przywrócić w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10x roztwór podstawowy PBS</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>2 M roztwór</td><td></td><td></td> KOH <td>Rozpuść 22,44 g KOH (masa cząsteczkowa: 56,1) w 200 ml wody destylowanej i sterylizuj w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.</td></tr><tr><td>Zlewki 250 ml i 2 000 ml</td><td>Shubo</td><td>sb16455</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne strzykawki</td><td>Jinta</td><td>JT0125789</td><td></td></tr><tr><td>500 ml cylinder miarowy</td><td>Shubo</td><td>sb1601</td><td></td></tr><tr><td>50x roztwór podstawowy</td><td></td><td></td> TAE <td>a.&nbsp; Rozpuścić 242 g Tris i 18,612 g EDTA w 700 ml wody destylowanej. b. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą około 57,1 ml kwasu octowego. c. Dostosuj końcową objętość do 1,000 ml. d. Roztwór podstawowy rozcieńczono do 1x buforu TAE w przypadku użycia.</td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Xingheda trade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&kwas alfa;-naftalenooctowy (NAA)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>86-87-3</td><td></td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td> absorpcyjny <td>22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Coolaber</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator do ubijania koralików</td><td>Jing Xin</td><td>XM-GTL64</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA</td><td>MP Biomedicals</td><td>116560200</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Saiguo Biotech</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Jiaojie</td><td></td><td>o średnicy 70 mm</td></tr><tr><td>Jednostka</td> <td>do elektroforezy żelowejBio-rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Signal Green barwnik kwasu nukleinowego</td><td>TsingKe</td><td>TSJ003</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od zarazków siewki</td><td></td><td></td><td>topoli Shan Xin z Uniwersytetu Ludong w prowincji Shandong</td></tr> Golden <tr><td>Star Super PCR Master Mix (1,1 razy;)</td><td>TsingKe</td><td>TSE101</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Pożywka</td><td></td> agarowa Ruihua HP400GS-C <td></td></tr><tr><td>LB</td><td>a. Rozpuść 5 g tryptonu, 5 g NaCl, 2,5 g ekstraktu drożdżowego w 300 ml wody destylowanej. b. Dostosuj końcową objętość do 500 ml, przenieś roztwór do kolby stożkowej o pojemności 1,000 ml i dodaj 7,5 g agaru. c. Autoklawuj pożywkę przez 20 minut w temperaturze 121 stopni C.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>DRAGONLAB</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>MS podłoże podstawowe</td><td>Coolaber</td><td>PM1121-50L</td><td>M0245</td></tr><tr><td>MS stałe podłoże do hodowli</td><td></td><td></td> sadzonek topoli wolnej od zarazków <td>a. Rozpuść 4,43 g MS podłoża zasadowego w proszku i 30 g sacharozy w 800 ml wody destylowanej. b. Dostosuj pH do około 5,8 za pomocą 2 M KOH za pomocą pH-metru. c. Dostosuj końcową objętość do 1,000 ml, rozdzielić na dwie części, przenieść do dwóch kolb stożkowych o pojemności 1000 ml i dodać 2,6 g agaru na 500 ml. d. Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 stopni C.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td> o <td>szerokości 1 cm, służy do zbierania jaj</td></tr> Termocyklery <tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td>6331000076</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Supin</td><td></td><td>pH-metr o średnicy 90 mm</td></tr><tr><td></td><td>METTLER TOLEDO</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 0,2-2 i mikro; L</td><td>Pipety Gilson</td><td>ECS000699</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 20-200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 2-20 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do hodowli tkanek roślinnych</td><td>Chembase</td><td>ZP21</td><td>240 ml</td></tr><tr><td>Plastikowe pudełko</td><td></td><td></td><td>2,35 l</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery do amplifikacji bakteryjnego genu 16S rRNA</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td>27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulki</td><td></td> stalowe <td>0,25 mm</td><td>używane do mielenia tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans2K plus II DNA </td><td>marker Transgene Biotech</td><td>BM121-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz UV</td><td>Monad Biotech</td><td>QuickGel 6100</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scilogex</td><td>MX-S Gałęzie</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>wierzby</td><td>Sha Lake Park, Wuhan, Chiny</td></tr><tr><td>Chrząszcz</td><td></td><td></td> wierzbowy <td>Uniwersytet Rolniczy Huazhong, Wuhan, Chiny</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Wnętrzności owadów są kolonizowane przez różne bakterie, które mogą mieć ogromny wpływ na cechy fizjologiczne gospodarza. Wprowadzenie określonego szczepu bakteryjnego do owada aksenicznego jest potężną metodą weryfikacji funkcji drobnoustrojów jelitowych i wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw interakcji między drobnoustrojami jelitowymi a gospodarzem. Podawanie antybiotyków lub sterylizacja powierzchni jaj to dwie powszechnie stosowane metody usuwania bakterii jelitowych z owadów. Jednak oprócz potencjalnego niekorzystnego wpływu antybiotyków na owady, wcześniejsze badania wykazały, że podawanie antybiotyków nie może wyeliminować bakterii jelitowych. W związku z tym sztuczne diety wolne od zarazków są zwykle stosowane do utrzymania owadów aksenicznych, co jest żmudnym i pracochłonnym procesem, który nie może w pełni przypominać składników odżywczych w naturalnej żywności. Opisany tutaj jest skuteczny i prosty protokół przygotowania i utrzymania larw aksenicznych chrząszcza liściowego (Plagiodera versicolora). W szczególności powierzchnie jaj chrząszczy zostały wysterylizowane, po czym do wyhodowania larw aksenu wykorzystano wolne od zarazków liście topoli. Status aksoniczny owadów został następnie potwierdzony za pomocą testów zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Reasumując, łącząc dezynfekcję jaj i uprawę wolną od zarazków, opracowano skuteczną i wygodną metodę pozyskiwania aksenu P. versicolora, która stanowi łatwe do przeniesienia narzędzie dla innych owadów żywiących się liśćmi.

