Name: Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania metylacji argininy za pomocą spektroskopii NMR w próbkach biologicznych. Protokół umożliwia analizę komórek, tkanek i płynów ustrojowych z zastosowaniem w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez granty Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (Flagowy projekt DYNIMO), Austriacką Agencję Promocji Badań (FFG) granty 864690 oraz 870454, Integrative Metabolism Research Center Graz; Austriacki Program Infrastrukturalny 2016/2017, rząd Styrii (Zukunftsfonds) i Startup Fund for High-Level Talents Uniwersytetu Medycznego Fujian (XRCZX2021020). Dziękujemy Centrum Badań Medycznych za dostęp do urządzeń do hodowli komórkowych. F.Z. kształcił się w ramach studiów doktoranckich z medycyny molekularnej na Uniwersytecie Medycznym w Grazu. Q.Z. szkolił się w ramach studiów doktoranckich z zakresu chorób metabolicznych i sercowo-naczyniowych na Uniwersytecie Medycznym w Grazu.

Hydrolizaty białka drożdżowego zostały użyte jako próbki do reprezentatywnych wyników tej pracy. Cały protokół jest podsumowany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie materiałów i odczynników
<ol>
	<li>Metanol/woda: przygotować mieszaninę dwóch części 99% metanolu (MeOH) i jednej częściH2O, oznaczoną jako MeOH/H2O. Przechowywać czyste MeOH i MeOH/H2O w temperaturze -20 °C, aby zminimalizować parowanie alkoholu i zwiększyć stabilność próbki.</li>
	<li>Kwas solny (HCl): rozcieńczyć 9 mol/l ze stężonego HCl (12,0 mol/l lub 37%) oraz 0,1 mol/l HCl. Roztwór o wyższym stężeniu (9 mol/l) służy do hydrolizy białek, natomiast roztwór o niższym stężeniu (0,1 mol/l) służy do ekstrakcji do fazy stałej. 
	UWAGA: Pracuj wewnątrz dygestorium.</li>
	<li>Przygotuj roztwór zastępczy dla SPE zawierający 10% nasyconego roztworu amoniaku (zapas: 30% w/w amoniaku), 50% metanolu i 40% wody (v/v).</li>
	<li>Bufor NMR: Rozpuścić 5,56 g wodorofosforanu disodowego (Na2HPO4, 0,08 mol/L), 0,4 g soli sodowej kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (w/v) azydku sodu (NaN3) w 500 ml dwutlenku deuteru (D2O) i dostosować do pH 7,4 (przy użyciu HCl lub NaOH, odpowiednio) (patrz tabela materiałów). Sprawdź czystość każdej nowej partii buforowej za pomocą spektroskopii NMR. 
	UWAGA: Ilość wszelkich zanieczyszczeń (np. etanolu) powinna być jak najmniejsza.</li>
	<li>Napełnij probówki do roztwarzania kulkami z tlenku cyrkonu (probówki 2 ml i kulki 1,4 mm są odpowiednie do większości zastosowań, ale dostępne są różne warianty) (patrz Tabela materiałów). Napełnij około 10-20 koralików ręcznie lub kup wstępnie napełnione tubki, które są również dostępne.</li>
	<li>Pipety i odpowiednie końcówki należy przechowywać w pogotowiu w zakresie 10-1 000 μl. 
	UWAGA: W trakcie prac zastosowano wodę o wysokiej czystości, oznaczoną jakoH2O, charakteryzującą się wysoką rezystancją ≥18,2 MΩ·cm-1. Odpowiada wodzie podwójnie destylowanej.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Próbki ciekłe (surowica/osocze, supernatant do hodowli komórkowych itp.) należy błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotuj materiały stałe, jak wspomniano poniżej.
