Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Protokół ten umożliwia ilościowe określenie poziomów i dynamiki metylacji argininy. Modyfikacja ta odgrywa ważną rolę regulacyjną i może służyć jako biomarker choroby. Zaletą tej metody jest to, że zapewnia prosty przepływ pracy dla niemal nieograniczonej liczby matryc, począwszy od komórek, pożywek, a skończywszy na tkankach i płynach biologicznych.

Metylacja argininy jest podwyższona w wielu nowotworach u ludzi, a pierwsze inhibitory transferaz metodą argininy są testowane w badaniach klinicznych. Metoda ta może pomóc w stratyfikacji pacjentów i ocenie ryzyka. Procedurę zademonstruje Hansjorg Habisch, technik badawczy z mojego laboratorium.

W przypadku próbek płynnych dodać 400 mikrolitrów lodowatego metanolu do 200 mikrolitrów próbki, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odwirować tę próbkę w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przesuń supernatant i zbierz osad w probówkach o pojemności 1,5 mililitra.

W przypadku materiałów stałych dodaj 600 mikrolitrów 66% wody metanolowej do probówek do roztwarzania zawierających od 30 do 60 miligramów granulek tkanek lub komórek. Homogenizuj tkankę miękką jeden raz przez 20 sekund, a sztywną tkankę dwa razy przez 20 sekund w odstępie pięciu minut między nimi. Natychmiast umieść próbkę na lodzie i przenieś cały lizat do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie rozpocznij inkubację.

Następnie odwirować próbkę o stężeniu 10 000 G przez 30 minut. W czterech stopniach Celsjusza wybierz supernatant w 1,5-mililitrowych probówkach i przystąp do hydrolizy białek przy użyciu tego supernatantu. Zetnij nakrętki każdej tuby.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów dziewięciomolowego kwasu solnego do każdej próbki. Na koniec włóż probówki do szklanych rurek. Zamknij je szczelnie nakrętkami, zapewniając prawidłowe uszczelnienie, i umieść te probówki w szklanej zlewce częściowo wypełnionej piaskiem.

Hydrolizować próbki przez 16 godzin w temperaturze 110 stopni Celsjusza w komorze suszącej. Schłodzić próbki i liofilizować je przez noc za pomocą wirówki wysokopróżniowej. Następnego dnia rozpuść całkowicie wysuszone granulki w jednym mililitrze 0,1 molowego kwasu solnego.

Dodaj 50 mikrolitrów chloroformu do każdej probówki i dokładnie rozpuść osad za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Przenieść całą objętość do nowej probówki i odwirować próbki przez 10 minut. Ostrożnie zebrać górną fazę dwufazowej cieczy do nowej probówki.

Używaj plastikowych probówek do ręcznej lub szklanych probówek do zrobotyzowanej ekstrakcji do fazy stałej. W przypadku ręcznej ekstrakcji do fazy stałej należy wstępnie przygotować wkłady w każdym cyklu, a następnie odwirować przez jedną minutę. Następnie załadować próbkę do wkładów SPE i odwirować je przy 600 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Umyj wkłady jednym mililitrem wody trzy razy, przy każdym przemyciu, a następnie odwiruj przez jedną minutę. Następnie przemyć pięć razy jednym mililitrem 0,1-molowego kwasu solnego, a następnie odwirować przez jedną minutę w 800 G w temperaturze pokojowej. Umyj wkłady dwukrotnie jednym mililitrem metanolu, a następnie odwiruj przez jedną minutę.

Elutę argininę i jej pochodne do pojedynczej 15-mililitrowej probówki, dodając jeden mililitr roztworu zastępczego trzech X i odwirować dwukrotnie przez jedną minutę. W przypadku zrobotyzowanej ekstrakcji do fazy stałej należy umieścić probówki do zbierania eluatów i szklane probówki zawierające górną fazę dwufazowej cieczy w odpowiedniej pozycji robota. Użyj aplikacji lub metody w oprogramowaniu w oparciu o kroki opisane dla ręcznej SPE.

Liofilizuj próbki przez noc do całkowitego wyschnięcia, aby pozbyć się amoniaku i wody. Każdą próbkę rozpuścić w 500 mikrolitrach buforu NMR, aż stanie się jednorodna. Następnie przenieś równą ilość jednorodnej próbki do każdej probówki NMR.

Widma J-RES hydrolizatów białek drożdży oczyszczonych przy użyciu protokołu SPE przedstawiono tutaj. Różne charakterystyczne zmiany chemiczne mogą rozróżniać L-argininę i ADMA na poziomie 3,25 i 3,02 części na milion. Obie substancje można rozdzielić i określić ilościowo w macierzy komórkowej.

W oparciu o liczbę protonów określonej grupy metylowej lub metylenowej przy odpowiednim przesunięciu chemicznym, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego H umożliwia precyzyjne określenie ilościowe. Korzystając z tego podejścia, przesunięcia chemiczne SDMA i MMA w wyniku magnetycznego rezonansu jądrowego o jedną godzinę można rozdzielić i określić ilościowo za pomocą charakterystycznych przesunięć chemicznych przy 2,76 części na milion SDMA i 2,74 części na milion MMA. Wykonując ten protokół, ostrożnie zbierz górną fazę dwufazowej cieczy zawierającej frakcję rozpuszczalną w wodzie za pomocą pipety i przenieś ją do nowych probówek.

Użyj rurki o pojemności 1,5 mililitra do ręcznego SPE lub szkła klasy do zrobotyzowanego SPE. Unikaj rozlewania chloroformu i jego zawartości. Eluaty zawierające argininę i metylowane formy argininy analizuje się za pomocą spektroskopii NMR.

Daje to bezwzględne ilości tych gatunków. Nasza technologia jest obecnie wykorzystywana w wielu podstawowych projektach badawczych mających na celu zbadanie patofizjologicznej roli metylacji argininy. Ponadto oceniamy metylację argininy białek jako kandydata na biomarker w kilku chorobach człowieka.