Etapy życia P. versicolora przedstawiono na Rysunku 1. Samiec dorosły jest mniejszy od samicy dorosłej (Rysunek 1A). W warunkach terenowych chrząszcz składa jaja w skupiskach na liściu; tutaj przedstawiono cztery jaja oddzielone od liścia (Rysunek 1B). Fragmenty łodyg i siewki topoli wykorzystywane do aksenicznej hodowli owadów przedstawiono na Rysunku 2). Przewód pokarmowy larwy w 3rd</su...

Aby uzyskać aksenicznego owada, jego powierzchnia jaja jest sterylizowana, a wykluta larwa jest następnie hodowana za pomocą aksonicznych liści. Metoda ta zapewnia skuteczny sposób przygotowania owadów aksenowych bez podawania antybiotyków lub opracowywania sztucznej diety, którą można również zastosować do innych owadów żywiących się liśćmi.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Bakterie jelitowe mogą wpływać na wiele procesów fizjologicznych gospodarzy owadów. Przygotowanie i utrzymanie larw aksenicznych jest potężnym narzędziem do badania funkcji bakterii jelitowych. Głównymi zaletami tego protokołu jest to, że kultura tkankowa roślin jest wykorzystywana do uzyskiwania liści wolnych od zarazków w celu wyhodowania aksenicznych owadów żywiących się liśćmi pochodzących z jaj sterylizowanych powierzchniowo oraz że metoda ta nie jest ograniczona sztucznymi dietami.Metoda ta jest wygodna i zwiększa widoczność utrzymania owadów aksenicznych dla przyszłych badań nad bakteriami jelitowymi, zwłaszcza w przypadku owadów niemodelowych bez dobrze opracowanej sztucznej diety. Utrzymuj populację P.versicolora w komorze wzrostowej w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 70%, z 16-godzinnym światłem i ośmiogodzinnym ciemnym fotoperiodem. Umieść owady w perforowanych plastikowych pudełkach z pochylonym mokrym papierem absorpcyjnym i nakarm je świeżymi gałęziami topoli.Spryskaj czystą wodą papier absorpcyjny, aby utrzymać wilgoć, i zmieniaj gałęzie co dwa dni. Odizoluj dorosłe osobniki do złożenia jaj po przepoczwarzeniu i nakarm je delikatnymi liśćmi, aby uzyskać więcej jaj. W ciągu 24 godzin zbierz nowo złożone jaja i umieść je na wilgotnym papierze absorpcyjnym na 60 godzin, aby przygotować larwy akseniczne.Przygotować pożywkę MS w jednym miligramie na mililitr kwasu alfa-naftalenooctowego lub roztworów podstawowych NAA. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 50 mikrolitrów roztworu podstawowego NAA do 500 mililitrów pożywki MS i wstrząśnij, aby dobrze wymieszać. Następnie wlej około 50 mililitrów do pojemnika na kulturę tkankową i poczekaj na zestalenie.Wysterylizuj skalpele i kleszcze w płomieniu lampy alkoholowej w okapie bezpieczeństwa biologicznego. Wytnij trzy- do czterech centymetrowych segmentów łodygi z pąkami wierzchołkowymi lub pąkami bocznymi z siewek topoli po około jednym miesiącu wzrostu i włóż je do pożywki hodowlanej, po jednym lub dwóch segmentach łodygi na pojemnik. Inkubuj te segmenty łodygi w komorze wzrostowej przez około 30 dni.I użyj tych wolnych od zarazków liści, aby nakarmić larwy akseniczne. Szalki Petriego w autoklawie, pędzle, bibuła filtracyjna, woda destylowana na szalce Petriego zawierającej podłoże agarowe LB. Umieść liście z przylegającymi jajami na szalce Petriego.Następnie ostrożnie usuń jaja z liści za pomocą kleszczy i przenieś je na inną szalkę Petriego. Myj te jajka 75% etanolem przez osiem minut. Następnie powtórz pranie cztery razy sterylną wodą.Przenieś jaja na podłoże agarowe LB, aby zachować wilgoć do wylęgu. Umieść szalkę Petriego w komorze wzrostowej i poczekaj, aż jaja wyklują się w ciągu 24 godzin. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego ułóż trzy kawałki mokrej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i umieść na niej wolne od zarazków liście topoli.Zbierz larwy i umieść je na liściach. Uszczelnij szalkę Petriego parafilmem i inkubuj ją w komorze wzrostowej. Zmieniaj liście co dwa dni.W przypadku grup hodowanych konwencjonalnie należy przenieść jaja z liści na szalkę Petriego zawierającą wilgotną bibułę filtracyjną i nakarmić te larwy liśćmi topoli wolnymi od zarazków. Losowo wybierz trzy larwy pierwszego, drugiego i trzeciego stadium rozwojowego z grup wolnych od zarazków i hodowanych konwencjonalnie. Wypreparuj larwy trzeciego stadium za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i zbierz ich wnętrzności w probówkach do mikrowirówek.Zbierz nienaruszone larwy pierwszego i drugiego stadium rozwojowego w probówkach. Dodaj 100 mikrolitrów PBS i trzy stalowe kulki do 1,5-mililitrowych probówek i zmiel tkanki na homogenaty za pomocą homogenizatora do ubijania kulek. Dodać 100 mikrolitrów homogenatu do podłoża agarowego LB i płytki za pomocą sterylnego szklanego pręta do rozprowadzania.Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie obserwuj kolonie bakterii. Ekstrahować całkowite DNA z wcześniej uzyskanych tkanek za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.Amplifikować bakteryjny gen 16S rRNA za pomocą uniwersalnych starterów 16S rRNA z PCR, ustawiając reakcję zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Wymieszaj produkty PCR z barwnikiem kwasu nukleinowego i przeanalizuj je za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym w buforze 1X TAE.Użyj 10 mikrolitrów markera DNA jako odniesienia. Obserwuj żel za pomocą transiluminatora UV i poszukaj fragmentu docelowego około 1 500 par zasad. Chociaż nie zaobserwowano żadnych kolonii bakteryjnych w żadnej grupie wolnej od zarazków, zaobserwowano je we wszystkich grupach hodowanych konwencjonalnie, co wskazuje, że larwy z wysterylizowanych jaj, które były karmione liśćmi topoli z kulturą tkankową, nie zawierały bakterii.Prążki PCR 1 500 par zasad pojawiły się we wszystkich grupach hodowanych konwencjonalnie. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnego prążka w grupach wolnych od zarazków lub w kontroli negatywnej, co sugeruje, że w larwach aksenu nie istniały żadne bakterie jelitowe. W przypadku gatunków owadów z maleńkimi jajami konieczne było zoptymalizowanie rodzajów środków dezynfekujących i czasu sterylizacji.Ponadto godne uwagi powinny być endofity w roślinach hodowanych tkankowo. Protokół ten zapewnia nową metodę utrzymywania owadów wolnych od zarazków, która jest przydatnym narzędziem ułatwiającym badania interakcji między owadami a bakteriami jelitowymi, szczególnie w przypadku owadów niemodelowych bez dobrze rozwiniętej sztucznej diety.