	<ol>
		<li>Zebrać komórki z kultur komórkowych (3-5 milionów komórek) albo poprzez zebranie przylegających komórek, po umyciu zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, zeskrobaniu i odwirowaniu, albo bezpośrednie odwirowanie komórek wyhodowanych w zawiesinie.</li>
		<li>Usunąć supernatanty komórkowe (które mogą być zebrane do dalszej analizy, albo przez kolejne bezpośrednie pomiary, patrz krok 6, albo po wytrąceniu rozpuszczalnych białek, patrz krok 3.1), a następnie błyskawicznie zamrozić granulki ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby uzyskać informacje na temat dalszego przetwarzania, zobacz krok 3.2.</li>
		<li>Przechowuj i pobieraj tkanki zgodnie z celem badania. W przypadku bardzo jednorodnych tkanek, takich jak wątroba lub mięsień, przeanalizuj dowolną jej część. Na przykład w przypadku mózgu myszy określ globalną metylację argininy w całym mózgu lub jego sekcjach. 
		UWAGA: Idealna waga tkanek do przetworzenia to 30-60 mg. Wskazane jest zamrożenie i sproszkowanie całego mózgu i użycie jego podwielokrotności. Alternatywnie można użyć określonych części mózgu (np. czołowej, móżdżku, okolic potylicznych lub jednej półkuli o wadze ~250 mg).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstępne przygotowanie próbki
UWAGA: Wykonuj pracę na lodzie, utrzymując MeOH w niskiej temperaturze. Próbki muszą być również przechowywane na lodzie, aby uniknąć degradacji białek.
<ol>
	<li>W przypadku próbek ciekłych dodać 400 μl lodowatego metanolu do 200 μl próbki. Przejdź do kroku 3.3. 
	UWAGA: Jeśli dostępna jest mniejsza próbka, odpowiednio dostosuj głośność; Czułość NMR jest zwykle wystarczająco wysoka dla mniejszych ilości próbek, ale musi być testowana indywidualnie.</li>
	<li>W przypadku materiałów stałych należy przygotować wystarczającą ilość 1,5 ml probówek na lizaty (użyć do odwirowania po homogenizacji).
	<ol>
		<li>Ostrożnie, ale dokładnie, ponownie zawiesić granulki komórkowe w 600 μl MeOH/H2O i przenieść całą fazę ciekłą do probówek do roztwarzania.</li>
		<li>Umieść tkanki w probówkach do roztwarzania (możesz je bezpośrednio zważyć do probówek) i dodaj 600 μl MeOH/H2O (dla 30-60 mg; dostosuj, jeśli waga znacznie się różni).</li>
		<li>Umieścić probówki w homogenizatorze tkankowym (patrz Tabela Materiałów) i homogenizować jeden raz przez 20 s z silnym wstrząsaniem (w przypadku granulek komórek, tkanek miękkich) lub dwa razy przez 20 s każdy (lub dłużej, jeśli to konieczne) w odstępie 5 minut pomiędzy nimi (dla sztywnych tkanek).</li>
		<li>Po homogenizacji natychmiast ponownie umieść próbki na lodzie i przenieś całe lizaty do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy przechowywać przez co najmniej 30 minut (do kilku dni) w temperaturze -20 °C przed dalszym przetwarzaniem.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. W międzyczasie przygotuj wystarczającą ilość probówek o pojemności 1,5 ml do zebrania supernatantów. 
	UWAGA: Ten supernatant (oznaczony jako "(1)" w klasie <strong="xfig">Rysunek 1) może zostać odrzucony, poddany liofilizacji i bezpośrednio przetworzony pod kątem NMR (krok 6) lub przeanalizowany w inny sposób.</li>
	<li>W tym protokole osad MeOH (= osad otrzymany odpowiednio po kroku 3.1 lub 3.2.2) jest używany do dalszej analizy zawierającej między innymi składniki takie jak kwasy nukleinowe i lipidy, białka metylowane argininą. Kontynuować hydrolizę białek lub przechowywać granulki w temperaturze -20 °C przez kilka dni.</li>
</ol>
4. Hydroliza białek
<ol>
	<li>Do każdej próbki dodać 500 μl o stężeniu 9 mol/l HCl. Następnie obetnij nakrętki każdej probówki nożyczkami i umieść je w szklanych probówkach hodowlanych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Ostrożnie, ale szczelnie, zamknij czerwone nakrętki (sprawdzając w ten sposób uszczelnienie). 
