Name: Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj metodę badania parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt5a w komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach myszy. Protokół umożliwia funkcjonalne i molekularne oceny w tym samym typie komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez nagrody NIH F30HL154324 dla O.T. i K08HL121191 oraz R03HL154301 dla S.R.K. Autorzy pragną potwierdzić, że schemat na rysunku 1 w tym manuskrypcie został stworzony przy użyciu biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt / płaskiej polaryzacji komórek (PCP) jest krytycznie ważnym szlakiem sygnalizacji komórkowej, który jest zaangażowany w wiele procesów rozwojowych24,25 i chorobowych24,26. Podczas rozwoju embrionalnego niekanoniczna sygnalizacja Wnt obejmuje ekspansywną sieć sygnałów molekularnych z komórek wysyłających sygnały, które ostatecznie indukują zmiany w morfologii, asy...

Niekanoniczne sygnalizacja Wnt to ewolucyjnie zachowany szlak, który reguluje organizację włókien komórkowych i migrację kierunkową. Szlak ten jest zaangażowany w wiele procesów biologicznych, w tym w morfogenezę tkanek embrionalnych1,2,3, angiogeneza limfatyczna i naczyniowa4,5,6,7, oraz wzrost i przerzuty raka8,9,10. Na poziomie komórkowym niekanoniczna sygnalizacja Wnt odbywa się poprzez skoordynowane interakcje parakrynne między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnał. Interakcje te często zachodzą między komórkami o różnych liniach lub typach i obejmują zróżnicowaną sieć molekularną, która obejmuje do 19 ligandów i wiele receptorów, koreceptorów i efektorów transdukcji sygnału11. Dalsze komplikowanie tego procesu sygnalizacji przez wcześniejsze badania wykazały, że kombinacje ligand-receptor mogą się różnić w sposób zależny od kontekstu i tkanki12,13, i że te same ligandy źródłowe, które napędzają niekanoniczną sygnalizację Wnt w komórkach odbierających sygnał, mogą być wytwarzane przez wiele typów komórek wysyłających sygnały14,15. Biorąc pod uwagę złożoność komórkową i molekularną związaną z niekanoniczną sygnalizacją Wnt, możliwość badania indywidualnych i klinicznie istotnych mechanizmów in vivo była ograniczona.
Podjęto próby zbadania niekanonicznej sygnalizacji Wnt za pomocą technik hodowli komórkowych in vitro. Na przykład testy gojenia się ran przeprowadzone w monowarstwach komórkowych zostały wykorzystane do funkcjonalnej oceny kierunkowej migracji komórkowej4,16,17,18,19. Techniki barwienia immunologicznego zostały wykorzystane do przeprowadzenia analiz przestrzennych ekspresji białek powierzchniowych w celu oceny niekanonicznych zmian w morfologii komórek wywołanych przez Wnt7,10, architektura i polaryzacja asymetryczna18,19,20. Chociaż podejścia te dostarczyły ważnych narzędzi do charakteryzowania fenotypów związanych z Wnt w komórkach odbierających sygnał, brak komponentów wysyłających sygnał w tych protokołach ogranicza ich zdolność do dokładnego modelowania parakrynnych mechanizmów sygnalizacyjnych obserwowanych in vivo. W związku z tym nadal istnieje pilna potrzeba opracowania systemów in vitro, które umożliwią solidną i odtwarzalną ocenę parakrynnych interakcji sygnalizacyjnych między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały niekanonicznego szlaku Wnt, w szczególności komórkami o różnych typach komórek.
W tym celu, głównym celem tego badania było ustalenie protokołu do modelowania parakrynnych niekanonicznych interakcji sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Opracowaliśmy bezkontaktowy system kokultury, który podsumowuje komponenty wysyłania i odbierania sygnałów tych interakcji i umożliwia zastosowanie standardowych podejść molekularnych, genetycznych lub farmakologicznych do niezależnego badania specyficznych mechanizmów ligand-receptor w niekanonicznym szlaku Wnt. Mechanizmy sygnalizacji Wnt za pośrednictwem NCC zbadano w mioblastach przy użyciu ustalonych linii komórek mysich. Jako dowód zasadności, model ten został wykorzystany do potwierdzenia wyników wcześniejszych badań in vivo na myszach, które implikują oś Wnt5a-ROR2 jako istotny niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt między NCCs21 i przodkami kardiomioblastów SHF3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Przechowywana w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>C2C12 mysia linia komórkowa mioblastów</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4-dołkowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy (4,5 g/L), L-glutamina (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A Przepuszczalne</td><td></td></tr><tr><td>podłoże Falcon do płytki 24-dołkowej z 0,4 i mikro; Przezroczysta membrana PET M</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Przechowywana w 50 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny, 0,1%</td> <td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Miarowe i sterylne końcówki do pipet, 10 i mikro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę (LIF), 106 jednostek/ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierające szkiełka nakrywkowe z automatycznym szkłem, 24 x 55 mm</td><td></td> Linia komórkowa <td>grzebienia nerwowego Springside Scientific</td> HRTCG2455 <td></td></tr><tr><td>O9-1</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd roztwór w PBS, 4%</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 j./ml penicyliny i 10 000 μ; g/ml streptomycyny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Przechowywany w 10 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &; C, Przechowywać z dala od światła</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS), 1x, bez wapnia i magnezu, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-zasadowy (rhFGF-zasadowy)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko ludzkie / mysie Wnt5a</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego z siatką</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO mysie komórki zasilające fibroblasty</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25%</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Zeiss Apotome.2 Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop świetlny Zeiss Axio Vert.A1</td> Oprogramowanie mikroskopowe <td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td> <td>Carl Zeiss AG</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji wnt in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Niekanoniczna sygnalizacja Wnt reguluje wewnątrzkomórkową organizację włókien aktynowych i spolaryzowaną migrację komórek progenitorowych podczas embriogenezy. Proces ten wymaga złożonych i skoordynowanych oddziaływań parakrynnych między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały. Biorąc pod uwagę, że te interakcje mogą zachodzić między różnymi typami komórek z różnych linii, ocena in vivo defektów specyficznych dla komórek może być wyzwaniem. W niniejszym badaniu opisano wysoce powtarzalną metodę oceny parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro. Protokół ten został zaprojektowany z myślą o (1) przeprowadzaniu funkcjonalnych i molekularnych ocen niekanonicznej sygnalizacji Wnt między dowolnymi dwoma typami komórek będących przedmiotem zainteresowania; (2) przeanalizować rolę cząsteczek wysyłających i odbierających sygnał w niekanonicznym szlaku sygnałowym Wnt; oraz (3) przeprowadzać fenotypowe eksperymenty ratunkowe przy użyciu standardowych podejść molekularnych lub farmakologicznych.
Ten protokół został użyty do oceny niekanonicznej sygnalizacji Wnt w mioblastach, w której pośredniczy komórka grzebienia nerwowego (NCC). Obecność NCC wiąże się ze zwiększoną liczbą cytoplazmatycznych filopodiów i lamellipodiów z dodatnim wynikiem falloidyny w mioblastach oraz poprawą migracji mioblastów w teście gojenia się ran. Oś Wnt5a-ROR2 została zidentyfikowana jako kluczowy niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt między NCC a progenitorami kardiomioblastów drugiego pola serca (SHF). Podsumowując, jest to wysoce wykonalny protokół do badania parakrynnych niekanonicznych mechanizmów sygnalizacji Wnt in vitro.