preparing-rearing-axenic-insects-with-tissue-cultured-seedlings-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji Mycobacterium bovis u larw woskowej większej, Galleria mellonella. Bioluminescencyjny szczep Mycobacterium bovis BCG jest wstrzykiwany do hemolimfy larwy w celu wywołania infekcji, a bioluminescencja jest mierzona w określonych odstępach czasu w celu zbadania postępu infekcji.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Mszyca Aphis nerii kolonizuje dobrze chronione rośliny z rodziny psowatych (Apocyanaceae) i dostarcza licznych możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. W tym miejscu przedstawiamy szereg protokołów dotyczących utrzymania kultur roślin i mszyc oraz generowania i analizy danych molekularnych i -omicznych dla A. nerii.

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

Ten artykuł przedstawia podstawowe metody standaryzacji ważnych czynników, takich jak gęstość, dostępność paszy, źródło nawodnienia i kontrola środowiska dla długoterminowej hodowli laboratoryjnych jadalnego świerszcza, Gryllus bimaculatus.

Utrzymanie laboratoryjnych kultur Gryllus bimaculatus, wszechstronnego modelu prostoskrzydłego do hodowli owadów i fizjologii bezkręgowców

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Tutaj prezentujemy metodę badania hibernacji stonki ziemniaczanej w naturalnych warunkach strefy umiarkowanej, a także technikę zbierania chrząszczy zimą. Metoda ta pozwala na uzyskanie pożądanej liczby osobników zimujących do różnych analiz na każdym etapie hibernacji.

Eksperymentalne badanie stonki ziemniaczanej hibernacji w warunkach naturalnych

Opisana jest prosta procedura hodowli aksenicznej Delia antiqua z na wpół fermentowaną, sterylną dietą. Tylko jeden szczep Wolbachia został wykryty w każdym stadium rozwojowym aksenu D. antiqua za pomocą PCR.

Hodowla Axenic Delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą

Poznaj metodę hodowli aksonowych chrząszczy liściowych z jaj poddanych sterylizacji powierzchniowej przy użyciu liści z hodowli tkankowej topoli. Ta technika umożliwia badanie interakcji mikrobioty jelitowej bez sztucznych diet.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Przeglądaj więcej filmów