	UWAGA: Przed użyciem zawsze sprawdzaj każde uszczelnienie (szara folia PTFE wewnątrz czerwonych zakrętek) pod kątem prawidłowego dokręcenia i regularnie czyść je wodą.</li>
	<li>Po zakończeniu umieścić probówki w zlewce częściowo wypełnionej piaskiem (dla lepszego przenoszenia ciepła) i hydrolizować próbki przez około 16 godzin w temperaturze 110 °C w komorze suszącej.</li>
	<li>Po hydrolizie próbki należy schłodzić (~1 h).</li>
	<li>Następnie liofilizować przez noc za pomocą wirówki o wysokiej próżni (poniżej 100 Pa).</li>
	<li>Rozpuścić granulki - jeśli są całkowicie suche (jeśli nie, kontynuować liofilizację) - w 1 ml HCl o stężeniu 0,1 mol/l i dodać 50 μl chloroformu (CHCl 3) do każdej probówki; dokładnie rozpuść osad za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, mieszając w ten sposób ciecze, a następnie przenieś całą objętość do nowej probówki. 
	UWAGA: Zawsze pracuj z małymi ilościami, aby zminimalizować nadmierne parowanie</li>
	<li>Następnie odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać górną fazę dwufazowej cieczy zawierającej frakcję rozpuszczalną w wodzie (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2B, frakcja o dolnej gęstości) za pomocą pipety i napełnić ją nowymi probówkami. Użyj probówek o pojemności 1,5 ml do ręcznego SPE (sekcja 5.2) lub szklanych fiolek do zrobotyzowanego SPE (sekcja 5.3 i <klasa silna = "xfig" >Rysunek 2D). Unikaj rozlewania CHCl3 i jego zawartości (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
5. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)
<ol>
	<li>Przed pierwszym użyciem należy dwukrotnie oczyścić wkłady SPE 1 ml roztworu zastępczego (krok 1.3), a następnie odwirować przy 800 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (umieścić w probówkach o pojemności 15 ml). Można ich użyć po 10-20 razy.</li>
	<li>Instrukcja obsługi SPE
	<ol>
		<li>Wkłady należy wstępnie kondycjonować (patrz tabela materiałów) w każdym cyklu za pomocą 1 ml czystego metanolu i 2 x 1 ml PBS, za każdym razem po odwirowaniu w sile 800 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (umieścić w probówkach o pojemności 15 ml).</li>
		<li>Następnie załadować próbki (z kroku 4.7) do wkładów SPE i odwirować je przy 600 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Następnie zastosuj cykl prania, jak wspomniano poniżej.
		<ol>
			<li>Dodać trzykrotnie po 1 mlH2O(za każdym razem, a następnie odwirować przez 1 minutę w temperaturze 800 x g w temperaturze pokojowej).</li>
			<li>Dodać pięć razy po 1 ml HCl o stężeniu 0,1 mol/l (za każdym razem, a następnie wirować przez 1 minutę przy 800 x g w temperaturze pokojowej).</li>
			<li>Dodaj dwa razy po 1 ml MeOH (każdy z nich, a następnie odwirować przez 1 minutę w temperaturze 800 x g w temperaturze pokojowej).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Następnie eluować argininę i jej pochodne za pomocą 3 x 1 ml roztworu zastępczego (a następnie odwirować 1 min przy 800 x g w temperaturze pokojowej) do pojedynczej probówki o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Roztwór zastępczy służy jako eluent dla argininy i pochodnych, a także służy do czyszczenia wkładów (wszystkie substancje są wypłukiwane przed elucją, albo przy podstawowej wartości pH roztworu zastępczego). Mimo to, aby uniknąć zanieczyszczenia w miarę upływu czasu, ponowne użycie powinno być ograniczone (patrz krok 5.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrobotyzowany SPE 
	UWAGA: W tym przypadku robot pipetujący (główna część składa się z igły do pipetowania, stacji mycia igły, dozownika odczynnika oraz pozycji dla próbek i eluatów, patrz Tabela materiałów) jest dostarczany z uchwytem na wkłady do kolumn SPE. W przypadku innych instrumentów upewnij się, że jesteś w pełni wyposażony we wszystkie wymienione rzeczy.