Wpływ NCC na zdolność migracyjną mioblastów mysich 
Metodę tę zastosowano po raz pierwszy w celu oceny wpływu NCC na zdolność migracyjną mioblastów. Rysunek 1 przedstawia schematyczny model testu. Aby zbadać ten wpływ, przeprowadzono testy gojenia ran (scratch assays) z użyciem mioblastów hodowanych w izolacji (bez wstawek z NCC) w porównaniu do mioblastów hodowanych w obecności wstawek. Jako kontrolę pozytywną do dołków komory z wstawkami z NCC dodano 500 ng/mL rekombino...

Niniejsze badanie przedstawia wysoce powtarzalną i wykonalną metodę badania parakrynnych niekanonicznych zdarzeń sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Protokół ten zastosowano do oceny wpływu parakrynnej sygnalizacji Wnt5a w mysich komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach.

Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Protokół ten przedstawia wysoce powtarzalną metodę funkcjonalnej i molekularnej oceny parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt w dowolnej populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Oceny funkcjonalne i molekularne są przeprowadzane w tej samej populacji komórek i mogą być stosowane do badania dowolnego składnika szlaku Wnt/PCP. Na początek ponownie zawieś wcześniej granulowane ogniwo C2C12 w 10 mililitrach pożywki C2C12.Aby rozcieńczyć komórki w stosunku 1:20, dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej 9,5 mililitra świeżej pożywki C2C12 i delikatnie wymieszać pipetą serologiczną za pomocą pipety P1000, dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej studzienki nowej studzienki czterokomorowej i umieścić ją w inkubatorze. W przypadku powlekania wkładek komórek O9-1 należy ponownie zawiesić osad ogniw O9-1 w 10 mililitrach pożywki wzrostowej O9-1. I podobnie jak w przypadku rozcieńczenia komórek C2C12, rozcieńczyć komórki O9-1 w stosunku 1:20.Następnie umieść pojedynczą przepuszczalną wkładkę w każdej studzience nowej czterokomorowej studzienki wypełnionej jednym mililitrem pożywki wzrostowej O9-1. Dodać 300 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek O9-1 do każdej wkładki i upewnić się, że wkładka jest całkowicie zanurzona. Następnie inkubuj studnię w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby przeprowadzić knockdown siRNA w komórkach O9-1, należy rozcieńczyć siRNA i odczynnik do transfekcji w zredukowanej pożywce surowicy zgodnie z zaleceniami producenta w pożądanych stężeniach. Delikatnie wymieszać rozcieńczone siRNA i odczynnik do transfekcji i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez siedem minut. Po 18 do 24 godzinach posiewu komórek dodaj kompleksy lipidowe siRNA do wstawień komórek O9-1 i inkubuj przez około 34 do 48 godzin.Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, dobrze usuń pożywkę z komory C2C12 i umyj komórki raz PBS. Po wyjęciu PBS rozpocznij drapanie komórek, przesuwając sterylną końcówkę pipety P10 mocno w jednym kierunku, aby objąć całą długość lub szerokość monowarstwy komórki. Po zarysowaniu komórek szybko dodaj jeden mililitr PBS.Następnie włącz komputer i mikroskop. Umieść szkiełko komory na stoliku i obróć tarczę obiektywu do 5-krotnego powiększenia. Otwórz oprogramowanie do obrazowania.Kliknij kartę kamery, a następnie kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić wizualizację komórek na karcie AxioCam IC. Upewnij się, że filtr światła jest całkowicie wysunięty, aby światło mogło przejść do kamery i ekranu komputera, ręcznie przesuń lub obróć suwak komory, aby ustawić obszar rany na środku obrazu na żywo na karcie AxioCam IC. Aby zrobić zdjęcia, kliknij przycisk snap, aby otworzyć nową kartę obok karty AxioCam IC, która zawiera obraz.Aby zapisać ten nieruchomy obraz, kliknij plik, wybierz Zapisz jako, wybierz pulpit na pasku po lewej stronie, aby zapisać plik na pulpicie, wprowadź nazwę pliku w polu nazwy pliku i zapisz rysunek w formacie pliku czi. Aby zapisać obraz jako plik tiff, kliknij plik, wybierz Zapisz jako, wprowadź nazwę pliku w polu nazwy pliku. Kliknij przycisk Zapisz jako typ i wybierz tiff z menu rozwijanego.Ręcznie zmień położenie szkiełka komory, aby wykonać