	<ol>
		<li>Napełnij supernatant (z kroku 4.7) bezpośrednio do szklanych fiolek z uszczelką z PTFE (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2D), przygotuj wystarczającą ilość odczynników (100 ml każdego, tj. roztwór zastępczy, 99% MeOH, PBS,H2Oi 0,1 mol/L HCl), 5 ml probówek do elucji i roztworu myjącego do igły robota (zwykle H2O).</li>
		<li>Użyj aplikacji lub metody w oprogramowaniu robota opartej dokładnie na krokach opisanych dla ręcznego SPE (krok 5.2). 
		UWAGA: Szczegóły mogą się znacznie różnić w zależności od dostawcy przyrządów, dlatego w celu programowania zapoznaj się z instrukcją oprogramowania danego robota. Robot pipetujący zwykle działa poprzez wywieranie ciśnienia powietrza na wkłady zamiast wirowania, co jest główną różnicą. Jeśli protokół jest ustalany i uruchamiany po raz pierwszy, należy uwzględnić kontrole (np. L-argininę o znanym stężeniu) w celu sprawdzenia optymalnego przepływu pracy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Końcowe przygotowanie do NMR
<ol>
	<li>Liofilizuj próbki przez noc do całkowitego wyschnięcia, aby pozbyć się amoniaku iH2O.</li>
	<li>Rozpuścić każdą próbkę w 500 μl buforu NMR (krok 1.4) i przenieść do probówek NMR. Co ważne, objętość musi być taka sama we wszystkich probówkach, a próbki muszą być jednorodne (wolne od pozostałości i lipidów, które mają tendencję do agregacji). 
	UWAGA: Szczegóły spektroskopii NMR wykraczają poza ten przegląd metody i są opisane bardziej szczegółowo w innym miejscu27. Tutaj wyjaśnione są tylko główne wymagania i kroki. Oznaczanie ilościowe argininy i jej metabolitów przeprowadza się na spektrometrze NMR 600 MHz (patrz tabela materiałów). Zasadniczo można użyć dowolnego innego spektrometru NMR/pola NMR, pod warunkiem, że sygnały NMR argininy i metylowanych arginin mogą być wykrywane z wystarczającą czułością i bez nakładania się sygnałów. Można użyć dowolnej głowicy sondy z gradientami osi z, która jest w stanie zarejestrować 1widmo H, pod warunkiem, że sekwencje impulsów są odpowiednio ustawione.</li>
	<li>Rejestruj widmo 1D za pomocą sekwencji impulsów CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 33,34 (cpmgpr1d, 512 skanów, rozmiar fid 73728, szerokość widmowa 11904.76 Hz na NMR 600 MHz, opóźnienie recyklingu 4 s) z tłumieniem sygnału wodnego przy użyciu presaturacji.</li>
	<li>W tych eksperymentach usuń sprzęgania skalarne 1H poprzez wirtualne rozprzęganie, zmniejszając nakładanie się sygnałów. Zapisz dodatkowe dla konkretnych pytań i/lub złożonych próbek lub matryc, np. 1 widma 1 H-13C-heterojądrowej pojedynczej koherencji kwantowej (HSQC) spectra27. 
	UWAGA: W przypadku bardziej złożonych matryc, w których sygnały 1H NMR metylowanych arginin mogą częściowo pokrywać się z sygnałami 1H NMR innych metabolitów (np. lizyny), wymagane są 1 H homo-jądrowe widma J-resolved (JRES)35.</li>
	<li>Przeprowadzić bezwzględne oznaczanie ilościowe, całkując odpowiednie natężenia pików wzorców o znanym stężeniu, np. 100 μmol/arginina. 