dwa lub trzy dodatkowe obrazy w innych punktach rany w tym samym dołku. Po zobrazowaniu usuń PBS z każdej studzienki i dodaj jeden mililitr pożywki C2C12. Zmontuj system kohodowli wkładek studzienkowych, ręcznie umieszczając wkładki zawierające komórki O9-1 w każdym dołku studzienki komory.Delikatnie wepchnij wkładki w dół do studzienki, tak aby dno wkładki znajdowało się tuż nad leżącymi poniżej komórkami C2C12. Umieść konstrukty wkładek studzienkowych z powrotem do inkubatora i pozwól komórkom migrować przez łącznie dziewięć do 12 godzin. Aby określić optymalny czas migracji, należy sprawdzić komórki po sześciu godzinach od utworzenia rany, a następnie co dwie do trzech godzin.Zakończ eksperyment, gdy komórki w warunkach kontrolnych całkowicie zakryją ranę. Rozpocznij zakończenie testu migracji i dekonstrukcję systemu studzienki, usuwając wstawki komórek O9-1 po dziewięciu do 12 godzinach okresu migracji. Ostrożnie odessać pożywkę C2C12.Dodaj 0,5 mililitra PBS do studzienek komory i wykonaj końcowe zdjęcia komórek po migracji. Ostrożnie zassać cały PBS zmieszany z pożywką i wyjąć plastikowe komory z dołków komory, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu. Pozostawienie leżącego poniżej slajdu zawierającego komórki C2C12.W celu barwienia immunologicznego należy natychmiast inkubować szkiełko z 4% aldehydem paraform przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń paraformaldehyd i myj szkiełko 0,1% Triton X-100 zawierającym PBST przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach wylej PBST i umyj szkiełko dwukrotnie PBS przez 10 minut każde.Następnie utwórz hydrofobową granicę za pomocą hydrofobowego pisaka wokół szkiełka, aby zapobiec rozlewaniu się roztworów ze szkiełka, zapobiegając zakłóceniu przylegających komórek. Następnie dodaj około 0,5 mililitra 1% roztworu blokującego BSA do szkiełka w granicach hydrofobowości i inkubuj szkiełko przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze szkiełka. Pod koniec inkubacji usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało falloidyny do tego szkiełka w granicach hydrofobowych i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia umieść szkiełko w uchwycie na szkiełka zabezpieczonym przed światłem. Umyj komórki trzykrotnie PBS przez 10 minut każda w temperaturze pokojowej. Dodać podłoże montażowe zawierające DAPI, zamontować szkiełka ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi i uchwycić komórki za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego.W niniejszym badaniu dodanie rekombinowanego Wnt5a do studzienek kokulturowych przyspieszyło migrację mioblastów z całkowitym odbudem niektórych obszarów o dziewięć godzin. Mioblasty wędrowne we wszystkich trzech warunkach wykazywały normalną morfologię komórek wędrownych, w tym dobrze uformowane i wystające filopodia i lamellipodia oraz asymetryczną polaryzację wypustek cytoszkieletu aktyny. Badano parakrynny wpływ Wnt5a pochodzącego z NCC na migrację mioblastów.Leczenie 50 nanomolowym siRNA przeciwko Wnt5a zmniejszyło ekspresję genu Wnt5a o 64% w porównaniu z kontrolą negatywną. Migracja wybuchów C2C12 mil ze znacznie zmniejszoną po knockdownie Wnt5a w NCC i dodaniu egzogennego rekombinowanego Wnt5a uratowała ten deficyt migracyjny i defekt morfologiczny w tych mioblastach. W celu lepszego zrozumienia mechanizmów odbierania sygnałów komórkowych w modelu parakrynnym, receptor ROR2 został powalony, a ekspresja genów zmniejszona o 54%Knockdown ROR2 w mioblastach zmniejsza ich zdolność migracyjną pomimo obecności NCC.Egzogenny rekombinowany Wnt5a nie zdołał uratować migracji mioblastów po knocku ROR2, co sugeruje, że wyczerpanie ROR2 zakłóca zdolność mioblastów do odbierania sygnałów Wnt5a. Hoduj komórki do odpowiedniej gęstości, zarysuj końcówką P10 tylko raz, złóż i rozmontuj system kohodowli z ostrożnością, nie naruszając leżącej pod spodem komórki. Technika ta została wykorzystana jako dowód słuszności koncepcji w celu zbadania specyficznej molekularnej osi sygnalizacyjnej w złożonym szlaku Wnt/PCP, co ma znaczenie dla biologii komórek grzebienia nerwowego i drugiego pola serca.