	UWAGA: Rutynowo ADMA, SDMA i MMA (patrz Tabela materiałów) są podawane jako stosunek do argininy. Ma to tę istotną zaletę, że nie trzeba wykonywać oddzielnej normalizacji (np. liczby komórek, masy tkankowej, stężenia białek). W takim przypadku arginina służy jako wzorzec wewnętrzny, a względna kwantyfikacja jest wystarczająca do uzyskania biologicznie istotnych informacji.</li>
	<li>W celu różnicowania SDMA i MMA, należy ponownie liofilizować próbki, aby pozbyć się D2O (jeśli wcześniej zostały ponownie zawieszone w buforze NMR), który jest następnie zastępowany deuterowanym dimetylosulfotlenkiem (d6-DMSO), umożliwiając rozdzielczość rezonansów metylowych27. Dlatego próbki z probówek NMR należy odessać pipetami Pasteura, poddać liofilizacji i rozpuścić w 500 μl d 6-DMSO.</li>
</ol>

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+clinical+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).</li>
<li>Bachand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases%3A+from+unicellular+eukaryotes+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans.</a> Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).</li>
<li>Wang, Y. C., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+protein+arginine+methyltransferases+in+non-mammalian+animal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems.</a> FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).</li>
<li>Ahmad, A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+PRMTs+broaden+the+scope+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).</li>
<li>Fisk, J. C., Read, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in parasitic protozoa.</a> Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).</li>
<li>Hofweber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+FUS+Is+Suppressed+by+Its+Nuclear+Import+Receptor+and+Arginine+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation.</a> Cell. 173 (3), 706-719 (2018).</li>
<li>Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGG%2FRG+Motif+Regions+in+RNA+Binding+and+Phase+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).</li>
<li>Nott, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+of+a+disordered+nuage+protein+generates+environmentally+responsive+membraneless+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.</a> Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).</li>
<li>Fong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+RNA+splicing+catalysis+through+inhibition+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation.</a> Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+arginine+methylation+in+breast+cancer%3A+emerging+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).</li>
<li>Gulla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+5+has+prognostic+relevance+and+is+a+druggable+target+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma.</a> Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomic+evaluation+of+arginine+methylation+and+cardiovascular+risks%3A+potential+mechanisms+beyond+nitric+oxide+synthase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN%2C+the+product+of+the+spinal+muscular+atrophy+gene%2C+binds+preferentially+to+dimethylarginine-containing+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets.</a> Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+arginine+methylation+of+organ+proteins+during+the+development+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+methylarginine+metabolism+in+the+cardiovascular+system+identifies+the+lung+as+a+major+source+of+ADMA%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).</li>
<li>Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+arginine+methylation+to+ADMA%3A+a+novel+mechanism+with+therapeutic+potential+in+chronic+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases.</a> BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).</li>
<li>Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+axis+of+protein+arginine+methylation+and+asymmetric+dimethylarginine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).</li>
<li>Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+pesticide+research+and+development%3A+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives.</a> Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).</li>
<li>Chiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+Is+a+Critical+Regulator+of+Breast+Cancer+Stem+Cell+Function+via+Histone+Methylation+and+FOXP1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression.</a> Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).</li>
<li>Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT7+preserves+satellite+cell+regenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity.</a> Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).</li>
<li>Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+asymmetric+arginine+methylation+during+replicative+and+H2O2-induced+premature+senescence+in+WI-38+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts.</a> Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).</li>
<li>Bhatter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+augments+Sbp1+function+in+translation+repression+and+decapping%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping.</a> FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein arginine methylation.</a> Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).</li>
<li>Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-incorporated+methylated+arginine+reference+values+in+healthy+subjects+whole+blood+and+evaluation+of+factors+affecting+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation.</a> Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).</li>
<li>Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrolysis+method+on+the+determination+of+the+amino+acid+composition+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins.</a> Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).</li>
<li>Davids, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+asymmetric+and+symmetric+dimethylarginine%2C+L-monomethylarginine%2C+L-arginine%2C+and+L-homoarginine+in+biological+samples+using+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).</li>
<li>Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+metabolomics+as+emerging+tool+to+study+autophagy+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation.</a> Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolomics+by+1D+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolomics by 1D NMR.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).</li>
<li>Carr, H. Y., Purcell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diffusion+on+free+precession+in+nuclear+magnetic+resonance+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments.</a> Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).</li>
<li>Stryeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentrations+of+Citrate%2C+Tyrosine%2C+2-+and+3-+Hydroxybutyrate+are+associated+with+increased+3-month+mortality+in+acute+heart+failure+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+landscape+of+metabolic+dysregulation+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing.</a> Biomolecules. 11 (2), (2021).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+human+hepatocellular+tumors+undergo+a+global+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming.</a> Cancers. 13 (8), (2021).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation%3A+Cellular+functions+and+methods+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).</li>
<li>Habisch, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroectodermally+converted+human+mesenchymal+stromal+cells+provide+cytoprotective+effects+on+neural+stem+cells+and+inhibit+their+glial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation.</a> Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).</li>
<li>Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+ultrasensitive+luminescence+assay+for+protein+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).</li>
<li>Hevel, J. M., Price, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+direct+measurement+of+methyltransferase+activity+in+about+30min%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min.</a> Methods. 175, 3-9 (2020).</li>
<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W poniższej sekcji skupiono się przede wszystkim na samej metodzie; biologiczne implikacje metylacji argininy opisano w rozdziale Wprowadzenie.
Po pierwsze, tkanki o różnej sztywności mogą wymagać dostosowania lizy próbki: komórki z hodowli komórkowych (w tym bakterie, drożdże itp.) oraz tkanki takie jak mózg, młoda wątroba, mięśnie gładkie itp., mogą być szybko homogenizowane. W przypadku tkanek o dużej sztywności (w tym wątroby osób starszych, tętnic, kości itp.) homogenizację należy przepro...

W ciągu ostatnich dwóch dekad metylacja reszt argininy została uznana za istotną modyfikację potranslacyjną białek. Wpływa na podstawowe procesy biologiczne, takie jak regulacja transkrypcji, transdukcja sygnału i wiele innych1. Głównymi białkami biorącymi udział w regulacji metylacji argininy są metylotransferazy argininy (PRMT)2. Głównymi pochodnymi argininy są ω-(NG,N G)-asymetryczna dimetyloarginina (ADMA), ω-(NG,N'G)-symetryczna dimetyloarginina (SDMA) i ω-N G-monometyloarginina (MMA)2.
PRMT używają S-adenozylo-l-metioniny do transferu grup metylowych do końcowej grupy guanidynowej (z dwiema równoważnymi grupami aminowymi) argininy związanej z białkiem1. Można wyróżnić dwa główne enzymy: zarówno enzymy typu I, jak i typu II katalizują pierwszy etap metylacji, tworząc MMA (który w ten sposób traci swoją symetrię). Po tym etapie enzymy typu I (np. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) wykorzystują MMA jako substrat do tworzenia ADMA, podczas gdy enzymy typu II (głównie PRMT5 i PRMT9) wytwarzają SDMA. PRMT1 był pierwszym białkiem metylotransferazy argininy wyizolowanym z komórek ssaków3. Mimo to PRMT zostały ewolucyjnie zachowane4 u innych zwierząt, takich jak kręgowce niebędące ssakami, strunowce bezkręgowców, szkarłupnie, stawonogi i nicienie parzydełkowców5, plants6 i pierwotniaków, w tym grzybów, takich jak drożdże7. W wielu przypadkach nokaut jednego z PRMT prowadzi do utraty żywotności, ujawniając istotną rolę metylowanych gatunków argininy zaangażowanych w podstawowe procesy komórkowe, takie jak transkrypcja, translacja, transdukcja sygnału, apoptoza i separacja fazy ciecz-ciecz (co oznacza tworzenie organelli bez błony, np. jąderka), co regularnie obejmuje domeny bogate w argininę8,9,10. To z kolei wpływa na fizjologię i stany chorobowe, w tym raka11,12,13, szpiczak mnogi14, choroby sercowo-naczyniowe15, patogeneza wirusa, rdzeniowy zanik mięśni16, cukrzyca17, and aging1. Uważa się, że podwyższony poziom ADMA w krwiobiegu, np. pochodzący z płuc18 spowodowany rozpadem białek, jest związany z dysfunkcją śródbłonka, przewlekłą chorobą płuc19 i innymi zespołami chorób sercowo-naczyniowych20. Stwierdzono, że nadekspresja PRMT przyspiesza nowotworzenie i wiąże się ze złym rokowaniem21,22. Poza tym ablacja PRMT6 i PRMT7 wyzwala fenotyp starzenia się komórek23. Stwierdzono znaczny spadek ADMA i PRMT1 podczas starzenia się fibroblastów WI-3824.