modeling-paracrine-noncanonical-wnt-signaling-in-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje bezkontaktowy test gojenia ran w kokulturze, aby ocenić zdolność migracyjną mysich mioblastów. Pomaga to zrozumieć komponenty wysyłania i odbierania sygnałów parakrynnych niekanonicznych interakcji sygnalizacyjnych Wnt in vitro.

Test ran w celu oceny zdolności migracyjnej mysich mioblastów w kokulturze

Test tworzenia miękkiego kolonii agaru jest metodą używaną do potwierdzania wzrostu in vitro niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Celem tego protokołu jest zilustrowanie rygorystycznej metody wykrywania potencjału rakotwórczego transformowanych komórek oraz supresyjnego wpływu białek na transformowane komórki.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Ten artykuł wideo pokazuje zastosowanie modelu zwojów korzenia grzbietowego (DRG)/komórek rakowych w gruczolakoraku przewodowym trzustki.

In vitro Modelowanie nowotworowej inwazji neuronalnej: model zwoju korzenia grzbietowego

Użycie myszy reporterowych w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca i sekcji, mikroskopią i testami in vivo ułatwia analizę mechanizmów leżących u podstaw normalnego wzorca dróg oddechowych. Tutaj opisujemy, w jaki sposób techniki te przyczyniły się do analizy sygnalizacji Wnt podczas rozwoju tchawicy.

Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Poznaj metodę badania parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt5a w komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach myszy. Protokół umożliwia funkcjonalne i molekularne oceny w tym samym typie komórek.

Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro

Przeglądaj więcej filmów