Wyzwaniem jest zrozumienie, jak metylacja przebiega w procesach (pato)fizjologicznych, jest identyfikacja i ilościowe określenie metylacji argininy białek. Większość obecnych podejść wykorzystuje przeciwciała do wykrywania metylowanych arginin. Jednak przeciwciała te są nadal specyficzne dla kontekstu i mogą nie rozpoznawać różnych motywów białek metylowanych argininy25,26. W opisanym protokole wszystkie wymienione powyżej pochodne argininy można wiarygodnie określić ilościowo za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), tj. pojedynczo, w połączeniu lub, jak w większości przypadków, w złożonych matrycach biologicznych, takich jak komórki eukariotyczne (np. pochodzenia drożdżowego, mysiego lub ludzkiego) i tkanki27, a także serum28. W przypadku białek i tych złożonych matryc, hydroliza białek29 jest warunkiem wstępnym do wytworzenia wolnych (zmodyfikowanych) aminokwasów, takich jak arginina, MMA, SDMA i ADMA. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)30 umożliwia wzbogacenie interesujących związków. Wreszcie, spektroskopia 1H-NMR pozwala na równoległe wykrywanie argininy i wszystkich głównych pochodnych metylowych argininy. Spektroskopia NMR ma tę zaletę, że jest naprawdę ilościowa, wysoce odtwarzalna i solidna technika31,32. Końcowe pomiary NMR można wykonać później, gdy wiele próbek zostało pobranych i przygotowanych. Wreszcie, protokół ten koncentruje się głównie na przygotowaniu próbki, ponieważ nie wymaga to własnego spektrometru NMR. Można go wykonać w większości laboratoriów biochemicznych. Mimo to w tej pracy znajdują się pewne wskazówki dotyczące tego, jakie pomiary spektroskopii NMR należy wykonać.

<table><tbody><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4 (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki z okrągłym dnem</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>roztwór amoniaku 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz NMR, wyposażona w głowicę sondy TXI</td><td>Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, chłodzona, np. 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge; 99% rocznie</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>płyn przenoszący ciepło do systemu SpeedVac</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spoiwo</td><td>do komory suszenia</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane DURAN, 13 x 100 mm, GL 14, 9 ml</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Głęboko próżniowa pompa olejowa RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>część systemu SpeedVac</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml</td> Robot pipetujący <td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-arginina</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Metanol &ge; 99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura wodna Milli-Q Millipore</td><td></td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, wkłady 1 mL</td><td>Wody</td><td></td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ 186000252</td></tr> <tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy Precellys 24</td><td>Bertin Instrumenty</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Probówki Precellys (rurki do roztwarzania)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1,4 mm kulki z tlenku cyrkonu</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap Moduły grzewcze, mieszające i odparowujące</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td></tr><tr><td>Rotor do probówek 1,5 ml, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Chłodniczy pułapka chłodząca</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>część systemu SpeedVac</td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy Savant SpeedVac SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>częścią systemu SpeedVac; wyposażony z rotorem do probówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Zakrętki do szklanych fiolek z uszczelką z PTFE, DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane z krótkim gwintem 1,5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatografia</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (oprogramowanie)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-asymetryczna dimetyloarginina (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monometyloarginina (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-symetryczna dimetyloarginina (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Arginina związana z białkiem jest powszechnie metylowana w wielu białkach i reguluje ich funkcję, zmieniając właściwości fizykochemiczne, ich interakcję z innymi cząsteczkami, w tym z innymi białkami lub kwasami nukleinowymi. W niniejszej pracy przedstawiono łatwy do wdrożenia protokół ilościowego oznaczania argininy i jej pochodnych, w tym ametyloargininy i symetrii (odpowiednio ADMA i SDMA) oraz monometyloargininy (MMA). Po wyizolowaniu białek z biologicznych płynów ustrojowych, tkanek lub lizatów komórkowych opisano prostą metodę homogenizacji, wytrącania białek i hydrolizy białek. Ponieważ hydrolizaty zawierają wiele innych składników, takich jak inne aminokwasy, lipidy i kwasy nukleinowe, niezbędny jest etap oczyszczania za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). SPE można wykonać ręcznie za pomocą wirówek lub robota pipetującego. Czułość dla ADMA przy użyciu obecnego protokołu wynosi około 100 nmol/L. Górna granica wykrywalności argininy wynosi 3 mmol/L ze względu na nasycenie SPE. Podsumowując, protokół ten opisuje solidną metodę, która rozciąga się od przygotowania próbki biologicznej do wykrywania opartego na NMR, dostarczając cennych wskazówek i pułapek dla udanej pracy podczas badania metylomu argininy.

W naszym laboratorium rutynowo wykorzystuje się projekcje 1D widm 1H uzyskane z dwuwymiarowych widm NMR J-resolved (JRES) z wirtualnym rozprzężeniem do przypisywania sygnałów i ilościowego oznaczenia analitów36. Na rysunku 3 przedstawiono reprezentatywne widma JRES hydrolizatów białek drożdżowych oczyszczonych przy użyciu opisanego protokołu SPE. Mimo bardzo dużych różnic w stężeniach, obie substancje mogą zostać rozdzielone i ilościowo oznaczone w matrycy ...

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie i ilościowy pomiar wolnych i związanych z białkami argininy i metylo-arginin za pomocą spektroskopii 1H-NMR.

Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Protokół ten umożliwia ilościowe określenie poziomów i dynamiki metylacji argininy. Modyfikacja ta odgrywa ważną rolę regulacyjną i może służyć jako biomarker choroby. Zaletą tej metody jest to, że zapewnia prosty przepływ pracy dla niemal nieograniczonej liczby matryc, począwszy od komórek, pożywek, a skończywszy na tkankach i płynach biologicznych.Metylacja argininy jest podwyższona w wielu nowotworach u ludzi, a pierwsze inhibitory transferaz metodą argininy są testowane w badaniach klinicznych. Metoda ta może pomóc w stratyfikacji pacjentów i ocenie ryzyka. Procedurę zademonstruje Hansjorg Habisch, technik badawczy z mojego laboratorium.W przypadku próbek płynnych dodać 400 mikrolitrów lodowatego metanolu do 200 mikrolitrów próbki, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odwirować tę próbkę w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przesuń supernatant i zbierz osad w probówkach o pojemności 1,5 mililitra.W przypadku materiałów stałych dodaj 600 mikrolitrów 66% wody metanolowej do probówek do roztwarzania zawierających od 30 do 60 miligramów granulek tkanek lub komórek. Homogenizuj tkankę miękką jeden

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Metylacja argininy białek, katalizowana przez klasę enzymów, tj. metylotransferazy białkowe argininy (PRMT), to proces enzymatycznego dodawania grup metylowych do arginin w białkach. Test metylacji in vitro jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do oceny stanu metylacji znanych lub nowych substratów PRMT.

Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy

Tablice peptydowe syntetyzowane metodą SPOT mogą być używane do analizy specyficzności substratowej metylotransferaz lizynowych białek (PKMT) oraz do zdefiniowania spektrum substratów PKMT, aby zrozumieć ich biologiczną rolę. Protokół ten opisuje, jak syntetyzować macierze peptydowe, metylować je za pomocą PKMT i analizować wyniki.

Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C

Poznaj metodę ilościowego oznaczania metylacji argininy za pomocą spektroskopii NMR w próbkach biologicznych. Protokół umożliwia analizę komórek, tkanek i płynów ustrojowych z zastosowaniem w badaniach nad rakiem.

Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Przeglądaj więcej filmów